Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Riepilogo

Questo protocollo descrive la realizzazione di una cassetta piccola, ready-to-use che possa essere applicata per rilevamento visivo degli acidi nucleici multipli in un singolo, test che è facile da usare. In questo approccio, una matrice capillare è stata utilizzata per il rilevamento di multiplex e altamente efficiente di bersagli di OGM.

Abstract

Multi-target, breve periodo di tempo e risorse-affordable metodologie per la rilevazione degli acidi nucleici multipli in un unico, facile da usare prova sono urgentemente necessari nella diagnosi della malattia, monitoraggio microbico, rilevamento di organismi geneticamente modificati (OGM), e analisi forense. Precedentemente abbiamo descritto la piattaforma chiamata calma (Capillary Abase di rray Loop-amplificazione isotermica mediata da per Multiplex rilevamento visivo degli acidi nucleici). Qui, descriviamo una migliore processi di fabbricazione e le prestazioni per questa piattaforma. Qui, applichiamo una cassetta piccola, ready-to-use, assemblata da matrice capillare per multiplex rilevamento visivo degli acidi nucleici. La matrice capillare è pre-trattata in un modello idrofobico e idrofilico prima set di primer di amplificazione isotermica mediata da loop (lampada) di fissaggio nei capillari. Dopo il montaggio della scheda di caricamento, la miscela di reazione di lampada è caricato e isolato in ogni capillare, a causa della forza capillare con un solo passaggio di pipettaggio. Le reazioni di lampada vengono eseguite in parallelo nei capillari. I risultati sono visivamente leggere di illuminazione con una torcia UV portatile. Utilizzando questa piattaforma, dimostriamo che il monitoraggio di 8 che frequentemente compaiono elementi e geni nei campioni di OGM con sensibilità e alta specificità. In sintesi, la piattaforma descritta nel presente documento è destinata a facilitare la rilevazione degli acidi nucleici più. Crediamo che sarà ampiamente applicabile nei campi dove è richiesta l'analisi di acidi nucleici ad alta velocità.

Introduzione

Sistemi di basso costo, veloce e facile da usare per la rilevazione simultanea di più acidi nucleici sono urgentemente necessari in una vasta gamma di settori, quali la diagnostica clinica^1,2,3, OGM rilevazione^{4, 5,6}, microbica monitoraggio^7,8,9, analisi forense^10,11e soprattutto di point-of-care test (POCTs), dove le risorse sono limitati solitamente^12,13,14.

Reazione a catena della polimerasi (PCR), compresi i suoi metodi derivati Real-Time PCR e PCR multiplex, è la tecnica più ampiamente applicata per il rilevamento in questi campi. Tuttavia, questi metodi in genere solo rilevare un target in uno prova¹⁵ e richiedono elettricità e sofisticate attrezzature professionali.

Un'altra tecnologia promettente per la rilevazione degli acidi nucleici è amplificazione isotermica mediata da Loop (lampada), che è stato descritto nel 2000¹⁶. LAMPADA è un metodo di rilevazione del DNA di alta efficienza. Teoricamente, può amplificare da 1 copia a 10⁹ copie degli ampliconi entro un'ora, tutte eseguite a temperatura costante, (cioè, tra 60-65 ° C). Amplificazione di successo produrrà una grande quantità di pirofosfato del sottoprodotto insolubile e causa un cambiamento della torbidità¹⁷, che potrebbe essere direttamente osservata ad occhio nudo. Un cambiamento di colore può essere osservato anche con l'aggiunta di ioni metallici o coloranti fluorescenti quali¹⁸calceina, acido nucleico tintura¹⁹e idrossile naftolo blu²⁰. Per i vantaggi di alta sensibilità e la convenienza di funzionamento, lampada viene ampiamente applicato nella rilevazione dell'acido nucleico.

Attualmente, ci sono principalmente due strategie per multiplex lampada saggi. Uno è quello di eseguire le analisi multiple lampada avendo più lampada primer imposta in uno tubo^21,22,23. Tuttavia, la molteplicità e l'efficienza di amplificazione sarebbe limitati dalle interferenze intrinseche e dalla concorrenza tra insiemi differenti dell'iniettore. Inoltre, può essere difficile identificare diverse lampada prodotti nella reazione stessa. Un'altra strategia è basata sull'isolamento fisico. Insiemi differenti dell'iniettore sono stati isolati in singoli compartimenti miniaturizzati e reazioni multiple lampada quindi vengono eseguite contemporaneamente^24,25. Questi approcci, che sono generalmente basati sul chip microfluidici, forniscono una soluzione potenziale per le reazioni di lampada di alto-rendimento. Tuttavia, la fabbricazione dei chip e il multisala pre-rivestimento di insiemi dell'iniettore è complicato, che può aumentare i costi e diminuire la riproducibilità.

Recentemente, alcuni studi hanno descritto performanti lampada reazioni nei capillari di bypassare la fabbricazione complicata di chip microfluidici e hanno raggiunto il rilevamento di basso costo^26,27. Tuttavia, per quanto riguarda l'analisi di alto-rendimento, questi capillari sono simili alle versioni in miniatura di provette per PCR striscia, perché i campioni e reagenti di reazione (compresi gli insiemi differenti dell'iniettore) devono essere individualmente preparati e consegnati a diversi unità di reazione all'interno dei capillari. Per ottenere analisi parallela e multiplex, attrezzature supplementari, ad esempio una pompa a siringa multicanale, sono richiesta per il caricamento parallelo dei campioni o reagenti.

Per superare le limitazioni connesse con i metodi correnti per multiplex rilevazione degli acidi nucleici, abbiamo sviluppato una piattaforma miniaturizzata che combina tecnologia lampada visiva con una matrice capillare. Questa piattaforma è multi-target, compatto nelle dimensioni, basso costo e facile da usare di²⁸. Qui, descriviamo i dettagli di come fabbricare la matrice capillare ed eseguire le reazioni lampada nella matrice. Il protocollo descritto qui è stato standardizzato mediante rilevamento di organismi geneticamente modificati (OGM) come un modello. D'importanza, questo protocollo utilizzabile anche nella rilevazione di alto-rendimento di altri obiettivi di acido nucleico.

Protocollo

Nota: questo protocollo presuppone che lo stampo in acciaio inox la forma per i micro-canali desiderati e l'adattatore di carico del cuscinetto sono già state apportate (file 3D vengono forniti come supplementare file 1 e 2. ). Questo protocollo si presuppone inoltre che pianta isolamento del DNA è già stata effettuata.

1. montaggio della cassetta Ready-to-use basato su matrice capillare

1. pulire lo stampo di acciaio inox.
   1. Lavare lo stampo di acciaio inox di detersivo, etanolo ed acqua deionizzata per rimuovere i contaminanti potenziali. Asciugare lo stampo dall'azoto.
2. Pulire i capillari
   1. indossare sempre occhiali protettivi, guanti di protezione uniforme e chemical lab.
   2. Capillari posto in un becher. Pulire i capillari con 30 mL di acetone per 5 min rimuovere la materia organica e quindi lavare i capillari con acqua deionizzata.
      Attenzione: Maneggiare acetone in una cappa aspirante.
   3. Versare 10 mL di H ₂ O ₂ nel contenitore e quindi aggiungere 30 mL di H ₂ così ₄ in H ₂ O ₂ con lenta agitazione per evitare il surriscaldamento. Assicurarsi che la soluzione (soluzione piranha) copre completamente i capillari per almeno 30 min.
      Attenzione: Fare attenzione durante la manipolazione di soluzione piranha (H ₂ SO 4/h ₂ O ₂ = 3: 1, v/v) _. Se la soluzione piranha è stata versata, lavare via la soluzione rapidamente con una grande quantità di acqua e pulire la superficie con carta assorbente.
      Nota: Pulizia accurata dei capillari è uno dei punti chiave per la riuscita della reazione lampada. È necessario agitare il cilindro acido durante il processo di pulizia per rimuovere le bolle nei capillari, e il tempo di pulizia può essere esteso anche quando richiesto.
   4. Lavare via la soluzione piranha con una grande quantità di acqua. Lavare i capillari con etanolo ed acqua deionizzata per 5 minuti ciascuno. Asciugare i capillari in un forno di essiccazione.
3. Pour polidimetilsilossano (PDMS)
   1. peso fuori reagenti di base e polimerizzazione di PDMS con un rapporto di 1:1 in una provetta da 50 mL. In genere, mescolare 5 g di elastomero a base di 5 g di elastomero agente indurente.
   2. Mescolare accuratamente per circa 5 minuti con una bacchetta di vetro. Posizionare il tubo con PDMS in una campana di vetro vuoto per 30 min per degassamento.
   3. Versare lentamente il PDMS nel cilindro dello stampo in acciaio inox. Consentire il PDMS curare per 3 h in un forno a 60 ° C
      Nota: fare attenzione a evitare bolle d'aria quando si versa PDMS. Dopo aver versando PDMS, lasciarla stand per 5 min per una rimozione naturale delle bolle di PDMS.
4. Rimuovere la muffa da PDMS
   1. dopo l'indurimento il PDMS, rimuovere la muffa tirando fuori lo stampo con il cilindro. Rimuovere PDMS dal cilindro tagliando il margine dello stampo con un bisturi.
   2. PDMS lavare tre volte con etanolo ed acqua deionizzata. Asciutto il PDMS supporto con azoto.
5. Trattare la superficie inferiore del supporto PDMS essere idrofobo. Ammollo il PDMS supportano in un super-idrofobici ricoprirlo per 1 s. a secco per 10 min a temperatura ambiente.
6. Inserire il capillare nel supporto PDMS
   1. inserire i capillari puliti 4 mm nei fori del supporto PDMS e lasciare 0,5 mm dei capillari all'esterno della superficie superiore del supporto PDMS. Assicurarsi che le estremità dei capillari sono sullo stesso livello.
7. Trattare la superficie esterna dei capillari e la superficie superiore del supporto PDMS essere idrofobo. Supporto
   1. cappotto superidrofobica di aggiungere 15 µ l sulla superficie superiore del PDMS. Si noti che il rivestimento immediatamente si diffonde su tutta la superficie superiore (tra cui la superficie superiore del supporto PDMS e le superfici esterne della parte esposta dei capillari) di forza capillare.
   2. Aria a secco del superidrofobica modifica matrice capillare.
8. Difficoltà primer in matrice capillare
   1. preparare soluzione primer. Peso fuori 0,65 g chitosano (formula molecolare: (C ₆ H ₁₁ n. ₄) _n) e scioglierla in 50 mL di acqua deionizzata, regolando il pH 4.5-5.5 con acido acetico per ottenere una concentrazione di chitosano dell'1,3%. Preparare il mix di componenti di primer come da tabella 1. Vedere complementare tabella 1 per primer
   2. aggiungere 1,6 µ l della miscela di un set di primer per riempire uno vaso capillare corrispondente della matrice capillare secondo un ordine pre-progettato.
      Nota: I restanti due capillari in bianco sono stati impostati come controlli negativi.
   3. Ancorare la matrice in un pozzo trasparente di una piastra a 96 pozzetti fondo piatto standard e asciugare la matrice a 60 ° C per almeno 2 h.

< td > 1.0/1.0

primer lampada fissaggio componenti della miscela (concentrazione iniziale)	Volume (μL)
ddH 2 O	17,0
chitosano (1,3%)	1.0
fondo FIP/BIP (20 μM)	2.0/2.0
LoopF/loopback primer (20 μM)
fondo F3/B3 (20 μM)	0,5/0,5
volume totale	25.0

tabella 1: I componenti della lampada Primer fissaggio reagenti. I componenti di primer lampada mix di fissaggio sono elencati nella colonna sinistra della tabella, e il volume di ogni componente è elencato nella colonna di destra.

9. montare la cassetta come segue. Mettere un adattatore di carico sulla parte superiore della matrice ancorati. Assicurarsi che il piatto dell'adattatore copre solo le parti esposte di tutte le dieci capillari (Vedi Figura 1).

Figura 1: l'assemblaggio e fabbricazione di cassetta. supporto (un) inox stampo e il PDMS. Lo stampo è costituito da 3 parti: cilindro, diga Consiglio e piastra di pilastro. (b), lo schema di PDMS supporto realizzazione e montaggio della cassetta capillare. L'intero processo contiene 5 passi: 1. PDMS versando, 2. muffa rimozione, 3. capillare inserimento e rivestimento di superficie, 4. primer fissaggio e 5. Cassetta di ancoraggio. 1. versare PDMS nel cilindro dello stampo; 2. Spingere il bordo della diga per rimuovere lo stampo da PDMS supporto; 3. cappotto la superficie giù di PDMS supporto e quindi inserire i capillari il PDMS sostenere, infine ricoprire la superficie superiore del supporto PDMS ed esposti vasi capillari. La linea blu spessa indica superidrofobica cappotto; 4. caricare primer impostato nei singoli vasi capillari; 5. ancorare la matrice capillare in una singola piastra a 96 pozzetti e installare un adattatore su di esso di carico del campione. I dettagli sono stati descritti in passaggi protocollo 1.1-1.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. reazione di prestazioni della lampada nella matrice capillare

1. preparare la miscela di reazione
   1. preparare la miscela di reazione lampada secondo T in grado 2.
   2. Reagenti Aggiungi alla miscela secondo l'ordine scelto, come in tabella 2 e vortice la miscela di reazione per 5 s dopo l'aggiunta di calceina. Delicatamente inVert è aggiunto il tubo 20 volte dopo della polimerasi Bst.

componenti per le lampade (la concentrazione iniziale)	Volume (μL)
ddH 2 O	11,6
MgSO 4 (100 mM)	2.0
dNTP (25mm)	1.4 < / t d >
betaina (5m)	4.0
(10x) del Buffer	2.5
calceina (1,25 mM)	0,5
MnCl 2 (25 mM)	0,5
Bst < /em > polimerasi (8 U/μL)	1.5
del DNA della pianta (10 ng/μL)	1.0
volume totale	25.0

Tabella 2: Il sistema di reazione della matrice capillare-lampada. i componenti del sistema di reazione di componenti per le lampade matrice capillare sono elencati nella colonna sinistra, e il volume di ogni componente è elencato nella colonna di destra.

2. caricare i reagenti e sigillare la cassetta
   punta di
   1. miscela di reazione di Pipettare 20 µ l lampada con un campione di 100 µ l. Inserire la punta nell'ingresso della scheda di caricamento per bloccarlo. Iniettare delicatamente la miscela di reazione per il piatto di adattatore; la miscela di reazione verrà rapidamente riempire il piatto e poi caricare i capillari automaticamente attraverso la forza capillare.
   2. Rimuovere l'adattatore con la punta chiusa e sigillare il pozzo di una pellicola sigillante trasparente compatibile con PCR.
      Nota: Solo i capillari toccando la miscela di reazione nel piatto idrofila potevano essere riempiti. Quindi assicuratevi che il lato superiore di tutti i capillari è della stessa altezza (Vedi Figura 2).

Figura 2: schema di caricamento dei campioni mediante l'adattatore per caricamento. L'immagine mostra il processo di caricamento, impiegando la soluzione di colore blu come un esempio. Inserire la punta nell'ingresso e iniettare lentamente il campione nell'adattatore e quindi rimuovere l'adattatore con punta bloccata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Incubare la matrice capillare in un incubatore a 63 ° C per 1 h.

3. risultati della lettura e analisi dei dati

1. acquisire immagini dell'emissione di fluorescenza.
   1. Fissare un filtro UV sulla superficie superiore di una piccola torcia portatile UV LED per filtrare la luce visibile.
   2. Eccitare la calceina dissociata di emettere fluorescenza con la torcia elettrica UV. Catturare immagini dalla parte superiore della matrice capillare da una fotocamera digitale o da uno smartphone.
   3. Quando si scatta un'immagine, assicurarsi che la fotocamera è ingrandita sulla zona dei capillari per quanto possibili ottenere alta qualità, immagini chiare.
2. Analizzare i risultati
   1. aprire il software di analisi di immagine e quindi selezionare " immagine > stampo > in scala di grigi > Sì " e " immagine > stampo > 16 bit > Sì ". Selezionare " File > salvare come > formato > TIFF " per convertire l'immagine in formato TIFF 16 bit.
   2. Estrarre il valore di intensità di fluorescenza
      1. Apri il software di analisi di microarray. Trascinare l'immagine in formato TIFF 16 bit nell'interfaccia del software e quindi selezionare la lunghezza d'onda di " 532 nm " e un colore di " verde " per visualizzare l'immagine.
      2. Crea un nuovo blocco per individuare il segnale di fluorescenza dai vasi capillari. Selezionare " strumenti > nuovi blocchi " e immettere il numero di colonne e righe come " 1; 1 " e " 2; 5 " alla ' blocchi ' e ' caratteristiche ' interfacce separatamente.
      3. In fare clic su e selezionare " caratteristiche " modello e quindi regolare la posizione e il diametro per adattarsi all'area di fluorescenza dei capillari. Selezionare " Analyze " per estrarre il valore di intensità di fluorescenza.
      4. Selezionare " File > salvare le impostazioni come " per salvare i documenti di blocchi e selezionare " File > salvare i risultati come " per salvare la fluorescenza intensità risultati. Calcolare il SNR per definire se la lampada viene eseguita con successo nei capillari.
         Nota: I segnali dei capillari sono stati ottenuti registrando che i valori di grigio dei punti e segnale per rapporti di rumore (SNRs) sono stati definiti come rapporti dei valori medi dei segnali di primo piano delle destinazioni da media valori medi dei segnali di primo piano del negativo due controlli. Il cut-off per determinare segnali positivi è stato impostato come SNR > 2.

Risultati

In questo metodo, è importante evitare la contaminazione incrociata tra diversi capillari durante il caricamento del campione. Per questo scopo, è stato introdotto il chitosano, che potrebbe mantenere i primer in singoli vasi capillari. Per verificare se ha funzionato o no, abbiamo pre-fissato il primer (gene di riferimento endogeno del mais) ADH1 impostato nella cassetta capillare con il modello di "T" e "U", come illustrato Figura 3a.

Discussione

La piattaforma calma dimostrata qui, che combina la tecnologia della lampada con una matrice capillare, permette la rilevazione simultanea di più OGM-relativi geni bersaglio in un unico, altamente efficace e facile da usare prova.

Per eseguire correttamente le reazioni lampada multiplex nel cassetto, tre punti critici devono essere notato. In primo luogo, ottenere la stessa altezza per il lato superiore dei capillari e il modello idrofile e idrofobe della matrice capillare sono critici per ca...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat)	UltraTech	4001	supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS	Dow Corning	8332557
Bst polymerase	New England BioLabs	M0275L
betain	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
calcein	Sigma-Aldrich	C0875-5G
MnCl2	Sigma-Aldrich	MKBP0495V
MgSO4	New England BioLabs	B1003S
dNTPs	Shanghai Sangon	B804BA0022
chitosan	Shanghai Sangon	LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software	Adobe Systems Inc., CA, USA		Image analysis
GenePix Pro 6.1	Molecular Devices, CA, USA		microarray analysis software
AutoCAD	Adobe Systems Inc.		3D construction software
UV filter (ZWB2)	YXSensing		supplier : taobao