Détection visuelle de plusieurs acides nucléiques dans une gamme capillaire

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication d’une cassette de petite, prêt à l’emploi qui peut être appliquée pour la détection visuelle de plusieurs acides nucléiques lors d’un test unique, qui est facile à utiliser. Dans cette approche, une gamme capillaire a été utilisée pour multiplexe et très efficace de détection des cibles de l’OGM.

Résumé

Multicibles, peu de temps et ressources-abordable méthodes pour la détection des acides nucléiques multiples en un seul, facile à utiliser le test sont urgent dans le diagnostic des maladies, la surveillance microbienne, la détection de l’organisme génétiquement modifié (OGM), et analyse médico-légale. Nous avons déjà décrit la plateforme appelée calme (Capillary Aaxée sur les Maya Loop-mediated amplification isotherme pour Multiplex de détection optique des acides nucléiques). Nous décrivons ci-après, fabrication améliorée et des processus de performance pour cette plateforme. Ici, nous appliquons une cassette petite, prêt-à-utiliser Assemblée par matrice capillaire pour multiplexe détection visuelle d’acides nucléiques. Le tableau capillaire est pré-traité dans un modèle hydrophobe et hydrophile avant de fixer les amorces amplification isotherme boucle-négociée (lampe) dans les capillaires. Après le montage de l’adaptateur de chargement, le mélange réactionnel lampe est chargé et isolé dans chaque capillaire, en raison de la force capillaire par une seule étape de pipetage. Les réactions de la lampe sont exécutées en parallèle dans les vaisseaux capillaires. Les résultats sont lus visuellement par un éclairage avec une lampe de poche UV à main. En utilisant cette plateforme, nous démontrons suivi de 8 apparaissant fréquemment des éléments et des gènes dans les échantillons de l’OGM avec sensibilité et une spécificité élevée. En résumé, la plate-forme décrite ci-après est destinée à faciliter la détection des acides nucléiques multiples. Nous pensons que ce sera largement applicable dans des domaines où l’analyse des acides nucléiques haut débit est requise.

Introduction

Des systèmes peu coûteux, rapides et facile à utiliser pour la détection simultanée de plusieurs acides nucléiques sont nécessaires d’urgence dans un large éventail de domaines, tels que les diagnostics cliniques^1,2,3, OGM détection^{4, 5,6}, microbienne surveillance^7,8,9, analyse médico-légale^10,11et surtout point-of-care tests (POCTs), où des ressources sont habituellement limitées^12,13,14.

Amplification génique (PCR), y compris ses dérivés méthodes PCR en temps réel et PCR multiplex, est la technique la plus largement appliquée pour détecter dans ces domaines. Cependant, ces méthodes typiquement seulement détectent une cible dans un test¹⁵ et dont ils ont besoin d’électricité et équipements professionnels sophistiqués.

Une autre technologie prometteuse pour la détection des acides nucléiques est boucle-mediated amplification isotherme (lampe), qui a été décrite en 2000¹⁶. LAMP est une méthode de détection de l’ADN à rendement élevé. Théoriquement, il peut amplifier de 1 exemplaire à 10⁹ copies des amplicons dans l’heure, toutes réalisées à une température constante, (c.-à-d., entre 60 et 65 ° C). Amplification réussie produira une grande quantité du pyrophosphate de sous-produit insoluble et provoquer un changement de turbidité¹⁷, ce qui pourrait être directement observée à le œil nu. Un changement de couleur peut également être observé par l’addition d’ions métalliques ou des colorants fluorescents comme calcéine¹⁸, acide nucléique colorant¹⁹et hydroxyle naphtol bleu²⁰. En raison des avantages de haute sensibilité et la commodité d’opération, lampe est largement appliquée dans la détection des acides nucléiques.

Actuellement, il y a essentiellement deux stratégies pour les dosages de lampe multiplex. On doit effectuer plusieurs essais de lampe en ayant plusieurs lampe apprêt définit dans un tube^21,22,23. Cependant, la multiplicité et l’efficacité de l’amplification seraient limitées par l’interférence intrinsèque et la concurrence entre les différentes amorces. En outre, il peut être difficile d’identifier les différents produits de lampe dans la même réaction. Une autre stratégie repose sur l’isolement physique. Différentes amorces ont été isolées dans différents compartiments miniaturisés, et des réactions multiples de lampe sont ensuite exécutées simultanément^24,25. Ces approches, qui sont généralement basées sur les puces microfluidiques, offrent une solution potentielle pour les réactions de lampe haut débit. Cependant, la fabrication des chips et du revêtement de pré multiplex des amorces sont compliqués, qui peut augmenter les coûts et réduire le reproductibilité.

Récemment, quelques études ont décrit performante lampe réactions dans les capillaires de contourner la fabrication compliquée de puces microfluidiques et ont atteint des détection faible coût^26,27. Toutefois, en ce qui concerne l’analyse de haut-débit, ces capillaires sont semblables à des versions miniatures des tubes PCR de bande, car les échantillons et les réactifs de la réaction (y compris les différentes amorces) doivent être préparés et livrés à différents individuellement unités de réaction dans les capillaires. Pour réaliser une analyse parallèle et multiplexe, équipement supplémentaire, par exemple une pompe à seringue multicanaux, est requis pour le chargement parallèle des échantillons ou des réactifs.

Pour surmonter les limitations associées aux méthodes actuelles de détection multiplexe d’acides nucléiques, nous avons développé une plate-forme miniaturisée qui combine la technologie de lampe visuelle avec une gamme capillaire. Cette plate-forme est multi-cibles, compact dans la taille, faible coût et facile à utiliser de²⁸. Ici, nous décrivons les détails de comment fabriquer la matrice capillaire et effectuer les réactions de la lampe dans le tableau. Le protocole décrit ici a été normalisé en utilisant la détection de l’organisme génétiquement modifié (OGM) comme modèle. Ce qui est important, ce protocole permet également à haut débit détection d’autres cibles de l’acide nucléique.

Protocole

Remarque : ce protocole suppose que le moule en acier inoxydable portant la forme pour les microcanaux désirée et l’adaptateur de chargement ont été rendues (fichiers 3D sont fournis à titre supplémentaire fichiers 1 et 2. ). Ce protocole suppose également que plante isolement d’ADN a été déjà réalisée.

1. fabrication de la Cassette de prêt-à-l’emploi axée sur la gamme capillaire

1. nettoyer le moule en acier inoxydable.
   1. Laver le moule en acier inoxydable de détergent, d’éthanol et d’eau déionisée pour enlever les contaminants potentiels. Sécher le moule par l’azote.
2. Nettoyer les capillaires
   1. portez des lunettes, des gants de protection uniforme and chemical lab.
   2. Capillaires de la Place dans un bécher. Nettoyez les capillaires avec 30 mL d’acétone pendant 5 min éliminer les matières organiques et puis les capillaires avec de l’eau désionisée.
      ATTENTION : Manipulez l’acétone sous une hotte.
   3. Verser 10 mL d’H ₂ O ₂ dans le bol, puis ajoutez 30 mL de H ₂ donc ₄ dans l’H ₂ O ₂ avec lente secousse pour éviter toute surchauffe. S’assurer que la solution (solution de piranha) couvre complètement les capillaires pour au moins 30 min.
      ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous maniez solution piranha (H ₂ SO 4/h ₂ O ₂ = 3 : 1, v/v) _. Si la solution de piranha est renversée, laver la solution rapidement avec une grande quantité d’eau et essuyer la surface avec du papier absorbant.
      NOTE : Un nettoyage en profondeur des capillaires est l’un des points clés pour assurer le succès de la réaction de la lampe. Il est nécessaire de secouer la bouteille d’acide pendant le processus de nettoyage pour enlever les bulles dans les capillaires, et la durée de nettoyage peut être étendue si nécessaire.
   4. Laver la solution piranha avec une grande quantité d’eau. Laver les capillaires avec éthanol et d’eau déionisée 5 min chacun. Sécher les capillaires dans une étuve.
3. Versez polydiméthylsiloxane (PDMS)
   1. poids des réactifs de base et durcissement PDMS avec un ratio de 1:1 dans un tube de 50 mL. En général, mélanger 5 g de base à 5 g d’élastomère agent de polymérisation élastomère.
   2. Agiter le mélange soigneusement pendant environ 5 min avec une baguette de verre. Placer le tube avec le PDMS dans une cloche de verre sous vide pendant 30 min pour dégazage.
   3. Verser lentement le PDMS dans le cylindre du moule en acier inoxydable. Permettre le PDMS guérir pendant 3 h dans une étuve à 60 ° C
      Remarque : Soyez prudent afin d’éviter les bulles d’air lors du versement de PDMS. Après coulée PDMS, laissez-le stand pendant 5 min pour une élimination naturel de bulles de PDMS.
4. Enlever le moule de PDMS
   1. après durcissement du PDMS, enlever le moule en tirant le moule avec le cylindre. Retirer le cylindre PDMS en coupant la marge du moule avec un scalpel.
   2. PDMS laver trois fois avec l’éthanol et l’eau désionisée. Sec les PDMS soutenir avec de l’azote.
5. Traiter la surface inférieure du support PDMS à être hydrophobes. Tremper les PDMS soutenir dans un super hydrophobe enduire pour 1 s. sec pendant 10 min à température ambiante.
6. Insérer le tube capillaire dans le support PDMS
   1. Insérez les capillaires nettoyé 4 mm dans les trous du support PDMS et laissez 0,5 mm des capillaires à l’extérieur de la surface supérieure de l’appui PDMS. Assurez-vous que les extrémités des capillaires sont au même niveau.
7. Traiter la surface extérieure des capillaires et la surface supérieure de l’appui PDMS à être hydrophobes. Soutien
   1. Ajouter 15 µL Super hydrophobe couche sur la surface supérieure de la PDMS. Notez que le revêtement immédiatement se propage dans toute la surface supérieure (dont la surface supérieure de l’appui PDMS et les surfaces extérieures de la partie exposée des capillaires) par la force capillaire.
   2. Sécher à l’air Super hydrophobe mis à jour le tableau capillaire.
8. Difficulté amorce en tableau capillaire
   1. préparer la solution de l’apprêt. Poids à 0,65 g chitosan (formule moléculaire : (C ₆ H _{11 4}) _n) et dissoudre dans 50 mL d’eau désionisée en ajustant le pH de 4,5 à 5,5 à l’acide acétique pour atteindre une concentration de chitosan de 1,3 %. Préparer le mélange de composants apprêt selon le tableau 1. Voir le tableau1 supplémentaire pour les amorces
   2. 1.6 Ajouter µL du mélange d’une série d’amorces pour remplir un capillaire correspondante du tableau capillaire selon un ordre pré-conçus.
      Remarque : Les capillaires vides deux restants ont été fixés comme témoins négatifs.
   3. Ancrer le tableau dans un puits transparent d’une plaque de 96 puits fond plat standard et séchez le tableau à 60 ° C pendant au moins 2 h.

< td > 1.0/1.0

apprêt lampe mélange des composants (concentration initiale) de fixation	Volume (μL)
FD 2 O	17,0
Chitosan (1,3 %)	1.0
FIP/BIP primer (20 μM)	2.0/2.0
LoopF/LoopB primer (20 μM)
amorce F3/B3 (20 μM)	0,5/0,5
volume Total	25,0

tableau 1 : les composants de lampe apprêt réactifs de fixation. Les composants d’apprêt lampe fixation mix sont répertoriés dans la colonne de gauche du tableau, et le volume de chaque composant est répertorié dans la colonne de droite.

9. monter la cassette comme suit. Mettre un adaptateur de chargement sur le dessus du tableau ancré. Veillez à ce que le plat de l’adaptateur couvre seulement les parties accessibles de tous les dix capillaires (voir Figure 1).

figure 1 : la cassette fabrication et assemblage. (un) inoxydable moule et le PDMS prennent en charge. Le moule est composé de 3 pièces : cylindre, Conseil de barrage et plaque de pilier. (b) le schéma du PDMS soutien fabrication et le montage de la cassette capillaire. L’ensemble du processus contient 5 étapes : 1. PDMS coulée, 2. moule suppression, 3. insertion de capillaire et de revêtement de surface, 4. apprêt fixation et 5. cassette d’ancrage. 1. Versez le PDMS dans le cylindre du moule ; 2. Appuyer sur le jury du barrage pour retirer le moule des PDMS soutenir ; 3. Enduisez la surface bas du PDMS appuyer, puis insérez les capillaires dans le PDMS soutenir, enfin recouvrir la surface supérieure du support PDMS et exposés des capillaires. La ligne bleue épaisse indique manteau Super hydrophobe ; 4. Chargez amorce dans les capillaires ; 5. ancrer le tableau capillaire dans une seule plaque 96 puits et installer un échantillon chargement adaptateur sur elle. Les détails ont été décrites dans les étapes de protocole 1.1 à 1.9. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. réaction de rendement de la lampe tableau capillaire

1. préparer le mélange de réaction
   1. préparer le mélange de réaction lampe selon T mesure 2.
   2. Ajouter des réactifs au mélange selon l’ordre choisi, comme dans le tableau 2 et vortex le mélange réactionnel pour 5 s après l’ajout de calcéine. Doucement envert le tube 20 fois après Bst polymérase est ajouté.

de la

composants de lampe (concentration d’initiaux)	Volume (μL)
FD 2 O	11,6
MgSO 4 (100 mM)	2.0
dNTPs (25 mM)	1.4 < / t d >
4.0	bétaïne (5 M)
de la mémoire tampon (10 x)	2.5
calcéine (1,25 mM)	0,5
MnCl 2 (25 mM)	0,5
Bst < /em > polymérase (8 U/μl)	1.5
planter ADN (10 ng/μl)	1.0
volume Total	25,0

Tableau 2 : Le système de réaction de la gamme capillaire-lampe. Les composants du système réaction des composants de lampe tableau capillaire sont répertoriés dans la colonne de gauche, et le volume de chaque composant est répertorié dans la colonne de droite.

2. charger les réactifs et sceller la cassette
   bout de
   1. Pipette 20 µL lampe réactionnel avec une norme 100 µL. Introduire l’embout dans l’entrée de l’adaptateur de chargement pour le verrouiller. Injecter doucement le mélange réactionnel dans le plat de l’adaptateur ; le mélange réactionnel sera remplir rapidement le plat, puis charger les capillaires automatiquement par le biais de force capillaire.
   2. Enlever l’adaptateur avec la pointe verrouillée et sceller le puits d’une pellicule d’étanchéité transparente compatible PCR.
      Remarque : Seuls les capillaires toucher le mélange réactionnel dans le plat hydrophile peuvent être remplis. Alors assurez-vous que le dessus de tous les capillaires sont de la même hauteur (voir Figure 2).

figure 2 : diagramme de chargement d’échantillon à l’aide de l’adaptateur de chargement. La photo montre le processus de chargement qui emploient la solution bleue comme un exemple. Introduire l’embout dans l’entrée et injecter l’échantillon dans l’adaptateur lentement puis retirez l’adaptateur avec pointe bloquée. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. Incuber le tableau capillaire dans un incubateur à 63 ° C pendant 1 h.

3. lecture de résultats et l’analyse des données

1. acquérir des images de l’émission de fluorescence.
   1. Fixer un filtre UV sur la surface supérieure d’une petite poche UV LED lampe de poche pour filtrer la lumière visible.
   2. Exciter la calcéine dissocié à émettre de la fluorescence à la lampe UV. Capturer des images du haut du tableau capillaire par un appareil photo numérique ou un smartphone.
   3. Lorsque vous prenez une image, faire en sorte que la caméra est zoomée sur la zone des capillaires autant que possibles d’obtenir de haute qualité, des images claires.
2. Analyser les résultats
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse de l’image par image, puis sélectionnez " Image > moule > gris > Oui " et " Image > moule > 16 bits > Oui ". Sélectionnez " fichier > enregistrer sous > format > TIFF " pour convertir l’image au format TIFF 16 bits.
   2. Extrait la valeur de l’intensité de la fluorescence
      1. ouvert le logiciel d’analyse de microarray. Faites glisser l’image au format TIFF 16 bits dans l’interface du logiciel et ensuite sélectionner la longueur d’onde de " 532 nm " et une couleur de " vert " pour afficher l’image.
      2. Créer un nouveau bloc de localiser le signal de fluorescence des capillaires. Sélectionnez " outils > nouveaux blocs " et entrer le nombre de colonnes et de lignes comme " 1 ; 1 " et " 2 ; 5 " dans la ' blocs ' et ' caractéristiques ' interfaces séparément.
      3. à droite cliquez sur et sélectionnez " caractéristiques " modèle et ajustez l’emplacement et le diamètre pour s’adapter à la zone de la fluorescence des capillaires. Sélectionnez " analyser " pour extraire la valeur de l’intensité de fluorescence.
      4. Select " fichier > enregistrer les paramètres comme " pour enregistrer les documents de blocs et sélectionnez " fichier > enregistrer les résultats sous " pour sauver la fluorescence résultats d’intensité. Calculer le SNR pour définir si la lampe est exécutée avec succès dans les vaisseaux capillaires.
         Remarque : Les signaux des capillaires ont été obtenus en enregistrant que les valeurs de gris des taches et rapports signal sur bruit (SNRs) ont été définis sous forme de rapport des valeurs moyennes des signaux de premier plan des cibles à moyennes valeurs moyennes des signaux de premier plan du négatif deux contrôles. Le seuil de décision pour déterminer les signaux positifs a été défini comme SNR > 2.

Résultats

Dans cette méthode, il est important de prévenir la contamination croisée entre les différents capillaires lors du chargement de l’échantillon. À cette fin, chitosan a été introduit, qui pouvait conserver les amorces dans les capillaires. Pour vérifier si cela a fonctionné ou pas, nous avons préalablement fixé primer ADH1 (gène de référence endogène du maïs) situé dans la cassette capillaire sur le modèle du « T » et « U », comme l’illustre ...

Discussion

La plate-forme calme a démontré ici, qui combine la technologie de la lampe avec une gamme capillaire, permet la détection simultanée de multiples liées aux OGM gènes cibles en une seule, très efficace et facile à utiliser le test.

Pour réaliser avec succès les réactions multiplexes de la lampe dans la cassette, trois points critiques ont besoin de se faire remarquer. Tout d’abord, atteindre la même hauteur pour la partie supérieure des capillaires et le modèle hydrophile et hy...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat)	UltraTech	4001	supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS	Dow Corning	8332557
Bst polymerase	New England BioLabs	M0275L
betain	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
calcein	Sigma-Aldrich	C0875-5G
MnCl2	Sigma-Aldrich	MKBP0495V
MgSO4	New England BioLabs	B1003S
dNTPs	Shanghai Sangon	B804BA0022
chitosan	Shanghai Sangon	LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software	Adobe Systems Inc., CA, USA		Image analysis
GenePix Pro 6.1	Molecular Devices, CA, USA		microarray analysis software
AutoCAD	Adobe Systems Inc.		3D construction software
UV filter (ZWB2)	YXSensing		supplier : taobao