Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer kleinen, Ready-to-Use Kassette, die für die visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Einzeltest können, die einfach angewendet werden zu bedienen ist. Bei diesem Ansatz wurde ein Kapillar Array für multiplex und hocheffiziente Nachweis von GVO Ziele verwendet.

Zusammenfassung

Multi-Target, kurze Zeit und Ressource-kostengünstige Methoden zum Nachweis von mehreren Nukleinsäuren in einem einzigen, einfach zu bedienen Test sind dringend notwendig, in der Diagnose von Krankheiten, mikrobielle Überwachung, gentechnisch veränderter Organismus (GVO)-Erkennung, und forensische Analysen. Zuvor haben wir die Plattform namens Ruhe (CApillary ARray-basierten LOop-vermittelten isothermen Verstärkung für MUltiplex visuelle Erkennung von Nukleinsäuren) beschrieben. Hier beschreiben wir verbesserte Fertigung und Leistungsprozesse für diese Plattform. Hier wenden wir eine kleine, Ready-to-Use Kassette von Kapillar Array für Multiplex-visuelle Erkennung von Nukleinsäuren montiert. Das Kapillare Array ist vor der Befestigung Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Grundierung Sätze in Kapillaren vorbehandelt in einer hydrophoben und hydrophilen Muster. Nach der Montage des Adapters laden Lampe Reaktionsgemisch geladen und isoliert in jede Kapillare durch Kapillare Kraft von einem Arbeitsschritt pipettieren. Die Lampe Reaktionen erfolgen parallel in den Kapillaren. Die Ergebnisse werden visuell durch Beleuchtung mit einer handgeführten UV-Taschenlampe ausgelesen. Mit Hilfe dieser Plattform, zeigen wir die Überwachung von 8 häufig erscheinende Elemente und Gene in GVO Proben mit hoher Spezifität und Sensitivität. Zusammenfassend lässt sich sagen die hierin beschriebene Plattform sollen die Aufdeckung von mehreren Nukleinsäuren zu erleichtern. Wir glauben, es wird breit einsetzbar in Bereichen wo Hochdurchsatz-Nukleinsäure-Analyse erforderlich ist.

Einleitung

Kostengünstige, schnelle und einfach zu bedienen-Systeme für die simultane Detektion von mehreren Nukleinsäuren werden in den unterschiedlichsten Bereichen wie klinische Diagnostik^1,2,3, GVO-Erkennung^{4dringend, 5,6}, mikrobielle Überwachung^7,8,9, forensische Analysen^10,11und vor allem Point-of-Care-Tests (POCTs), wo Ressourcen sind in der Regel^12,13,14.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einschließlich seiner abgeleiteten Methoden Real-Time PCR und Multiplex-PCR, ist die am häufigsten angewandte Technik zur Erkennung in diesen Bereichen. Aber diese Methoden erkennen in der Regel nur ein Ziel in einem Test¹⁵ und sie benötigen Strom und anspruchsvolle professionelle Ausrüstung.

Eine weitere viel versprechende Technologie zur Erkennung von Nukleinsäuren ist Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe), die erstmals im Jahr 2000¹⁶beschrieben wurde. Lampe ist eine hocheffiziente Methode der DNA-Nachweis. Theoretisch kann es ab 1 Exemplar 10⁹ Kopien der Amplifikate innerhalb einer Stunde alle durchgeführt bei einer konstanten Temperatur (d.h.zwischen 60-65 ° C) verstärken. Erfolgreiche Verstärkung produzieren eine große Menge an unlöslichen Nebenprodukt Pyrophosphat und bewirken eine Trübung¹⁷, die direkt mit dem bloßen Auge beobachtet werden konnte. Eine Farbänderung kann auch durch die Zugabe von Metallionen oder fluoreszierende Farbstoffe wie Calcein¹⁸, Nukleinsäure-Farbstoff¹⁹und Hydroxyl-Naphthol Blau²⁰beobachtet werden. Aufgrund der Vorteile der hohen Empfindlichkeit und Bedienkomfort ist Lampe weithin in Nukleinsäure-Erkennung eingesetzt.

Derzeit gibt es im Wesentlichen zwei Strategien für Multiplex-Lampe-Assays. Eine mehrere Lampe Tests durchführen, indem er mehrere Lampe soll Primer setzt in einem Rohr^21,22,23. Jedoch würde die Vielzahl und die Effizienz der Verstärkung durch die inneren Störungen und Wettbewerb zwischen den verschiedenen Grundierung Sätze begrenzt werden. Darüber hinaus ist es schwierig, verschiedene LAMP-Produkte in der gleichen Reaktion zu identifizieren kann. Eine andere Strategie basiert auf physische Isolierung. Verschiedene Primer-Sets wurden in einzelnen miniaturisierte Kompartimente isoliert, und mehrere Lampe Reaktionen erfolgen dann gleichzeitig^24,25. Diese Ansätze, die in der Regel auf mikrofluidischen Chips basieren, bieten eine mögliche Lösung für Hochdurchsatz-Lampe Reaktionen. Die Herstellung der Chips und die Multiplex-Pre-Beschichtung der Primer-Sets ist jedoch kompliziert, kann die Kosten erhöhen und Reproduzierbarkeit zu verringern.

Vor kurzem, haben einige Studien beschrieben leistungsstarke Lampe Reaktionen in Kapillaren zu umgehen die komplizierte Herstellung von mikrofluidischen Chips und kostengünstige Erkennung^26,27erreicht haben. Sind jedoch in Bezug auf Hochdurchsatz-Analyse, diese Kapillaren ähnlich wie Miniaturausgaben der PCR-Streifen Röhren, weil die Proben und Reaktion Reagenzien (einschließlich der verschiedenen Primer-Sets) müssen individuell vorbereitet und an verschiedenen geliefert Reaktionseinheiten in Kapillaren. Um parallel und Multiplex-Analyse zu erreichen, ist Zusatzausstattung, z. B. eine Mehrkanal-Spritzenpumpe für parallel Laden von Proben oder Reagenzien benötigt.

Um die Grenzen verbunden mit den aktuellen Methoden für Multiplex-Detektion von Nukleinsäuren zu überwinden, haben wir eine miniaturisierte Plattform entwickelt die visuelle Lampentechnologie mit einem Kapillar Array kombiniert. Diese Plattform ist Multi-Target, kompakt, kostengünstig und einfach zu bedienen²⁸. Hier beschreiben wir die Details wie das Kapillare Array herzustellen und die Lampe Reaktionen im Array durchführen. Das hier beschriebene Protokoll wurde mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) Erkennung als Modell vereinheitlicht. Wichtig ist, kann dieses Protokoll auch im Hochdurchsatz-Erkennung von anderen Nukleinsäure-Ziele verwendet werden.

Protokoll

Hinweis: dieses Protokoll setzt voraus, dass die Edelstahl Form trägt die Form für die gewünschten Mikro-Kanäle und den Laden-Adapter bereits geleistete (3D Dateien dienen als zusätzliche Dateien 1 und 2. ). Dieses Protokoll auch nimmt an, dass die Pflanze DNA-Isolierung bereits durchgeführt worden.

1. Herstellung der Kapillare Array-basierte Ready-to-Use Kassette

1. Edelstahl-Schimmel reinigen.
   1. Edelstahl-Schimmel durch Reinigungsmittel, Ethanol und deionisiertes Wasser waschen, um möglichen Verunreinigungen zu entfernen. Die Form von Stickstoff trocknen.
2. Reinigen die Kapillaren
   1. tragen Schutzbrillen, einheitliche und chemische Schutzhandschuhe Lab.
   2. Ort-Kapillaren in einen Becher füllen. Reinigen Sie die Kapillaren mit 30 mL Aceton für 5 min, organischen Substanz zu entfernen, und dann waschen Sie die Kapillaren mit entionisiertem Wasser.
      Achtung: Behandeln Aceton in einer Dampfhaube.
   3. 10 mL H ₂ O ₂ in das Becherglas gießen und dann 30 mL H ₂ SO ₄ H ₂ O ₂ mit langsam schütteln, um eine Überhitzung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass Piranha (Lösung) der Kapillaren für mindestens 30 Minuten vollständig abdeckt
      Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Piranha-Lösung (H ₂ SO 4/h ₂ O ₂ = 3: 1, V/V) _. Wenn die Piranha-Lösung verschüttet wird, die Lösung schnell mit viel Wasser wegspülen und wischen Sie die Oberfläche mit Papiertüchern.
      Hinweis: Gründliche Reinigung der Kapillaren ist einer der entscheidenden Punkte für den Erfolg des LAMP-Reaktion. Es ist notwendig, die Säuren Zylinder während des Reinigungsvorgangs der Blasen in Kapillaren entfernen zu schütteln, und saubere Zeit kann auch verlängert werden, wenn erforderlich.
   4. Wäscht die Piranha-Lösung mit einer großen Menge Wasser. Waschen Sie Kapillaren mit Ethanol und deionisiertes Wasser für 5 min. Die Kapillaren in einem Trockenschrank trocknen.
3. Pour Polydimethylsiloxan (PDMS)
   1. Gewicht, PDMS Basis und Aushärtung Reagenzien mit einem Verhältnis von 1:1 in ein 50 mL-Tube. In der Regel mix 5 g Elastomer Basis bis 5 g des Elastomers Härtemittel.
   2. Rühren Sie die Mischung gründlich für ca. 5 min mit einem Glasstab. Legen Sie das Rohr mit PDMS in ein Vakuum Glasglocke für 30 min für Entgasung.
   3. Die PDMS Gießen Sie langsam in den Zylinder des Schimmels aus rostfreiem Stahl. Ermöglichen die PDMS für 3 h in einem Trockenschrank bei 60 ° C zu heilen
      Hinweis: Achten Sie darauf, um Luftblasen zu vermeiden, beim Gießen PDMS. Nach dem Gießen PDMS, lassen Sie es stehen für 5 min für natürliche entfernen der Luftblasen aus PDMS.
4. Entfernen Sie den Schimmel von PDMS
   1. nach dem Aushärten der PDMS, entfernen Sie den Schimmel durch den Schimmel mit Zylinder herausziehen. Entfernen von PDMS aus dem Zylinder durch den Rand der Form mit einem Skalpell schneiden.
   2. Waschen PDMS dreimal mit Ethanol und deionisiertes Wasser. Trocken die PDMS unterstützen mit Stickstoff.
5. Die untere Fläche des PDMS Unterstützung hydrophob sein zu behandeln. Einweichen der PDMS zu unterstützen, in einen super-hydrophobe Mantel für 1 S. trocken es für 10 min bei Raumtemperatur.
6. 1. Die Kapillare in der PDMS-Unterstützung legen Sie legen Sie die gereinigten 4 mm Kapillaren in die Löcher der PDMS-Unterstützung und 0,5 mm der Kapillaren außerhalb der oberen Fläche des PDMS Unterstützung verlassen. Sicherstellen, dass die Enden der Kapillaren sind auf dem gleichen Niveau.
7. Behandeln die äußere Oberfläche der Kapillaren und die obere Fläche der PDMS-Unterstützung für hydrophobe werden.
   1. Hinzufügen 15 µL extrem hydrophoben Schicht auf der Oberseite der PDMS-Unterstützung. Beachten Sie, dass die Beschichtung sofort verbreitet alle über der Oberseite (einschließlich der oberen Fläche des PDMS-Unterstützung und die Außenflächen der freiliegenden Teil der Kapillaren) durch Kapillare Kraft.
   2. Super-hydrophobe modifizierte Kapillare Array der Luft trocknen lassen.
8. Fix Primer in Kapillar Array
   1. Primer Lösung vorbereiten. Gewicht, 0,65 g Chitosan (Summenformel: (C ₆ H ₁₁ Nr. ₄) _n) und lösen Sie es in 50 mL entionisiertem Wasser durch den pH-Wert 4,5-5,5 mit Essigsäure, eine Chitosan-Konzentration von 1,3 % zu erreichen. Bereiten Sie Grundierung Komponenten Mischung gemäß Tabelle 1. Siehe zusätzliche Tabelle1 für Primer
   2. Hinzufügen 1.6 µL des Gemisches aus einer Reihe von Grundierungen, eine entsprechende Kapillar Kapillar Array nach einer vordefinierten Reihenfolge zu füllen.
      Hinweis: Die restlichen zwei leere Kapillaren wurden eingestellt als Negativkontrollen.
   3. Das Array in einem transparenten gut ein standard Flachboden-96-Well-Platte zu verankern und trocknen Sie das Array bei 60 ° C für mindestens 2 h.

< td > 1.0/1.0

Lampe Grundierung Befestigungselemente Mischung (Ausgangskonzentration)	Volumen (μL)
DdH 2 O	17,0
Chitosan (1,3 %)	1.0
FIP/BIP Primer (20 μM)	2.0/2.0
LoopF/LoopB Primer (20 μM)
F3/B3 Primer (20 μM)	0,5/0,5
Gesamtvolumen	25,0

Tabelle 1: die Komponenten der Lampe Grundierung Befestigung Reagenzien. Die Komponenten der Lampe Grundierung Befestigung Mischung finden Sie in der linken Spalte der Tabelle, und die Lautstärke der einzelnen Komponenten ist in der rechten Spalte aufgeführt.

9. Montage die Kassette wie folgt. Setzen Sie einen Laden-Adapter auf der Oberseite des verankerten Array. Stellen Sie sicher, dass das Gericht des Adapters deckt nur die exponierte Teile von allen zehn Kapillaren (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1: die Kassette Fertigung und Montage. (ein) Edelstahl Schimmel und die PDMS zu unterstützen. Die Kokille besteht aus 3 Teilen: Zylinder, dam Board und Säule Teller. (b) schematische Darstellung der PDMS Support für Fertigung und Montage der Kapillare Kassette. Der gesamte Prozess enthält 5 Schritten: 1. PDMS gießen, 2. Schimmel entfernen, 3. Kapillare einfügen und Oberflächenbeschichtung, 4. Grundierung zu fixieren und 5. Kassette zu verankern. 1. Füllen Sie PDMS in Zylinder der Form; 2. Drücken Sie das dam-Board zu entfernen den Schimmel von PDMS zu unterstützen; 3. Mantel die untere Oberfläche des PDMS unterstützen und legen Sie dann die Kapillaren in der PDMS unterstützen, schließlich Mantel der oberen Oberfläche der PDMS-Unterstützung und Kapillaren ausgesetzt. Die Dicke blaue Linie zeigt extrem hydrophoben Schicht; 4. Laden Sie die Grundierung in einzelnen Kapillaren gesetzt; (5) das Kapillare Array in einer einzigen 96-Well-Platte zu verankern und eine Probe laden Adapter drauf zu installieren. Die Details wurden im Protokoll Schritte 1.1-1.9 beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Leistung des LAMP-Reaktion im Kapillar Array

1. bereiten die Reaktion Mischung
   1. bereiten die Lampe Reaktion Mischung gemäß T in der Lage 2.
   2. Add Reagenzien Mischung entsprechend der gewählten Reihenfolge, wie in Tabelle 2 und Vortex das Reaktionsgemisch für 5 s nach dem Hinzufügen von Calcein. Sanft inVert wird das Rohr 20-Mal nach Bst Polymerase hinzugefügt.

LAMP-Komponenten (anfängliche Konzentration)	Volumen (μL)
DdH 2 O	11.6
MgSO 4 (100 mM)	2.0
dNTPs (25 mM)	1.4 < / t d >
Betain (5 M)	4.0
-Puffer (10 X)	2,5
Calcein (1,25 mM)	0,5
MnCl 2 (25 mM)	0,5
Bst < /EM > Polymerase (8 U/μl)	1,5
Pflanzen DNA (10 ng/μl)	1.0
Gesamtvolumen	25,0

Tabelle 2: Das Reaktionssystem der Kapillare Array-Lampe. Die Komponenten des Reaktionssystems Kapillar Array-Lampe-Komponenten werden in der linken Spalte aufgelistet und die Lautstärke der einzelnen Komponenten ist in der rechten Spalte aufgeführt.

2. laden die Reagenzien und versiegeln die Kassette
   1. Pipette 20 µL Lampe Reaktionsgemisch mit einem standard 100 µL Tipp. Führen Sie die Spitze in den Einlauf des Adapters laden zu verriegeln. Injizieren Sie das Reaktionsgemisch sanft in die Schüssel des Adapters; das Reaktionsgemisch wird schnell die Schüssel füllen und dann laden die Kapillaren automatisch durch Kapillare Kraft.
   2. Entfernen Sie den Adapter mit der gesperrten Spitze und versiegeln den Brunnen durch eine PCR-kompatible transparente Siegelfolie.
      Hinweis: Nur die Kapillaren berühren das Reaktionsgemisch in der hydrophilen Schale konnten besetzt werden. So stellen Sie sicher, dass die Oberseite der Kapillaren die gleiche Höhe (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2: Diagramm der Probenaufnahme mit Beladung Adapter. Das Bild zeigt den Ladevorgang mit blauen Lösung als Vorbild. Führen Sie die Spitze in den Einlauf injizieren Sie die Probe in den Adapter langsam und dann entfernen Sie den Adapter mit gesperrten Tipp. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Inkubation der Kapillare Array in einem Inkubator bei 63 ° C für 1 h.

3. Ergebnisse auslesen und Datenanalyse

1. Bilder von der Fluoreszenzemission.
   1. Fix einen UV-Filter auf der Oberseite eine kleine Hand UV-LED-Taschenlampe, das sichtbare Licht zu filtern.
   2. Begeistern die dissoziierten Calcein Fluoreszenz mit der UV-Taschenlampe zu emittieren. Aufnahmen von der Spitze des Kapillaren Arrays von einer Digitalkamera oder einem Smartphone.
   3. Bei der Aufnahme eines Bildes, sicherzustellen, dass die Kamera, auf dem Gebiet der Kapillaren so weit wie möglich gezoomt wird zu bekommen hohen Qualität, klare Bilder.
2. Analyse der Ergebnisse
   1. Bild für Bild-Analyse-Software zu öffnen und wählen Sie dann " Bild > Form > Graustufen > ja " und " Bild > Schimmel > 16-Bit > ja ". Wählen Sie " Datei > speichern als > Format > TIFF " das Bild in 16-Bit-TIFF-Format zu konvertieren.
   2. Extrahiert den Wert der Fluoreszenzintensität
      1. öffnen die Microarray-Analyse-Software. Ziehen Sie das 16-Bit-TIFF-Format-Bild in die Schnittstelle der Software und wählen Sie dann die Wellenlänge des " 532 nm " und die Farbe des " grüne " zum Anzeigen des Bildes.
      2. Einen neuen Block erstellen, das Fluoreszenzsignal aus den Kapillaren zu finden. Wählen Sie " Tools > neue Blöcke " und geben Sie die Anzahl der Spalten und Zeilen als " 1, 1 " und " 2; 5 " in der ' Blöcke ' und ' Funktionen ' Schnittstellen getrennt.
      3. Rechts klicken und wählen Sie " Features " modellieren und dann passen Sie die Lage und Durchmesser der Fluoreszenz-Bereich der Kapillaren passen. Wählen Sie " Analyze " den Wert der Fluoreszenzintensität extrahieren.
      4. Select " Datei > speichern als " Blöcke Dokumente speichern und wählen " Datei > Speichern der Ergebnisse als " die Fluoreszenz Intensität Ergebnisse zu speichern. Berechnen Sie die SNR zu definieren, ob die Lampe in den Kapillaren erfolgreich durchgeführt wird.
         Hinweis: Signale der Kapillaren durch Aufnahme stammen, die die Grauwerte der Spots und Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) als Verhältnis der Mittelwerte der Vordergrund Signale von den Zielen, die durchschnittliche Mittelwerte der Vordergrund Signale an die zwei negativen definiert wurden Kontrollen. Die Cutoff positive Signale bestimmen setzte als SNR > 2.

Ergebnisse

Bei dieser Methode ist es wichtig, zwischen verschiedenen Kapillaren während der Probenaufnahme Kreuzkontamination. Zu diesem Zweck wurde Chitosan eingeführt, die könnte die Primer in einzelnen Kapillaren zu behalten. Um zu testen ob es oder nicht funktioniert, wir vorfixiert ADH1 (endogene Referenz-gen von Mais) Grundierung inmitten der Kapillare Kassette mit dem Muster der "T" und "U", wie in Abbildung 3a. Wie erwartet...

Diskussion

Die ruhige Plattform demonstriert hier, welche verbindet die Lampen-Technologie mit einem Kapillar Array, ermöglicht die simultane Detektion von mehrere gen GVO-bezogenen Ziele in einem einzigen, äußerst effektiv und einfach zu bedienen Test.

Um erfolgreich die Multiplex-Lampe-Reaktionen in der Kassette durchzuführen, müssen drei kritische Punkte zu beachten. Erstens erreichen die gleiche Höhe für die Oberseite der Kapillaren und die hydrophile und hydrophobe Muster des Kapillar-Arrays ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat)	UltraTech	4001	supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS	Dow Corning	8332557
Bst polymerase	New England BioLabs	M0275L
betain	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
calcein	Sigma-Aldrich	C0875-5G
MnCl2	Sigma-Aldrich	MKBP0495V
MgSO4	New England BioLabs	B1003S
dNTPs	Shanghai Sangon	B804BA0022
chitosan	Shanghai Sangon	LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software	Adobe Systems Inc., CA, USA		Image analysis
GenePix Pro 6.1	Molecular Devices, CA, USA		microarray analysis software
AutoCAD	Adobe Systems Inc.		3D construction software
UV filter (ZWB2)	YXSensing		supplier : taobao