Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Özet

Bu çalışmanın amacı çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon steril ortam üzerinde yetiştirilen bir aralığı Arabidopsis genotip tohum çimlenmesi üzerindeki etkilerini belirlemek için yapıldı. En iyi duruma getirilmiş sterilizasyon protokolleri tatmin edici tohum hayatta kalma sağlarken mikrobiyal kirleticiler gelişimini engellemek için geliştirilmiştir.

Özet

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) fidan sık sık steril ortamda yetişkin olmak gerekir. Bu mikrobiyal kirleticiler tohum yüzeyinde mevcut gelişimini önlemek için önceden tohum sterilizasyon gerektirir. Şu anda, Arabidopsis tohum sterilize labs arasında biraz farklılık ve değil standart koşullarda iki ayrı sterilizasyon teknikleri kullanarak, genellikle yalnızca kısmen etkili sterilizasyon veya aşırı tohum mortalite kaynaklanan. Bu yöntemlerin çoğu Ayrıca çok sayıda farklı genotip tohum hatları kolayca ölçeklenebilir değildir. Teknolojileri Arabidopsis yüksek üretilen iş analizi için çoğalırlar devam ederken, çok sayıda farklı genotip tohumları sterilizasyon için standart teknikleri bu tür deneyler yürütmek için gerekli hale gelmektedir. Birkaç Arabidopsis satır yanıt iki farklı sterilizasyon teknikleri için tohum çimlenme oranı ve mikroplar ve diğer patojenleri ile tohum bulaşma düzeyine göre değerlendirilmiştir. Tedaviler ajanlar ve maruz kalma, Arabidopsis tohum sterilizasyon için en uygun koşulları belirlemek için kombine kez sterilize farklı konsantrasyonlarda dahil. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları için iki farklı sterilizasyon yöntemleri geliştirilmiştir: çamaşır suyu (sıvı fazlı) ve her iki kaynaklanan yüksek tohum çimlenme oranları ve en az mikrobiyal kirlenme klor (Cl₂) gaz (buharı fazlı). Bu iletişim kurallarının yardımcı programı hem vahşi türü ve mutasyona uğramış tohum çimlenme potansiyelleri bir dizi test aracılığıyla betimlenir. Bizim sonuçlar sterilizasyon zararlı etkileri ile optimum çimlenme potansiyeli daha düşük tohum için gözlendi, ancak tohum etkili olmadan aşırı tohum ölüm, iki yöntemden herhangi birini kullanarak sterilize olduğunu gösterir. Buna ek olarak, bir denklem araştırmacılar standart klor gazı sterilizasyon şartları hava geçirmez farklı boyutlarda kapsayıcılarına etkinleştirmek için geliştirilmiştir. Burada açıklanan protokollere izin ver kolay, etkili ve ekonomik tohum sterilizasyon çok sayıda Arabidopsis satırları için.

Giriş

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) bitki Biyoloji^1,2,3temel ve uygulamalı araştırma için ana model organizmadır. Ise Arabidopsis büyüme için standart koşullar iyi kurulmuş⁴olabilirdi, tohum sterilizasyon tohum canlılığı üzerinde etkisini titizlikle test edilmemiştir. Plakalar veya kutulara katı ortam rutin Arabidopsis fidan ateş ve kök fenotipleri gözlenmesi, erken yavru bir popülasyondaki homozigoz ölümcül mutantlar tanımlaması gibi birçok deneysel uygulamalar için büyüme kolaylaştırmak için kullanılır aşamaları, yalıtım patojen ücretsiz doku, fide doku, transformants veya ilaca dirençli bitkiler seçimi ve değerlendirmesi çimlenme^{1,2,3,4 büyük miktarda koleksiyonu} . Bir serada yetiştirilen bitkiler tohum hasat veya büyüme odası zaman zaman mikroorganizmalar ve toz ile kirlenmiş. Arabidopsis fidan steril ortam türleri farklı büyüme önceki tohum sterilizasyon gibi mantar ve bakteri tohum yüzeyinde mevcut mikrobiyal kirleticiler kaldırmak için gerektirir. Bir etkili tohum sterilizasyon rejim kullanımı yüksek çimlenme, minimum kirlenme ve güçlü bitki büyüme dengesi için önemlidir.

Arabidopsis tohum sterilizasyon için kullanılan iki en yaygın yöntem ticari çamaşır suyu (sıvı fazlı) ve klor gazı (buharı fazlı) temel alır. Çeşitli prosedürler her iki sıvı fazlı sterilizasyon^{1,4,5,6,7,8,9} için istihdam edilmiştir ^, Arabidopsis ¹⁰ ve buharı fazlı sterilizasyon^{8,10,11,12,13,14,15 tohum ,16}. Ancak, bu yordamları kullanılan genotip tohum sterilizasyon yerine getirmeye etkili olmuştur iken, tohumlar üzerinde farklı sterilizasyon tedavilerin farklı genotip etkisi ayrıntılı bir analizini bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu sterilizasyon işlemleri en iyi duruma getirme etkin sterilizasyon yüksek çimlenme oranı ile birleştirilmiştir koşulları tanımlamak için gereklidir.

Arabidopsis biyolojik kaynak merkezi (ABRC) benzersiz bir) dahili olarak uygulanan kalite kontrol prosedürlerinin toplama ve b) take avantajı ve kullanıcı geribildirim yanıt olarak farklı genotip çeşitli tohum canlılığı sınamak için konumlandırılmış tohum çimlenme hakkında. Tohum çimlenme Arabidopsis aralığı genotip, çeşitli sterilizasyon yöntemleri etkilerini belirlemek için hedefleri burada sunulan deneyler idi. En az patojen bulaşma koruyarak yüksek tohum çimlenme fiyatlarına neden en iyi duruma getirilmiş sterilizasyon işlemleri çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon için sunulmaktadır.

Protokol

1. 1 x Murashige ve Skoog (MS) orta hazırlanması

1. ekleyin 4,31 g MS Bazal tuz karışımı, 10 g Sükroz ve 0.5 g 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic asit (MES) 0, 8 L distile su ve çözülmeye heyecan içeren bir ölçek için. Kontrol edin ve pH 1 M potasyum hidroksit (KOH) kullanarak 5,7 için ayarlayın. 1 yapmak için distile su ekleyin L.
2. Medya iki 1 L şişe 500 mL bölün. Agar 5 g için her şişe ekleyin. Kapak serbest bırak.
3. Otoklav 121 ° c, 15 şişe manyetik heyecan barda PSI 20 dk için.
4. Isıyla sonra düşük hızda karıştırın tabakta şişe yerleştirin ve 45-50 ° C'ye kadar (şişe çıplak elle tutulabilen) soğutmak MS orta sağlar.
5. Bu adımından başlayarak, laminar akış kukuIeta steril koşullarda tüm adımları uygulayın. 500 µL Ekle Gamborg ' s vitamini her şişe ve vitamini çözüm olarak dağıtabilmenizi MS orta heyecan için çözüm.
6. Yeterli medya kalıplara yaklaşık yarım plaka derinliği karşılamak için dök.
7. İzin plakaları agar kuvvetlendirmek izin vermek 1 h için oda sıcaklığında soğumaya.
   Not: hemen kullanılmak üzere tabaklar, Plastik poşete ve 4 ° C'de (buzdolabı sıcaklığı) depolamak. Kapalı plakaları, kutuları veya katılaşmış agar tüplerini 4 ° c hava geçirmez bir kap içinde birkaç hafta saklanabilir.

2. Sterilizasyon Arabidopsis tohum çamaşır suyu ile

1. hazırla MS plakaları Protokolü'nün 1 kısmı uyarınca. Otoklav MS Media aynı anda distile su 100 mL. Bu daha sonra durulama suyu olarak ve tohumlar askıya kaplama yardım etmek için kullanın.
   Not: arzu edilirse, %0,8 agar karışım (w/v) (örneğin phytagar) da bu adımda autoclaved olabilir. Agar karışım için distile su kaplama sırasında yedek olabilir (Adım 2.5.3.). Agar karışım ilave viskozite alanı tohumlar plaka veya bitki üzerinde satırları gerekirse kolaylaştırır.
2. Hazırla % 50 (v/v) tohumları sterilizasyon için kullanılmak üzere çözüm çamaşır suyu. Çamaşır suyu sulandırmak için 100 mL distile su 100 mL çamaşır suyu ekleyin. 50 µL ara 20 deterjan, çamaşır suyu çözüm.
   Not:-Ebilmek var olmak stok hazır çamaşır suyu çözüm için yukarı bir ay için sadece steril koşullarda açıldığında sürece.
3. Aliquot 100 tohum içine 1.5 mL microcentrifuge tüp.
4. % 50 çamaşır suyu çözüm kullanarak tohum sterilize.
   1. Bir laminar akış başlık, tohum içeren microcentrifuge tüp 500 µL % 50 çamaşır suyu çözüm ekleyin. Tohumlar çamaşır suyu çözümde askıya için tüp alt dokunun.
      Not: Alternatif olarak, bir rotator veya platform Çalkalayıcı askıya tohumlar tutmak için kullanılabilir.
5. Çamaşır suyu çözüm tüp durulayın.
   1. 10 dakika sonra bir pipet veya sonunda bir pipet ucu ile donatılmış bir aspiratör kullanarak microcentrifuge tüp çamaşır suyu çözüm kaldırmak.
   2. Ekle 500 µL steril distile su tüp. Tüp kapatın ve karıştırmak için tersine çevirin. Tohumları tüp altına yerleşmek için izin verir. Tohum dikkatle tüp altına yerleşmiş bir kez çamaşır suyu çözüm pipetting tarafından çıkarın. Bu işlem 6 kez durulama işlemi yineleyin.
   3. Tohum askıya için tüp autoclaved distile su 1 mL ekleyin.
6. Sterilize tohumlar MS plakaları üzerinde plaka.
   1. Bir laminar akış başlık, hisse senedi adı ve geçerli tarihi ile MS plaka alt etiket.
   2. Tohum microcentrifuge tüp MS plaka üzerine dökün. Tohum steril, tek kullanımlık inoculating döngü veya steril pipet ucu kullanarak MS plaka çevresinde yayıldı.
      Not: Eğer tohum satırları ekili olabilir için bir pipet ile 200 µL bahşiş tohumlar istenen pozisyonlarda ayrı ayrı yerleştirmek için kullanılabilir. Tohum akışını artırmak için 3-5 mm tarafından makas kullanarak sonuna pipet ucu kesilmiş olabilir. Herhangi bir yanlış yerleştirilmiş tohum veya kümeleri tohum sonra yeniden konumlandırılmış veya tek kullanımlık steril bir inoculating döngü kullanarak ayrılmış.
   3. Yer arka MS plaka laminar akış Hood yarısı kapalı kapak ile. MS plaka buharlaşır aşırı su izin.
   4. Kapağı MS tabağa yerleştirin. Mühür plaka gözenekli kağıt cerrahi ile sarma tarafından MS plaka bant (Tablo reçetesi görmek).

3. Sterilizasyon Arabidopsis tohum klor gazı ile

1. hazırla MS plakaları Protokolü'nün 1 kısmı uyarınca. Otoklav MS Media aynı anda distile su 100 mL; Bu daha sonra tohum kaplama yardım askıya yardımcı olmak için kullanılacaktır.
   Not: arzu edilirse, %0,8 agar karışım (w/v) (örneğin phytagar) da bu adımda autoclaved olabilir. Agar karışım için distile su kaplama sırasında yedek olabilir (Adım 3.6.2.). Agar karışım ilave viskozite alanı tohumlar plaka veya bitki üzerinde satırları gerekirse kolaylaştırır.
2. Sterilizasyon işlemine geçmeden önce çamaşır suyu ve hidroklorik asit (HCl) klor gazı üretmek için gerekli miktarlarını hesaplamak.
   1. Sterilizasyon için gerekli % 6,1 Cl ₂ üretmek için gerekli HCl miktarını hesaplamak.
   2. Aşağıdaki formülü kullanın:
      
      ile sterilizasyon konteyner hacmi olarak 7000 mL ve %6.1 Cl ₂; olarak HCl hacminin 3 mL olmak hesaplanır.
      Not: ek tablo 1 konteyner ve % Cl ₂ farklı birimler için hesaplama gerçekleştirmek için programlanmış bir elektronik tablodan sağlanan.
3. Aliquot 100 tohum 0.5 mL microcentrifuge tüp içine. Her şişe için Kapaklar kapatın, şişeleri plastik bir rafa yerleştirin ve bir kenara koyun.
   Not: uygun şartlarda depolandıkları sürece tohum zaman bu noktada uzun süre saklanabilir. Saklama koşulları protokol bölümünde 3.3.2 Rivero ve arkadaşları ⁴ tarafından bulunabilir. 96-şey plaka biçim-ebilmek da var olmak kullanılmış.
4. Klor gazı sterilizasyon gerçekleştirmek gerekli malzemeleri hazırlayın.
   1. Elde çamaşır suyu ve HCl depolama konumlarından.
   2. Büyük parafin bir şerit film (Tablo reçetesi görmek) 3.5.3. adımda kullanmak için kesim. sterilizasyon konteyner mühür için.
   3. Hangi sterilizasyon gerçekleşecek bir duman başlık içinde Kapaklı plastik kap yerleştirin. Tohum şişeleri üzerinde Kapakları açın ve tüm tohum raf plastik konteyner yerleştirin.
5. Klor gazı sterilizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirmek.
   Dikkat: çamaşır suyu ve asit ile ayrı ayrı çalışır. Dökülen riskini azaltmak için kapağını her iki şişe bırakmayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) eldiven ve önlük dahil olmak üzere kullanın. Çamaşır suyu ya da asit eldiveni sıçramalarına, eldiven diğer malzemeler tutmadan önce değiştirin. Her zaman eldiven duman başlıklı çamaşır suyu ya da asit kirlenme durumunda kaldırın.
   1. 250 mL kabı kapsayıcı içinde yerleştirin ve çamaşır suyu 100 mL ekleyin.
      Not: Tepki HCl ve çamaşır suyu arasında en az 22 birimleri fazla çamaşır suyu gerektirir. Reaksiyon HCl tüketmek ve Cl ₂ gaz su ve Sodyum Klorür (NaCl) yan serbest bırakarak çamaşır suyu. Çamaşır suyu büyük bir fazlalığı kullanarak ek HCl d tüketimi sağlarSodyum bikarbonat (NaHCO ₃) azaltır havalandırma dönemi zamanlayıcısını ihtiyaç bertarafı için çözüm nötralize etmek.
      Uyarı: En az iki kez toplam sıvı hacmini çamaşır suyu + HCl kabı olmalıdır. Bu zarar tohumlar, giyim çamaşır suyu veya maruz tenini yakabilecek kabı sonraki adımı sırasında kaçan su sıçramalarına engeller.
   2. Ekle 3 mL HCl çamaşır suyu içeren kabı.
      Dikkat: İlk tepki kabarcıklar, özellikle de gaz konsantrasyonları 6.1 daha yüksek üretecek. Uzun kollu önlük için bu adım gereklidir.
   3. Sterilizasyon konteyner kapatın ve hemen parafin film ile mühür.
   4. İzlemek sterilizasyon konteyner gaz birikimi sağlamak için sterilizasyon zaman sırasında; klor gazı birikimi bir soluk sarı sis kapsayıcı içinde olarak görünür olmalıdır.
      Dikkat: Sterilizasyon konteyner içinde basınç kapağı yendiniz değil emin olmak için düzenli olarak kontrol edin veya film alkol. Kapağı atından geldi veya parafin film gevşek geldi, kapağını kapatın ve dikkatle kapsayıcı ek katmanı parafin film ile sarın.
   5. Sonra 1 h-sterilizasyon konteyner parafin film kaldırma ve köşelerinden kapağını açarak dönemini, aç. 3 h reaksiyon tamamlayıp klor gazı ortadan kaldırmak havalandırma kapsayıcı izin.
   6. Microcentrifuge tüpler tohum rafa Kapaklar kapatın.
      Not: Steril tohumları kuru durumda depolandıkları sürece kaplama, zamana kadar saklanabilir.
   7. Tohum rafa kaldırmak ve laminar akış mahallede yerleştirin.
   8. Klor gazı reaksiyon
      1. eklemek 1.5 g NaHCO ₃ toz yavaş yavaş çamaşır suyu/HCl solüsyon içeren kabı için etkisiz hale getirmek ve çözüm NaHCO ₃ çözülmeye bir cam çubuk ile karıştırın. Karbondioksit (CO ₂) gaz kabarcıkları oluşturan durduruldu kadar NaHCO ₃ eklemeye devam.
         Uyarı: yavaş yavaş su sıçramalarına engellemek için ekleyin. Eldiven ve önlük gibi uygun KKE kullanın.
      2. PH şeritler ya da bir pH metre kullanarak çözüm pH test. Gerektiği kadar çözüm pH nötr ise ek NaHCO ₃ ekleyin (pH 7,0). Bu noktada çözüm duman hood kaldırıldı olabilir ve tüm uygulanabilir elden çıkarma kurallarına göre bertaraf.
         Dikkat: Herhangi bir koku elden çıkarma sırasında fark varsa, o zaman çözüm hemen duman hood için döndürülmelidir.
6. Sterilize tohumlar MS plakaları üzerinde plaka.
   1. Bir laminar akış başlık, hisse senedi adı ve geçerli tarihi ile MS plaka alt etiket.
   2. Ekle 500 µL tohumlar askıya almak için her microcentrifuge Tube steril distile su. Tohum MS plaka üzerine dökün ve tohumlar eşit olarak steril, tek kullanımlık inoculating döngü veya steril pipet ucu kullanarak plaka çevresinde yayıldı.
   3. Yer arka MS plaka laminar akış Hood yarısı kapalı kapak ile. MS plaka buharlaşır aşırı su izin.
   4. Kapağı MS tabağa yerleştirin. Gözenekli kağıt cerrahi bant ile plaka sarma tarafından MS plaka mühür.

4. Arabidopsis büyüme MS plakaları

1. 4 ˚C ve ortam nemi üç gündür üst kapağı ile tabak yerleştirin.
   Not: Bu işlem stratifikasyon denir ve bireysel tohumların çimlenme eşitlemek için hizmet vermektedir.
2. Plakaları büyüme ortamına transfer.
   1. 23 ° C sıcaklığında saklayın ve 120-150 µmol/m ² s 16 h ışık / 8 saat karanlık ışık şiddeti photoperiod. Yer kaplamalar üst kapaklı grow ortamına düz kökleri orta büyümek bu yüzden.
3. İzin plakaları fidan büyümek için 8 gün.
   Not: Bir 8 günlük büyüyen süre geç tohum çimlenme takımıdır sağlar. Tabak attı 8 gün er eğer tüm tohumlar germinated.
4. Çimlenme gore puan edinildi.
   1. Kaydı bu germinated ve bu değil germinated tohum sayısı. Germinated tohum sayısına bölünmesi ile çimlenme oranı hesaplamak tohum plaka üzerinde toplam sayısıyla.
      Not: Radicle tohum kat dışında öngörülen ve iki cotyledons görülebilir zaman çimlenme sayılır.
   2. Ayrıca sterilizasyon şartları etkinliğini belirlemek için kalıp tarafından etkilenen tohum saymak.

Sonuçlar

Bir açık alan, sera veya büyüme odasından toplanan Arabidopsis tohum bazen^1,4mantar ve bakteri gibi çeşitli mikroorganizmalar tarafından kirlenmiş. Böylece, özellikle tohum arzı sınırlı olduğunda tohum steril ortamda takımıdır plakaları, kontaminasyon nedeniyle özellikle zor olabilir. Bunların sonuçlarını aşağıda sunulmuştur, çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı bu sorunu en aza indirir ve yüksek üretilen işi uygulamalar için gereken tohum canlılığı korur.

Çamaşır suyu sterilizasyon Arabidopsis Col-0 tohumların çimlenmesi üzerine etkileri

Çamaşır suyu için tohum sterilizasyon çok sayıda bitki türleri içinde en sık kullanılan ajandır. Sterilizasyon ajanı ve maruz kalma süresi en iyi konsantrasyon türler arasında değişir. Bir dizi Protokolü Arabidopsis tohumlar^{1,4,5,6,7,8,9} sterilizasyon için çamaşır suyu kullanma istihdam edilmiştir ^{, 10}. çamaşır suyu ile beş farklı pozlama süresi dönemleri test edildi ve sonuçları dört farklı konsantrasyonları sunulmaktadır şekil 1. Tedaviler Columbia vahşi-tipi (Col-0) tohumları için uygulandı. Çamaşır suyu toplama Col-0 tohumların çimlenmesi üzerindeki etkisini çeşitli sterilizasyon saate bağlı olarak çamaşır suyu toplama ve sterilizasyon saat arasında önemli bir etkileşim gösterildiği şekilde (şekil 1, P < 0,001, ANOVA-Varyans analizi).

Deneylerden sterilizasyon kez 5 ila 10 dk arasında eşit yüksek çimlenme oranı Col-0 tohum (şekil 1) tedavileri tüm çamaşır suyu konsantrasyonları ile sonuçlandı. Yüksek çimlenme oranları da her sterilizasyon zaman için % 40 ve % 50 konsantrasyonları ev çamaşır suyu için tespit edildi. 10 dakika uzun süre önemli bir sonuçlandı için Tedaviler % 80 ve % 100 çamaşır suyu ile azaltmak içinde daha kısa iliklerine Times'a göre çimlenme oranı (P < 0,01, ANOVA). % 80 ve %100 20 dk tedavisi çamaşır suyu için Ayrıca, çimlenme önemli ölçüde karşılık gelen % 40 ve % 50 çamaşır suyu tedavileri karşılaştırıldığında azalma (P < 0,001, ANOVA).

Tohum ağartma ve yüksek çamaşır suyu konsantrasyonları 15 dakika veya daha uzun kullanırken kuruyup çeşitli düzeyleri görüntülenir. Ek olarak nispeten yüksek (%32) tohum mortalite, germinated tohum kez büyüme kusurları, cotyledons ve hypocotyls açılmak ve uzamış, bir başarısızlık yansıyan gösterdi bu koşullarda sterilize gelişimsel durması sonucu. En tedaviler (20 dışarı-in 14) tamamen edildi kalıp-genel kalıp düzeyi ortalama %0,21 ± 0,003 (Tablo 1) kaynaklanan Alerjik,.

Çünkü yüksek çimlenme yüzdesi iyi yüzey patojen büyüme inhibisyonu ile kombine tedavi ile % 50 çamaşır suyu ve 10 dk sırılsıklam bir zaman en iyi sterilizasyon rejimi seçildi. Bu tedavi aşağıda açıklandığı gibi çamaşır suyu sterilizasyon farklı mutant satırlarındaki etkisini test etmek için seçilmiş.

Klor gazı sterilizasyon Col-0 tohumların çimlenmesi üzerine etkileri

Klor gazı sterilizasyon şartları en iyi duruma getirmek için klor gazı üç farklı konsantrasyonlarda Col-0 tohum iki süreler (Tablo 2) için sterilize etmek için kullanılmıştır. Gaz toplama göre konsantre HCl hacmi ve aşağıdaki denklemi kullanarak sterilizasyon konteyner hacmi da hesaplanır:

Bu denklem varsayarak 12.3 M HCl, 23 ° C sıcaklık ve standart atmosfer basıncı 101.3 kPa, ideal gaz Yasası kullanılarak türetilmiştir.

Klor gazı konsantrasyonu Col-0 tohumların çimlenmesi üzerindeki etkisini sterilizasyon zaman zaman ve konsantrasyon faktörler arasında önemli bir etkileşim tarafından belirtildiği şekilde bağlı gösterilmiştir (şekil 2A, P < 0,01, ANOVA) . Klor gazı konsantrasyonu 1 h sterilizasyon için tabi Col-0 tohumların çimlenme üzerinde önemli bir etkisi vardı. Bu sterilizasyon zamanla tüm klor gazı konsantrasyonları benzer şekilde çimlenme, % 85 üzerinde yüksek düzeyde terfi (P > 0,05, ANOVA). Öte yandan, klor gazı, iki alt gaz konsantrasyonları ile karşılaştırıldığında en yoğun çimlenme oranı önemli bir azalma 3 h-uzun sterilizasyon sonuçlandı (P < 0,05, ANOVA). Bu sonuçlar tedaviler Arabidopsis tohumların herhangi bir test klor gaz konsantrasyonları 1 h için veya 3 h için % 16,5'in altında gaz konsantrasyonları ile çimlenme oranları her zaman daha büyük olduğundan tohum canlılığı koruyarak eşit derecede etkili olduğunu gösteriyor %82. Ancak, tohum %16,5 gaz ile 3 h için sterilize tohum çimlenme için zararlı.

Kalıp insidansı da gaz konsantrasyonu ve çekim hızı bağımlı oldu. Küf gelişimi etkili 3 h (2B rakam) için tüm gaz konsantrasyonları ile % 6,1 ve %16,5 klor gazı 1 h-uzun tedavi için nispeten yüksek konsantrasyonları ile inhibe.

Bu sonuçlarına göre %6.1 1 h (Tablo 2) için bir gaz konsantrasyonu ile tedavi en iyi buharı fazlı sterilizasyon koşulu olarak bu kombine beri yüksek çimlenme oranı (gaz sterilizasyon farklı mutant satırlarındaki etkisini test etmek için seçilmiş yapıldı. % 85) küf kontaminasyon (%0.02) çok düşük düzeyine sahip.

Çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon tohumları ile farklı çimlenme potansiyel etkileri

İstatistiksel analiz gösterdi sterilizasyon yöntemleri çimlenme cevaben satırları çimlenme potansiyelini bağımlı (şekil 3A, P < 0,01, ANOVA). Ne çamaşır suyu ne de klor gazı sterilizasyon yüksek çimlenme potansiyel (gruplar 4 ve 5) ile tohumların çimlenme oranı azalır. Ben de tedavi en düşük çimlenme grubuyla zaten düşük çimlenme hızı üzerinde bir etkisi vardıpotansiyel (Grup 1). Buna ek olarak, önemli bir azalma yaklaşık 12-18 oranında klor gazı sterilizasyon sonuçlandı (P < 0,01, ANOVA) ara çimlenme potansiyel (Grup 2 ve 3) ile tohum çimlenme içinde. Çamaşır suyu sterilizasyon da çimlenme oranı Grup 2 13 oranında azalmıştır. fakat bu grup 3 çimlenme oranı azaltamaz. Gaz tedaviler herhangi bir çimlenme grubunda çamaşır suyu ve klor arasında anlamlı bir fark çimlenme oranı olmasına rağmen (şekil 3A, P > 0.442, ANOVA), çamaşır suyu kullanılarak sterilize tohum var biraz daha yüksek çimlenme oranı gaz sterilize tohumları tüm çimlenme gruplarında daha.

Önemli ölçüde değişmiş sterilizasyon tedaviler (P < 0,001, ANOVA) kalıp (şekil 3B) tarafından etkilenen tohum yüzde. Daha az küf gelişimi her iki klor gazı ve çamaşır suyu sterilizasyon sonuçlandı (P < 0,05, ANOVA) hiçbir sterilizasyon için karşılaştırıldığında. Gaz ve çamaşır suyu sterilizasyon herhangi bir grubunda arasında ortaya kalıp düzeyde fark yoktu (şekil 3B, P > 0.4, ANOVA).

Şekil 1: çamaşır suyu konsantrasyon ve sterilizasyon zaman Arabidopsis Col-0 tohumların çimlenmesi üzerine etkisi. Anlamına gelir ± SD deney 5 bağımsız çoğaltmalar elde edilen değerlerdir. * 5 dk süresi çamaşır suyu konsantrasyonları bir dizi için iliklerine göre önemli farklılıklar gösterir (P < 0,01, ANOVA). ^#zaman dilimi % 80 ve % 100 çamaşır suyu konsantrasyonu % 40 ve %50 20 dk için göre önemli farklılıklar gösterir (P < 0,01, ANOVA). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: klor etkileri Arabidopsis Col-0 tohum toplama ve sterilizasyon zamanında gaz. (A)çimlenme oranı ve (B) kalıp düzeyi. Hata çubukları temsil anlamına gelir ± SD 5 biyolojik ve deneme 5 teknik çoğaltmalar elde. Önemli ölçüde farklı olduğu bir mektup paylaşmayın anlamına gelir (P < 0,05, ANOVA). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon tohumları ile farklı çimlenme potansiyel etkileri. (A)çimlenme oranı ve (B) kalıp düzeyi. 100 SALK T-DNA satır çimlenme oranı diğer sterilizasyon ajanlarının yokluğu olarak tanımlanan beş gruplar halinde göre onların çimlenme potansiyel sınıflandırıldı. Grupları çimlenme oranına göre aşağıdaki gibidir: Grup 1 (0-%20), Grup 2 (21-%50), Grup 3 (51-%70), Grup 4 (71-%90) ve grup 5 (91-%100). Satırları rasgele seçilmiş ve onların çimlenme potansiyel üzerinde genotip bağlı değildir. Anlamına gelir ± SD deney üç bağımsız çoğaltmalar elde edilen değerlerdir. Harfler ("a", "ab", "c", vb) her değerin Kategorya istatistik grupları gösterir. Önemli ölçüde farklı olduğu bir mektup paylaşmayın anlamına gelir (P < 0,05, ANOVA). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sterilizasyon süresi (dk)	Çamaşır suyu toplama (%)
	40	50	80	100
5	%0.00	%0.00	%0.00	%2.13
8	%0.00	%0.00	%0.00	%0.00
10	%0.00	% 0.50	%0.00	%0,36
15	%0.00	%0.00	%0.00	%0,68
20	%0,19	%0,28	%0.00	%0.00

Tablo 1: Kalıp çamaşır suyu sterilize Col-0 tohum düzeyde.

Çamaşır suyu	HCl	Zaman	% Klor gazı (mol Cl2/mol toplam gaz)
(mL)	(mL)	(h)
25	1	1	2.1
25	1	3	2.1
100	3	1	6.1
100	3	3	6.1
200	9	1	16,5
200	9	3	16,5

Tablo 2: Klor (Cl₂) gaz Columbia vahşi tipi tohumlar 7 L kapsayıcı'ı kullanarak sterilizasyon tedavisi.

Ek tablo 1: Konteyner ve % Cl₂farklı birimler için hesaplama gerçekleştirmek için programlanmış bir elektronik tablo. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Ne zaman Arabidopsis tohum steril ortamda büyüyen, sterilizasyon çeşit uygulanması gerekir. Çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon uygulamaları benzer çimlenme oranı ve kalıp büyüme inhibisyon içinde neden. Ben de sterilizasyon yöntemi ile yüksek çimlenme potansiyel tohum çimlenme fiyatına belirgin bir şekilde azaltılmasına neden olur; Ancak, çamaşır suyu sterilizasyon önemli sigara da olsa, çimlenme oranı artış gaz sterilizasyon için (şekil 3A) karşılaştırıldığında daha düşük çimlenme potansiyeli (20-%70), küçük, nedeniyle hatları için önerilir.

40-%100 10 dakikaya kadar için çamaşır suyu konsantrasyonları ile Arabidopsis tohum sterilize tatmin edici çimlenme yüzdeleri ve etkili kalıp bastırma sağlar. Her ne kadar % 40 daha az çamaşır suyu konsantrasyonu sağlamak yeterli sterilizasyon % 40 bir konsantrasyon veya daha yüksek garanti etkili sterilizasyon bile ağır kirlenmiş tohum birçok kullanarak çoğu tohum birçok için. Sterilizasyon 10 dk çamaşır suyu konsantrasyonlarının eşit kullanırken aşmayacak şekilde önemli veya yüksek tohum mortalite ve fide geliştirme hataları önlemek için % 80 daha yüksek.

Arabidopsis tohumları % 6,1 veya %16,5 1s sonuçlarında yüksek çimlenme oranları ve yeterli kalıp ortadan kaldırılması için klor gazı konsantrasyonları ile tedavi. Düşük klor gazı konsantrasyonu (% 2.1) süresi sterilizasyon 3 h artırarak başarıyla kullanılabilir.

Birkaç satır sterilize edilecek gerektiğinde, bir çözümde sıvı sterilizasyon % 50 çamaşır suyu 10 min için önerilir. Kadar satır hızlı ve kolay bir daha az manipülasyon ile sterilize beri için daha fazla sayıda satır gaz sterilizasyon %6.1 1 h için bir gaz konsantrasyon ile daha iyi bir seçenektir.

Bizim sonuçlar farklı genotip tohumları çok sayıda ve daha düşük çimlenme potansiyel ile tohum sterilizasyon için standart koşullar sağlar. Tek sınırlama bu sterilizasyon tekniklerin onlar tohum çimlenme oranı nedeniyle geniş tohum mortalite % 20 daha az için uygulanamaz olduğunu. Sonication¹⁷sterilizasyon yokluğu çimlenme oranını artırmak için gibi alternatif yöntemler bu gibi durumlarda yararlı olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.65 mL Microcentrifuge tubes	GeneMate	C-3260-5	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
1.7 mL Microcentrifuge tube	GeneMate	C-3262-1	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
7 L plastic container	Sistema	1016265438	Container in which gas sterilization is performed
Concentrated HCl	Sigma-Aldrich	320331	Chemical used in the process of creating chlorine gas
Disposable sterile inoculating loop	Fisher Scientific	22-363-603	Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019	Vitamin solution used in the process of making MS media
Household bleach	Clorox	Regular-Bleach	Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933	Chemical used in the process of making MS media
Micropore surgical tape	3M	1530-1	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524	Chemical used in the process of making MS media
Parafilm M	Bemis Company	#PM996	Parraffin film used to seal sterilization container
Petri dish 100 X 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
pH indicator strips	Whatman	2613991	Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution
Phytoagar	Fisher Scientific	50-255-212	Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Chemical used in the process of making MS media
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100	Chemical used in the process of liquid sterilization
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	CS70000 (Col-0)	Arabidopsis wild-type seeds
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_037606C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_041402C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_059101C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_063470C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072048C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072240C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081989C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_084124C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085049C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_089717C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107354C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110111C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111322C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113109C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114702C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114872C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115657C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_116803C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039445C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039782C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_043037C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_045828C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_048556C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049514C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049725C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080816C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081176C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081770C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082262C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082289C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082702C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083630C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_084635C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085337C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085656C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_093049C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_103332C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_105336C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_105704C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_106388C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_109575C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110580C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110617C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111424C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111584C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115837C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_019535C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_026478C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_046565C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049258C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_056307C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081292C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083488C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110573C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112793C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113658C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113904C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114673C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114709C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115455C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_013186C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_018261C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_062509C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080639C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_088586C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_096651C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_106900C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110131C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111051C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111245C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113223C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_121391C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_125097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_201905C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_210001C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_000662C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_029335C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_047760C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_071275C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080530C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_103881C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110864C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_120294C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_124390C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_132808C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_137036C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_139519C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_140643C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_142288C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_143304C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_147597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_209076C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081081C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107487C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2