Стандартный метод стерилизации высок объём Arabidopsis семян

Резюме

Целью данного исследования было определить последствия отбеливателя и хлора газовой стерилизации на прорастание семян генотипов диапазон Arabidopsis, выращенных на стерильную СМИ. Оптимизированный стерилизации протоколы были разработаны для предотвращения роста микробных загрязнителей обеспечивая выживание удовлетворительного семян.

Аннотация

Резуховидка Таля Саженцы (арабидопсиса) часто нужно выращивать на стерильную СМИ. Это требует предварительного семян стерилизации для предотвращения роста микробиологических загрязнений на поверхности семян. В настоящее время Arabidopsis семена стерилизуются, с использованием двух различных стерилизации методов в условиях, которые отличаются между лабораториями и не были стандартизированы, часто приводит только частично эффективной стерилизации или чрезмерного семян смертности. Большинство из этих методов, также не легко масштабируемая большое количество линий семян различных генотипов. Технологии для высокой пропускной способности анализа Arabidopsis продолжают размножаться, стандартизированные методы стерилизации большого количества семян различных генотипов становятся существенно важное значение для проведения этих видов экспериментов. Ответ количество линий Arabidopsis на двух разных стерилизации методов оценивалась, основанные на всхожесть семян и уровня загрязнения семян с микробы и другие патогены. Лечение включает разные концентрации стерилизации агентов и время воздействия, объединены, чтобы определить оптимальные условия для выращивания арабидопсиса семян стерилизации. Оптимизированный протоколы были разработаны для двух разных стерилизации методы: bleach (жидкой фазы) и хлора (Cl₂) газ (пара фаза), оба приводит к высокой семенной всхожесть цены и минимальный микробной контаминации. Полезность этих протоколов была проиллюстрирована тестирование дикого типа и мутантов семена с диапазоном всхожесть потенциалов. Наши результаты показывают, что семена можно эффективно стерилизовать с помощью либо метода без чрезмерного семян смертности, несмотря на пагубные последствия стерилизации были замечены на семена с ниже, чем потенциал для оптимального прорастания. Кроме того была разработана уравнение для включения исследователей применить условия стерилизации газом стандартизированных хлора в герметичные контейнеры различных размеров. Протоколы, описанные здесь позволяют простой, эффективной и недорогой семян стерилизации для большого числа линий арабидопсиса.

Введение

Резуховидка Таля (Арабидопсиса) является основной модельный организм для фундаментальных и прикладных исследований в завод биологии^1,2,3. Хотя стандартные условия для выращивания арабидопсиса роста были хорошо установленных⁴, эффект стерилизации семян на жизнеспособности семян не были протестированы тщательно. Твердые СМИ в пластин или коробки обычно используется для облегчения роста Arabidopsis саженцев для многих экспериментальных приложений, таких как идентификация гомозиготных смертоносных мутантов в разделению населения, наблюдения за стрелять и корень фенотипы в начале этапы, изоляции патогеном бесплатно ткани, сбор большого количества Рассада ткани, выбор трансформантов или лекарственно-растений и оценки всхожести^1,2,3,4 . Семена собирают из растений, выращенных в парник или рост палата иногда заражены с микроорганизмами и пыли. Рост Arabidopsis саженцев на различных типах стерильных СМИ требует предварительного семян стерилизации для удаления микробного загрязнения, такие как грибки и бактерии, присутствующие на поверхности семян. Использование режима стерилизации эффективной семян имеет решающее значение для баланса высокой всхожести, минимальное загрязнение и роста энергичные растений.

Два наиболее распространенных методов, используемых для стерилизации семян Arabidopsis основаны на коммерческие дезинфицирующие средства (жидкой фазы) и хлора (пара фаза). Различные процедуры использовались для обоих жидкой фазы стерилизации^{1,4,5,6,,78,9 , 10} и паровой фазы стерилизации Arabidopsis семена^{8,10,11,12,13,14,15 ,16}. Однако хотя эти процедуры были эффективным в выполнении стерилизации семян используемых генотипов, подробный анализ влияния различных стерилизации лечения на семена различных генотипов не сообщалось. Таким образом для определения условий, в которых эффективной стерилизации сочетается с высоким всхожесть требуется оптимизация этих процедур стерилизации.

Арабидопсис биологических центр ресурсов (ABRC) имеет уникальную) проверить жизнеспособность семян целого ряда различных генотипов в коллекции и b) воспользуйтесь процедур контроля качества, применения внутри страны и в ответ на отзывы пользователей о прорастания семян. Эксперименты, представленные здесь заключаются для определения влияния различных методов стерилизации на прорастание семян диапазон Arabidopsis генотипов. Оптимизированный стерилизацию, которые приводят к высокой семенной всхожесть ставок при сохранении минимальный возбудителя загрязнения представлены для отбеливателя и хлора газовой стерилизации.

протокол

1. Подготовка 1 x фотосинтетическую и Скуг (МС) средний

1. g добавить 4,31 MS базальной смесь соли, 10 г сахарозы и 0,5 г 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic кислоты (MES) в стакан, содержащие 0,8 Л дистиллированной воды и перемешайте, чтобы растворить. Проверка и регулировка рН до 5,7, используя 1 M гидроксид калия (KOH). Добавьте дистиллированной воды, чтобы сделать 1 л
2. Делят СМИ на две бутылки 1 Л, 500 мл. Добавьте 5 g агар в каждой бутылке. Держите крышку сыпучих.
3. Автоклав для 20 минут при температуре 121 ° C, 15 psi с магнитной перемешать бар в бутылке.
4. После автоклавирования, поместите бутылки на плите переполох на низкой скорости и позволить MS среднего остыть до 45-50 ° C (до тех пор, пока бутылки могут быть проведены с голыми руками).
5. Начиная с этого шага, выполните все шаги в стерильных условиях в Ламинарный шкаф. Добавьте 500 мкл Gamborg ' s витамин решение каждой бутылки и перемешать MS среднего равномерно распределить раствор витамина.
6. Налить достаточно СМИ в плиты для покрытия примерно половины глубины пластину.
7. Позволяют пластины остыть при комнатной температуре около 1 h разрешить агар затвердеть.
   Примечание: Если плиты не должны использоваться сразу же, оберните их в пластик и хранить при 4 ° C (температура холодильник). Покрыты пластины, коробки или трубы с затвердевшей агар могут храниться в течение нескольких недель при температуре 4 ° C в герметичном контейнере.

2. Стерилизация Arabidopsis семян с хлоркой

1. подготовить MS пластины в соответствии со статьей 1 протокола. Автоклав 100 мл дистиллированной воды, в то же время как MS Media. Использовать это позже как промывочной воды и помочь приостановить семена для помощи в обшивке.
   Примечание: При желании, 0,8% агар смесь (w/v) (например, phytagar) также может быть газобетона в этом шаге. Агар смесь может быть заменен на дистиллированной воды во время покрытия (шаг 2.5.3.). Дополнительных вязкости смеси агар облегчает пространство семена на пластины или завод в строках при необходимости.
2. Подготовка 50% (v/v) отбеливателем решения, которые будут использоваться для стерилизации семян. Для разбавленных отбеливатель, добавьте 100 мл отбеливателя 100 мл дистиллированной воды. 50 мкл анимации 20 моющего средства в раствор отбеливателя.
   Примечание: Подготовленные отбеливатель решение может храниться до месяца, пока он открыт только в стерильных условиях.
3. Аликвота 100 семян в 1,5 мл трубку microcentrifuge.
4. Стерилизовать семена, используя раствор отбеливателя 50%.
   1. В Ламинарный шкаф, добавить 500 мкл раствора 50% отбеливатель пробки microcentrifuge, содержащих семена. Нажмите в нижней части трубки приостановить семена в растворе отбеливателя.
      Примечание: в качестве альтернативы, ротатор или платформы шейкер может использоваться держать семена приостановлено.
5. Смыть раствор отбеливателя из трубки.
   1. После 10 минут, удалить раствор отбеливателя из с помощью пипетки или Аспиратор с кончика пипетки на конце трубки microcentrifuge.
   2. Добавить 500 мкл стерильной дистиллированной воды в трубе. Закройте трубку и инвертировать смешивать. Разрешить семена поселиться в нижней части трубки. После того как семена поселились в нижней части трубки тщательно удалите раствор отбеливателя, закупорить. Повторите эту процедуру промывки процесс 6 раз.
   3. Добавить 1 мл газобетона дистиллированной воды в трубе приостановить семена.
6. Пластины стерилизованные семена на пластины MS.
   1. В Ламинарный шкаф, метки в нижней части пластины MS с названием запасов и текущую дату.
   2. Залить семена из пробки microcentrifuge на пластину для MS. Распространение семян вокруг пластину MS, стерильный, однократного использования пересевать цикла или кончик стерильной пипеткой.
      Примечание: Если Семена посеяны в строках, пипетки с наконечником 200 мкл может использоваться для индивидуально поместите семена в желаемой позиции. Чтобы улучшить поток семян, в конце кончика пипетки могут быть урезаны на 3-5 мм с помощью ножниц. Любые неуместные семена или кластеры семян затем может быть перемещено или разделены с использованием стерильных одноразовых пересевать цикла.
   3. Место пластину MS на задней части из Ламинарный шкаф с наполовину закрытой крышкой. Избыток воды испаряются из пластины MS.
   4. Место крышку на пластины MS. Печать, пластину MS, завернув пластины с микропористая Хирургическое ленты (см. Таблицу материалы).

3. Стерилизация Arabidopsis семян с хлора

1. подготовить MS пластины в соответствии со статьей 1 протокола. Автоклав 100 мл дистиллированной воды, в то же время как MS СМИ; Это будет использоваться позднее для помочь приостановить семена для помощи в обшивке.
   Примечание: При желании, 0,8% агар смесь (w/v) (например, phytagar) также может быть газобетона в этом шаге. Агар смесь может быть заменен на дистиллированной воды во время покрытия (шаг 3.6.2.). Дополнительных вязкости смеси агар облегчает пространство семена на пластины или завод в строках при необходимости.
2. Перед началом стерилизации, расчета сумм отбеливатель и соляной кислоты (HCl), необходимых для производства газообразного хлора.
   1. Рассчитать количество HCl, необходимых для производства 6,1% Cl ₂, необходимых для стерилизации.
   2. Используйте следующую формулу:
      
      с 7000 мл как объем контейнера стерилизации и 6.1% Cl ₂; объем HCl рассчитывается как 3 мл.
      Примечание: Запрограммированы для выполнения вычислений для различных объемов контейнерных и % Cl ₂ таблицы приводится Справочная таблица 1.
3. Аликвота 100 семян в пробки microcentrifuge 0,5 мл. Закройте крышки для каждого флакона, флаконов в пластиковые стойки и отложите.
   Примечание: Семена могут храниться в течение длительного времени в этот момент, до тех пор, как они хранятся в надлежащих условиях. Условия хранения можно найти в разделе 3.3.2 протокола ⁴ Риверо и коллег. также может использоваться формат пластины 96-луночных.
4. Подготовить материалы, необходимые для выполнения стерилизации газ хлор.
   1. Получить от мест их хранения отбеливатель и HCl.
   2. Вырезать полосы больших парафина фильм (см. Таблицу материалов) для использования на шаге 3.5.3. печать контейнер стерилизации.
   3. Место пластиковый контейнер с крышкой, в котором стерилизация будет проходить внутри зонта. Откройте шапки на все флаконы семена и поместите всю семенную стойки внутри пластикового контейнера.
5. Выполняют хлора газовой стерилизации при комнатной температуре.
   Предупреждение: Работа с отбеливателем и кислоты отдельно. Не оставляйте либо бутылка контаминированных для снижения риска разливов. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) включая перчатки и халате. Если отбеливатель или кислоты брызгает на перчатки, измените перчатки до обработки других материалов. Всегда удалите перчатки в зонта в случае загрязнения отбеливатель или кислоты.
   1. Место 250 мл стакан внутри контейнера и добавить 100 мл отбеливателя.
      Примечание: Реакции между HCl и отбеливатель требует по крайней мере 22 томов избыток отбеливателя. Реакция будет потреблять HCl и отбеливателя, выпустив Cl ₂ газ с хлорид натрия (NaCl) и воды как побочные продукты. Использование большой избыток bleach позволяет потребление дополнительных HCl dУринг вентиляционного периода, который уменьшает количество бикарбоната натрия (NaHCO ₃) необходимо нейтрализовать решение для утилизации.
      Предупреждение: Стакан должно быть по крайней мере дважды объем жидкий отбеливатель + HCl. Это предотвращает экранирование стакан во время следующего шага, брызги, которые могут повредить семена, отбеливатель одежду или записать открытые участки кожи.
   2. Добавить 3 мл HCl в стакан, содержащие отбеливатель.
      Предупреждение: Первоначальная реакция будет производить пузыри, особенно при концентрации газа, чем 6,1%. Длинными рукавами лаборатории пальто необходимых для этого шага.
   3. Закройте контейнер стерилизации и запечатать его с парафином фильм немедленно.
   4. Контролировать контейнер стерилизации во время стерилизации для обеспечения накопления газов; накопление газа хлора должны быть видны как слабый Желтая дымка внутри контейнера.
      Внимание: Периодически проверяйте стерилизацию контейнера для обеспечения что давление внутри не сбросил крышку или парафиновые фильм. Если крышка стала необратимой или парафин фильм соскользнул, закройте крышку и тщательно заверните контейнер с дополнительным слоем парафина фильма.
   5. После 1 h стерилизации период, откройте контейнер, удаления парафина фильм и открыв крышку на одном углу. Разрешить контейнеру излить за 3 ч до завершения реакции и устранения хлор газ.
   6. Закройте крышки все microcentrifuge трубы в стойку семян.
      Примечание: Стерилизованные семена могут храниться до времени покрытие до тех пор, как они хранятся в сухом состоянии.
   7. Удаления семян стойку и поместить его в Ламинарный шкаф.
   8. Нейтрализации хлора газа реакция
      1. Добавить 1,5 g порошка ₃ NaHCO медленно в стакан, содержащие отбеливатель/HCl решение и перемешать с стеклянный стержень распустить NaHCO ₃ в раствор. Продолжить добавление NaHCO ₃, до тех пор, пока пузырьки газа двуокиси углерода (CO ₂) перестали образуя.
         Предупреждение: Добавьте медленно предотвратить брызги. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и лаборатории пальто.
      2. Тест рН раствора с помощью РН полоски или pH метр. Добавить дополнительные NaHCO ₃ при необходимости до pH раствора нейтральной (рН 7,0). На этом этапе решение могут быть удалены из зонта и утилизировать согласно все применимые удаления руководящие принципы.
         Предупреждение: Если какой-либо запах заметил во время удаления, то решение должно немедленно возвращено зонта.
6. Пластины стерилизованные семена на пластины MS.
   1. В Ламинарный шкаф, метки в нижней части пластины MS с названием запасов и текущую дату.
   2. Добавить 500 мкл стерилизованные дистиллированной воды для каждой пробки microcentrifuge приостановить семена. Залейте семена на пластину MS и распространять семена равномерно вокруг пластину с помощью стерильный, однократного использования пересевать цикла или кончик стерильной пипеткой.
   3. Место пластину MS на задней части из Ламинарный шкаф с наполовину закрытой крышкой. Избыток воды испаряются из пластины MS.
   4. Место крышку на пластины MS. Печать пластину MS, завернув пластины с микропористые бумаги хирургическая лента.

4. Рост Arabidopsis на пластины MS

1. место пластины с крышкой на вершине за три дня на 4 ° c и относительной влажности.
   Примечание: Этот процесс называется стратификации и служит для синхронизации всхожесть семян индивидуальных.
2. Передачи пластины роста среду.
   1. Поддержания температуры при 23 ° C и интенсивности света на 120-150 мкмоль/м ² с светом 16 h / 8 h темные фотопериода. Поместите пластины плоские в среду расти с крышкой на верхней так корни растут в среду.
3. Рассаду на тарелках расти на 8 дней пусть.
   Примечание: 8 дней вегетационного периода позволяет поздно прорастания семян к прорастанию. Пластины может быть забит раньше, чем через 8 дней, если все семена проросшие.
4. Оценка ставок всхожесть.
   1. Запись количество семян, проросшие и что не прорастали. Рассчитать путем деления числа семян, которые проросшие всхожесть на общее количество семян на пластину.
      Примечание: Прорастание подсчитывается, когда корешок прогнозирует вне seed Пальто и видны две семядоли.
   2. Также рассчитывать количество семян, пострадавших от плесени для определения эффективности условий стерилизации.

Результаты

Арабидопсис семена, собранных из открытых поле, Теплице или рост палата иногда заражены различные микроорганизмы, как грибов и бактерий в^1,4. Таким образом прорастания семян на стерильную СМИ может быть особенно сложным из-за загрязнения плит, особенно когда снабжения семенами ограничен. Оптимизированный протокол для отбеливателя и хлора газовой стерилизации, результаты которого представлены ниже, свести к минимуму эту проблему и сохраняет жизнеспособность семян, необходимых для высокопроизводительных приложений.

Эффекты отбеливатель стерилизации на прорастание семян Arabidopsis Col-0

Bleach является наиболее часто используемым агент для стерилизации семян в многочисленных видов растений. Оптимальная концентрация стерилизации агента и время экспозиции варьируется от видов. Ряд протоколов были заняты с помощью отбеливателя для стерилизации Arabidopsis семена^{1,4,5,6,,78,9 , 10}. четыре различных концентраций отбеливатель с пяти различных выдержка, периоды были проверены, и результаты представлены в Рисунок 1. Процедуры были применены в Колумбии одичал тип (Col-0) семена. Эффект концентрация отбеливателя на прорастание семян Col-0 варьируется в зависимости от времени стерилизации как свидетельствует значительное взаимодействие между отбеливатель концентрации и времени стерилизации (рис. 1, P < 0,001, ANOVA-дисперсионный анализ).

В экспериментах с стерилизации раз между 5 и 10 мин лечения с всех отбеливателя концентрацией привели к столь же высокую всхожесть семян Col-0 (рис. 1). Также высокую всхожесть темпы наблюдались для бытовой отбеливатель концентрации 40% и 50% для всех раз стерилизации. Лечение с 80% и 100% отбеливатель для периодов длиннее 10 минут привел к значительному уменьшение всхожесть, по сравнению с короче замачивания раз (P < 0,01, ANOVA). Кроме того, для 80% и 100% отбеливание лечение 20 мин, прорастание был значительно сократилось по сравнению с соответствующей 40% и 50% отбеливание лечение (P < 0,001, ANOVA).

Семена отображаются различные уровни отбеливания и съежившегося при использовании высокой отбеливатель концентрации за 15 минут или дольше. В дополнение к относительно высоким (до 32%) семян смертности, проросшие семена, стерилизовать в этих условиях, часто показали рост дефектов, отражение в провал семядоли и гипокотиля разворачиваться и удлиненное, что приводит к развития ареста. Большинство методов лечения (14 из 20) были полностью плесень бесплатно, что приводит к общей плесень уровне среднем 0,21% ± 0,003 (Таблица 1).

Лечения с 50% отбеливателя и выдержки времени 10 мин был выбран как лучший режим стерилизации потому, что он в сочетании с хорошим торможение роста поверхности патогена высокой всхожести. Эта процедура была выбрана для тестирования эффект стерилизации отбеливателя на различных мутантных линий, как описано ниже.

Эффекты хлора газовой стерилизации на прорастание семян Col-0

Для оптимизации условий стерилизации газ хлор, три различные концентрации хлора были использованы для стерилизации Col-0 семена для двух периодов времени (Таблица 2). Концентрация газа было рассчитано на объем концентрированной HCl и объем контейнера стерилизации, используя следующее уравнение:

Эта формула была получена с помощью закона идеального газа предполагая 12,3 М HCl, температуре 23 ° C и нормальном атмосферном давлении 101,3 кПа.

Было показано, что эффект концентрации газа хлора на прорастание семян Col-0 зависит от времени стерилизации как указано существенного взаимодействия между временем и концентрации факторов (рис. 2A, P < 0,01, ANOVA) . Концентрация газа хлора не оказало существенного влияния на прорастание семян Col-0, подвергаются стерилизации 1 ч. С этого времени стерилизации, все концентрации хлора аналогичным образом способствует высокий уровень прорастания, выше 85% (P > 0,05, ANOVA). С другой стороны, 3 h Лонг стерилизации привело к значительным снижением всхожесть наибольшей концентрации хлора, по сравнению с двумя более низких концентраций газа (P < 0,05, ANOVA). Эти результаты показывают, что лечение Arabidopsis семян с какой-либо из проверенных хлора концентрации газа за 1 ч или концентрации газа ниже 16,5% за 3 ч, одинаково эффективны в деле сохранения жизнеспособности семян, поскольку прорастание ставки всегда были более более 82%. Однако стерилизации семян для 3 h с 16,5% газа пагубно для прорастания семян.

Количество плесени был также зависит от концентрации газа и времени экспозиции. Рост плесени был эффективно препятствует с относительно высокой концентрации 6,1% и 16,5% хлора для 1 h длительного лечения и все концентрации газа для 3 h (Рисунок 2Б).

На основе этих результатов, лечение с концентрацией газа 6,1% за 1 ч (Таблица 2) была выбрана в качестве лучших паровой фазы стерилизации условие для проверки эффекта газовой стерилизации на различных мутантных линий, так как он в сочетании высокой всхожести ставка ( 85%) с очень низким уровнем загрязнения плесень (0,02%).

Эффекты отбеливателя и хлора газовой стерилизации на семена с различными всхожесть потенциальных

Статистический анализ показал, что ответ всхожесть методов стерилизации зависит от прорастания потенциал линии (рис. 3A, P < 0,01, ANOVA). Отбеливатель ни хлора газовой стерилизации уменьшена всхожесть семян с высокой всхожести потенциальных (группы 4 и 5). Ни лечения оказали воздействие на уже низкий всхожесть группы с низким всхожестьпотенциал (Группа 1). В отличие от хлора газовой стерилизации привело к значительному сокращению примерно 12-18% (P < 0,01, ANOVA) в всхожесть семян с промежуточным всхожесть потенциалом (группы 2 и 3). Отбеливатель стерилизации также снизилась всхожесть на 13% группы 2, но он не уменьшить всхожесть 3 группы. Хотя без существенных различий в всхожесть отбеливателя и хлор газ лечения в любой группе прорастания (рис. 3A, P > 0.442, ANOVA), семена, стерилизации с помощью отбеливателя имели несколько выше всхожесть, чем газ стерилизации семян во всех группах прорастания.

Стерилизации лечения значительно изменила (P < 0,001, ANOVA) процентов семян, пострадавших от плесени (рис. 3B). Обе хлор газ и отбеливатель стерилизации привело к менее плесени (P < 0,05, ANOVA) по сравнению с не стерилизации. Нет никакой разницы в уровне плесень, обнаружен между газом и отбеливатель стерилизации в любой группе (рис. 3Б, P > 0,4, ANOVA).

Рисунок 1: эффекты отбеливателя концентрацией и стерилизации времени на прорастание семян Arabidopsis Col-0. Значения являются средства ± SD, полученные из 5 независимых репликаций эксперимента. * Указывает на существенные различия по сравнению с 5 мин, замачивания продолжительность для диапазона концентраций отбеливатель (P < 0,01, ANOVA). ^#показывает значительные различия по 80% и 100% отбеливатель концентрации по сравнению с 40% и 50% на 20 мин период времени (P < 0,01, ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: эффекты хлора газа время концентрации и стерилизации на семена Arabidopsis Col-0. (A) всхожесть и (B) плесень уровне. Планки погрешностей представляют собой средства ± SD, полученные от 5 биологических и 5 технических репликаций эксперимента. Средства, которые не разделяют письмо значительно отличаются (P < 0,05, ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: эффекты отбеливателя и хлора газовой стерилизации на семена с различными всхожесть потенциальные. (A) всхожесть и (B) плесень уровне. 100 линий Солка T-ДНК были разделены на пять групп в соответствии их всхожесть потенциал определяется как всхожесть в отсутствие любого агента стерилизации. Группы, основанные на всхожесть были следующим образом: Группа 1 (0-20%), Группа 2 (21-50%), Группа 3 (51-70%), Группа 4 (71-90%) и Группа 5 (91-100%). Линии были выбраны случайным образом и их всхожесть потенциал не зависит от генотипа. Значения являются средства ± SD, полученные от трех независимых репликаций эксперимента. Буквы («a», «ab», «c» и т.д.) выше каждое значение указывают статистические группировки категории средств. Средства, которые не разделяют письмо значительно отличаются (P < 0,05, ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Время стерилизации (мин)	Концентрация отбеливателя (%)
	40	50	80	100
5	0.00%	0.00%	0.00%	2.13%
8	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%
10	0.00%	0,50%	0.00%	0,36%
15	0.00%	0.00%	0.00%	0,68%
20	0,19%	0,28%	0.00%	0.00%

Таблица 1: Плесень уровне Блич стерилизации семян Col-0.

Блич	HCl	Время	% Хлора (мол Cl2/mol всего газа)
(мл)	(мл)	(h)
25	1	1	2.1
25	1	3	2.1
100	3	1	6.1
100	3	3	6.1
200	9	1	16,5
200	9	3	16,5

Таблица 2: Хлора (Cl₂) газовой стерилизации лечения на Columbia одичал тип семян с помощью контейнера 7 Л.

Справочная таблица 1: Запрограммированы для выполнения вычислений для различных объемов контейнерных и % Cl₂таблицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Когда выращивания арабидопсиса семена на стерильную СМИ, должны применяться некоторые формы стерилизации. Bleach и хлора газовой стерилизации лечения привести аналогичные всхожесть темпы и формы торможение роста. Ни один из методов стерилизации вызывает значительное снижение в всхожесть семян с высокой всхожести потенциал; Однако отбеливатель стерилизации рекомендуется для линий с более низким потенциалом прорастания (20-70%), из-за малого, хотя и незначительное, улучшение всхожесть по сравнению с газовой стерилизации (Рисунок 3А).

Стерилизационные Arabidopsis семена с отбеливателем концентрации от 40-100% для до 10 мин обеспечивает удовлетворительный всхожесть проценты и эффективные формы подавления. Хотя концентрации отбеливатель, менее чем в 40% обеспечивают адекватные стерилизации для большинства много семян, используя 40% концентрации или выше гарантии эффективной стерилизации даже сильно загрязненные семян лотов. Это важно не превышать 10 мин стерилизации при использовании отбеливателя концентрации равных или выше 80% чтобы избежать высокой семенной смертности и дефекты в развитии рассады.

Лечение Arabidopsis семена с концентрации газа хлора 6,1% или 16,5% для 1 h результаты ставок высокой всхожести и адекватные формы ликвидации. Низкая хлора концентрация газа (2,1%) могут успешно использоваться, увеличивая продолжительность стерилизации до 3 ч.

Когда несколько строк нужно стерилизовать, рекомендуется жидкий стерилизации в растворе хлорки 50% за 10 мин. Для большего числа линий газовой стерилизации с концентрацией газа 6,1% за 1 ч это лучший вариант, так как многие линии можно стерилизовать быстро и легко с менее манипуляции.

Наши результаты обеспечивают стандартизированные условия для стерилизации большое количество семян различных генотипов и семена с нижней всхожесть потенциал. Единственным ограничением этих методов стерилизации является, что они не могут применяться к семена с прорастания цены менее чем 20% из-за обширных семян смертности. Альтернативные методы, такие как sonication¹⁷, повысить всхожесть в отсутствие стерилизации может быть полезно в тех случаях.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.65 mL Microcentrifuge tubes	GeneMate	C-3260-5	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
1.7 mL Microcentrifuge tube	GeneMate	C-3262-1	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
7 L plastic container	Sistema	1016265438	Container in which gas sterilization is performed
Concentrated HCl	Sigma-Aldrich	320331	Chemical used in the process of creating chlorine gas
Disposable sterile inoculating loop	Fisher Scientific	22-363-603	Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019	Vitamin solution used in the process of making MS media
Household bleach	Clorox	Regular-Bleach	Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933	Chemical used in the process of making MS media
Micropore surgical tape	3M	1530-1	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524	Chemical used in the process of making MS media
Parafilm M	Bemis Company	#PM996	Parraffin film used to seal sterilization container
Petri dish 100 X 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
pH indicator strips	Whatman	2613991	Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution
Phytoagar	Fisher Scientific	50-255-212	Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Chemical used in the process of making MS media
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100	Chemical used in the process of liquid sterilization
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	CS70000 (Col-0)	Arabidopsis wild-type seeds
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_037606C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_041402C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_059101C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_063470C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072048C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072240C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081989C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_084124C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085049C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_089717C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107354C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110111C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111322C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113109C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114702C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114872C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115657C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_116803C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039445C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039782C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_043037C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_045828C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_048556C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049514C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049725C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080816C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081176C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081770C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082262C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082289C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082702C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083630C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_084635C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085337C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085656C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_093049C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_103332C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_105336C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_105704C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_106388C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_109575C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110580C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110617C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111424C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111584C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115837C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_019535C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_026478C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_046565C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049258C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_056307C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081292C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083488C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110573C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112793C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113658C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113904C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114673C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114709C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115455C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_013186C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_018261C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_062509C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080639C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_088586C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_096651C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_106900C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110131C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111051C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111245C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113223C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_121391C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_125097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_201905C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_210001C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_000662C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_029335C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_047760C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_071275C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080530C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_103881C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110864C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_120294C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_124390C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_132808C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_137036C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_139519C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_140643C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_142288C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_143304C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_147597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_209076C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081081C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107487C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2