Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

Resumen

Este protocolo describe la fabricación de una cinta pequeña, lista para usar que se puede aplicar para detección visual de varios ácidos nucleicos en una prueba individual, que es fácil de operar. En este enfoque, una gama capilar fue utilizada para la detección multiplex y altamente eficiente de los objetivos de la OMG.

Resumen

Múltiples destinos, a corto plazo y recursos asequibles metodologías para la detección de los ácidos nucleicos múltiples en un único, fácil de operar prueba se necesitan urgentemente en la diagnosis de la enfermedad, vigilancia microbiana, detección de organismo genéticamente modificado (OGM), y Análisis forense. Anteriormente hemos descrito la plataforma llamada calma (Capillary Array basado en Lprogramación orientada a objetos-mediada isoterma amplificación para Multiplex visual detección de ácidos nucleicos). Adjunto, describimos mejor fabricación y procesos de funcionamiento de esta plataforma. Aquí, aplicamos un casete pequeño, listo para su uso por matriz capilar para multiplex visual detección de ácidos nucleicos. La matriz capilar es pretratada en un patrón hidrofóbico e hidrofílico antes de fijar la amplificación isotérmica mediada lazo (lámpara) primer sets en tubos capilares. Después del montaje del adaptador de carga, mezcla de reacción de la lámpara es cargada y aislada en cada capilar, debido a la fuerza capilar por un solo paso de pipeteo. Las reacciones de la lámpara se realizan en paralelo en los capilares. Los resultados se leen visualmente hacia fuera iluminarse con una linterna de UV de mano. Usando esta plataforma, se demuestra control de 8 que con frecuencia aparecen elementos y genes en muestras de OMG con sensibilidad y alta especificidad. En Resumen, la plataforma descrita en este documento se pretende facilitar la detección de ácidos nucleicos múltiples. Creemos que será ampliamente aplicable en campos donde se requiere el análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento.

Introducción

Sistemas de bajo costo, rápidos y fácil de usar para la detección simultánea de varios ácidos nucleicos se necesitan urgentemente en una amplia gama de campos, tales como diagnósticos clínicos^1,2,3, detección de OGM^{4, 5,6}, microbiana control^7,8,9, análisis forense^10,11y pruebas especialmente point-of-care (POCTs), donde recursos son generalmente limitada^12,13,14.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo sus derivados métodos de PCR en tiempo real y PCR multiplex, es la técnica más ampliamente aplicada para la detección en estos campos. Sin embargo, estos métodos por lo general sólo detectan un objetivo en una prueba de¹⁵ y requieren electricidad y equipo sofisticado.

Otra tecnología prometedora para la detección de ácidos nucleicos es mediada por el ciclo isotérmica amplificación (lámpara), que primero fue descrita en 2000¹⁶. La lámpara es una método de detección de ADN de alta eficiencia. Teóricamente, puede amplificar de 1 copia a 10⁹ copias de amplicones dentro de una hora, todo se realiza a una temperatura constante, (es decir, entre 60-65 ° C). Exitosa amplificación producirá una gran cantidad del pirofosfato insolubles subproducto y causar un cambio en la turbidez¹⁷, que podría ser observado directamente por el ojo desnudo. También se pueden observar un cambio de color por la adición de iones metálicos o colorantes fluorescentes como calceína¹⁸ácido nucleico tinte¹⁹y del oxhidrilo naftol azul²⁰. Debido a las ventajas de alta sensibilidad y comodidad de operación, la lámpara se está aplicando ampliamente en la detección de ácidos nucleicos.

Actualmente, hay principalmente dos estrategias para los ensayos multiplexores de lámpara. Uno es para realizar múltiples ensayos de lámpara por tener múltiples lámpara cartilla establece en un tubo^21,,,²²²³. Sin embargo, la multiplicidad y la eficiencia de amplificación serían limitadas por la interferencia intrínseca y la competencia entre sistemas diferentes de primer. Además, puede ser difícil de identificar los diferentes productos de lámpara en la misma reacción. Otra estrategia se basa en el aislamiento físico. Primer diferentes conjuntos fueron aislados en compartimentos individuales, miniaturizados y múltiples reacciones de lámpara entonces se realizan simultáneamente^24,25. Estos enfoques, que generalmente se basan en chips de microfluídica, proporcionan una solución potencial para las reacciones de la lámpara de alto rendimiento. Sin embargo, la fabricación de los chips y la pre-capa múltiplex de primer conjuntos es complicado, que puede aumentar los costos y disminuir la reproducibilidad.

Recientemente, algunos estudios han descrito realizar reacciones de lámpara en tubos capilares para evadir la complicada fabricación de chips microfluídicos y lograron la detección de bajo costo^26,27. Sin embargo, con respecto al análisis de alto rendimiento, estos capilares son similares a las versiones en miniatura de PCR tira tubos, porque las muestras y los reactivos de la reacción (incluyendo el primer diferentes conjuntos) deben ser individualmente preparados y entregados a diferentes unidades de reacción dentro de los capilares. Para lograr el análisis paralelo y multiplex, equipo adicional, por ejemplo una bomba de jeringa multicanal, se requiere para carga paralelo de muestras o reactivos.

Para superar las limitaciones asociadas con los métodos actuales de detección multiplex de ácidos nucleicos, hemos desarrollado una plataforma miniaturizada que combina tecnología de lámpara visual con una gama capilar. Esta plataforma es multi-target, compacto, bajo costo y fácil de operar²⁸. Adjunto, describimos los detalles de cómo fabricar la matriz capilar y realizar las reacciones de la lámpara de la matriz. El protocolo descrito aquí ha sido estandarizado utilizando detección de organismo genéticamente modificado (OGM) como modelo. Lo importante, este protocolo también puede utilizarse en la detección de alto rendimiento de otros objetivos de ácidos nucleicos.

Protocolo

Nota: este protocolo asume que ya se hicieron el molde de acero inoxidable con la forma de los canales deseados de micro y el adaptador de carga (archivos 3D se ofrecen como suplemento de archivos de 1 y 2. ). Este protocolo asume que planta de ADN ya ha sido realizado.

1. fabricación del Cassette listo para su uso basado en el arreglo capilar

1. limpiar el molde de acero inoxidable.
   1. Lavar el molde de acero inoxidable por detergentes, etanol y agua desionizada para eliminar los contaminantes potenciales. Seque el molde por el nitrógeno.
2. Limpiar los capilares
   1. usar gafas de protección, guantes de protección química y uniforme laboratorio.
   2. Capilares de lugar en un vaso de precipitados. Limpiar los tubos capilares con acetona 30 mL por 5 min eliminar materia orgánica y luego lavar los capilares con agua desionizada.
      PRECAUCIÓN: Manipule acetona en una campana de humos.
   3. Vierta 10 mL de H ₂ O ₂ en el vaso y luego añadir 30 mL de H ₂ para que ₄ en el H ₂ O ₂ con lento agitando para evitar el sobrecalentamiento. Asegúrese de que la piraña (solución) cubre completamente los capilares durante al menos 30 min
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manejar solución Piraña (H ₂ SO 4/h ₂ O ₂ = 3: 1, v/v) _. Si se derrama la solución de pirañas, despoje la solución rápidamente con una gran cantidad de agua y limpie la superficie con toallas de papel.
      Nota: Limpieza a fondo de los tubos capilares es uno de los puntos clave para asegurar el éxito de la reacción de la lámpara. Es necesario agitar la botella de ácido durante el proceso de limpieza para eliminar las burbujas en los tubos capilares, y el tiempo de limpieza también puede ampliarse cuando sea necesario.
   4. Solución de lavado lejos la piraña con una gran cantidad de agua. Lavar tubos capilares con etanol y agua desionizada durante 5 minutos cada uno. Los capilares en un horno de secado en seco.
3. Pour polydimethylsiloxane (PDMS)
   1. peso a la base y curados reactivos de PDMS con un cociente de 1:1 en un tubo de 50 mL. Por lo general, mezclar 5 g de elastómero base 5 g elastómero agente endurecedor de.
   2. Revolver la mezcla bien durante unos 5 minutos con una varilla de vidrio. Coloque el tubo con PDMS en una campana de vacío durante 30 min para desgasificación.
   3. Verter lentamente el PDMS en el cilindro del molde de acero inoxidable. Permitir que el PDMS curar por 3 h en un horno de secado a 60 ° C
      Nota: tener cuidado para evitar burbujas de aire al verter el PDMS. Después de verter PDMS, deje que soporte durante 5 min para la eliminación natural de burbujas de PDMS.
4. Retire el molde del PDMS
   1. después de curar el PDMS, retire el molde sacando el molde con el cilindro. Quite el PDMS del cilindro mediante la reducción del margen del molde con un bisturí.
   2. PDMS de lavado tres veces con etanol y agua desionizada. El PDMS seco apoyar con nitrógeno.
5. Tratar la parte inferior del soporte PDMS ser hidrofóbico. Remojo el PDMS apoyar en un súper hidrofóbico capa seco s. 1 durante 10 min a temperatura ambiente.
6. Insertar el capilar en el soporte PDMS
   1. Inserte los tubos capilares de limpieza 4 mm en los agujeros del soporte PDMS y deja 0,5 mm de los tubos capilares fuera de la superficie superior del soporte PDMS. Asegúrese de que los extremos de los tubos capilares están al mismo nivel.
7. Tratamiento de la superficie externa de los capilares y la superficie superior del soporte PDMS ser hidrofóbico. Soporte
   1. capa súper hidrofóbico de añadir 15 μl sobre la superficie superior de los PDMS. Tenga en cuenta que la capa inmediatamente untar toda la superficie (incluyendo la superficie de la ayuda PDMS y las superficies exteriores de la parte expuesta de los capilares) por la fuerza capilar.
   2. Secar la matriz capilar modificada súper hidrofóbica.
8. Fijar la cartilla en matriz capilar
   1. preparar la solución de imprimación. Peso a 0,65 g de quitosano (fórmula molecular: (C ₆ H _{11 4}) _n) y disolver en 50 mL de agua desionizada ajustando el pH a 4.5-5.5 con ácido acético para obtener una concentración de quitosano de 1.3%. Preparar la mezcla de componentes de la cartilla según la tabla 1. Ver 1 tabla complementaria para imprimaciones
   2. 1.6 Añadir μl de la mezcla de un juego de primers para llenar un tubo capilar correspondiente de la matriz capilar según un orden previamente diseñado.
      Nota: Los restantes dos capilares en blanco fueron fijados como controles negativos.
   3. Ancla el conjunto en un transparente pozo de una placa de 96 pozos de fondo plano estándar y secar la matriz a 60 ° C durante al menos 2 h.

< td > 1.0/1.0

primer lámpara fijación de componentes de la mezcla (concentración inicial)	volumen (μL)
ddH 2 O	17.0
quitosano (1.3%)	1.0
primer FIP/BIP (20 μM)	2.0/2.0
LoopF/LoopB la cartilla (20 μM)
F3/B3 la cartilla (20 μM)	0.5/0.5
volumen Total	25.0

tabla 1: los componentes de la lámpara cartilla de fijación reactivos. Los componentes de la cartilla de lámpara fijación mezcla figuran en la columna izquierda de la tabla, y el volumen de cada componente se muestra en la columna de la derecha.

9. montar el casete como sigue. Coloque un adaptador de carga en la parte superior de la matriz anclada. Asegúrese de que el plato del adaptador sólo cubre las partes expuestas de los diez capilares (véase figura 1).

figura 1: el cassette fabricación y montaje. (un) inoxidable molde y los PDMS de apoyo. El molde consta de 3 partes: cilindro, Junta de presa y la placa de Pilar. (b) el esquema de PDMS soporte fabricación y montaje del cassette capilar. El proceso entero contiene 5 pasos: 1. PDMS verter, 2. molde retirar, 3. Insertar el tubo capilar y la capa superficial, 4. cartilla de fijación y 5. cinta de anclaje. 1. verter PDMS en cilindro del molde; 2. Empuje hacia fuera de la Junta de presa para eliminar el moho de PDMS de apoyo; 3. capa de la superficie abajo de PDMS apoyan y luego inserte los tubos capilares en el PDMS apoyar, por último cubrir la superficie superior del soporte PDMS y expuesto los tubos capilares. La línea azul gruesa indica capa súper hidrofóbico; 4. Cargue la cartilla en capilares individuales; 5. anclaje de la matriz capilar en una sola placa de 96 pozos e instalar una muestra de carga del adaptador en la misma. Los detalles se han descrito en los pasos de protocolo 1.1-1.9. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. reacción del rendimiento de la lámpara de matriz capilar

1. Prepare la mezcla de reacción
   1. preparar la mezcla de reacción de la lámpara según T capaz de 2.
   2. Reactivos de agregar a la mezcla según el orden elegido, como en la tabla 2 y agitar la mezcla de reacción durante 5 s después de agregar calceína. Suavemente enVert se añade el tubo 20 veces después de polimerasa del Bst.

componentes de la lámpara (concentración inicial)	volumen (μL)
ddH 2 O	11.6
MgSO 4 (100 mM)	2.0
dNTPs (25 mM)	1.4 < /t d >
betaína (5 M)	4.0
(10 x) de búfer	2.5
calceína (1,25 mM)	0,5
MnCl 2 (25 mM)	0,5
Bst < /em > polimerasa (8 U/μL)	1.5
ADN de la planta (10 ng/μL)	1.0
volumen Total	25.0

Tabla 2: El sistema de reacción de la lámpara de arreglo capilar. Los componentes del sistema de reacción de los componentes de la lámpara de matriz capilar se enumeran en la columna de la izquierda, y el volumen de cada componente es en la columna de la derecha.

2. cargar los reactivos y la cinta del sello
   1. mezcla de reacción de lámpara pipeta de 20 μl con un estándar 100 μl Punta. Introduzca la punta en la entrada del adaptador de carga para asegurarla. Inyectar suavemente la mezcla de reacción en el plato de adaptador; la mezcla de reacción se rápidamente llenar el plato y luego cargar los capilares automáticamente a través de la fuerza capilar.
   2. Quitar el adaptador con la punta cerrada y sellar el pozo por una película transparente compatible con PCR.
      Nota: Sólo los capilares tocando la mezcla de reacción en el plato hidrofílico podrían llenarse. Así que asegúrese de que la parte superior de todos los capilares es de la misma altura (ver figura 2).

figura 2: Diagrama de carga de muestra utilizando el adaptador de carga. La imagen muestra el proceso de carga empleando solución azul como ejemplo. Introduzca la punta en la entrada inyecte lentamente la muestra en el adaptador y luego retire el adaptador con la punta cerrada. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. incubar la matriz capilar en una incubadora a 63 ° C por 1 h.

3. lectura de resultados y análisis de datos

1. adquirir imágenes de la emisión de fluorescencia.
   1. Fijar un filtro UV en la superficie superior de una pequeña linterna de mano LED UV para filtrar la luz visible.
   2. Excitar la calceína disociado para emitir fluorescencia con la linterna UV. Capturar imágenes desde la parte superior de la matriz capilar por una cámara digital o un teléfono inteligente.
   3. Cuando se toma una imagen, asegúrese de que la cámara es el zoom el área de los capilares tanto como sea posibles obtener alta calidad, imágenes claras.
2. Analizar los resultados
   1. Abra el software de análisis de imagen por imagen y luego seleccione " imagen > molde > en escala de grises > sí " y " imagen > molde > 16 bits > sí ". Seleccionar " archivo > guardar como > formato > TIFF " para convertir la imagen en formato TIFF de 16 bits.
   2. Extraer el valor de la intensidad de la fluorescencia
      1. abierto el software de análisis de microarrays. Arrastre la imagen de formato TIFF de 16 bits en la interfaz del programa y seleccione la longitud de onda " 532 nm " y un color de " verde " para mostrar la imagen.
      2. Crear un nuevo bloque para localizar la señal de fluorescencia de los capilares. Seleccione " herramientas > nuevos bloques " y de entrada el número de columnas y filas como " 1; 1 " y " 2; 5 " en el ' bloques ' y ' características ' interfaces por separado.
      3. Derecho haga clic en y seleccione " características " del modelo y ajuste la ubicación y el diámetro para adaptarse a la zona de fluorescencia de los capilares. Seleccione " analizar " para extraer el valor de la intensidad de la fluorescencia.
      4. Seleccionar " archivo > guardar configuración como " para guardar los documentos de bloques y seleccionar " archivo > guardar los resultados como " para guardar la fluorescencia intensidad resultados. Calcular la SNR para definir si la lámpara se realiza con éxito en los tubos capilares.
         Nota: Las señales de los capilares se obtuvieron por la grabación de que los valores de gris de las manchas y señal a proporción de ruido (SNR) se definieron como cocientes de valores medios de las señales de primer plano de los objetivos a valores promedio de las señales de primer plano de la negativa de dos controles. El atajo para determinar señales positivas fue fijado como SNR > 2.

Resultados

En este método, es importante evitar la contaminación cruzada entre diferentes capilares durante la carga de la muestra. Para ello, quitosano fue introducido, que podría conservar los iniciadores en los tubos capilares. Para probar si funcionaba o no, fija previamente la cartilla de ADH1 (gen referencia endógeno de maíz) en el cartucho capilar con el patrón de la "T" y "U", como se muestra en figura 3a. Como se espera...

Discusión

La plataforma calma demostrado aquí, que combina la tecnología de lámpara con una matriz capilar, permite la detección simultánea de múltiples objetivos de genes relacionados con OMG en una única, altamente eficaz y fácil de operar prueba.

Para realizar con éxito las reacciones multiplexores de la lámpara en el cassette, tres puntos críticos deben ser notado. En primer lugar, alcanzar la misma altura de la parte superior de los capilares y el patrón hidrofílico e hidrofóbico de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat)	UltraTech	4001	supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS	Dow Corning	8332557
Bst polymerase	New England BioLabs	M0275L
betain	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
calcein	Sigma-Aldrich	C0875-5G
MnCl2	Sigma-Aldrich	MKBP0495V
MgSO4	New England BioLabs	B1003S
dNTPs	Shanghai Sangon	B804BA0022
chitosan	Shanghai Sangon	LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software	Adobe Systems Inc., CA, USA		Image analysis
GenePix Pro 6.1	Molecular Devices, CA, USA		microarray analysis software
AutoCAD	Adobe Systems Inc.		3D construction software
UV filter (ZWB2)	YXSensing		supplier : taobao