Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de uma gaveta pequena, ready-to-use que pode ser aplicada para a detecção visual de vários ácidos nucleicos em um teste único, que é fácil de operar. Nesta abordagem, uma matriz capilar foi usado para multiplex e altamente eficiente detecção de alvos de OGM.

Resumo

Vários destinos, curto período de tempo e recurso-acessível metodologias para a detecção de vários ácidos nucleicos em um único, fácil de operar o teste são urgentemente necessários no diagnóstico da doença, monitorização microbiana, deteção de organismo geneticamente modificado (OGM), e análise forense. Descrevemos anteriormente a plataforma chamada calma (Capillary Abaseada em rray Loop-mediada isotérmica amplificação para Multiplex de detecção visual de ácidos nucleicos). Aqui, descrevemos melhorada fabricação e processos de desempenho para essa plataforma. Aqui, nós aplicamos uma gaveta pequena, ready-to-use montada por matriz capilar para multiplex de detecção visual de ácidos nucleicos. A matriz capilar é previamente tratada dentro de um padrão hidrofóbico e hidrofílico antes da fixação mediada por loop de amplificação isotérmica (lâmpada) cartilha de moda em capilares. Após a montagem do adaptador de carregamento, mistura de reação de lâmpada é carregada e isolada em cada capilar, devido a força capilar por uma única etapa de pipetagem. As reações de lâmpada são executadas em paralelo em capilares. Os resultados são lidos visualmente para fora pela iluminação com uma lanterna UV à mão. Usando esta plataforma, demonstramos que o monitoramento de 8 frequentemente aparecendo elementos e genes em amostras de OGM com sensibilidade e alta especificidade. Em resumo, a plataforma descrita neste documento destina-se a facilitar a detecção de vários ácidos nucleicos. Acreditamos que será amplamente aplicável em áreas onde a análise de ácidos nucleicos de alto rendimento é necessária.

Introdução

Sistemas de baixo custo, rápidos e fácil de usar para a detecção simultânea de vários ácidos nucleicos são urgentemente necessárias em uma escala larga dos campos, tais como diagnósticos clínicos^1,2,3, OGM deteção^{4, 5,6}, microbiana monitoramento^7,8,9, análise forense de^10,11e testes especialmente point-of-care (POCTs), onde os recursos são geralmente limitadas^12,13,14.

Cadeia da polimerase (PCR), incluindo seus métodos derivados do PCR em tempo real e PCR multiplex, é a técnica mais amplamente aplicada para a deteção nestes campos. No entanto, esses métodos tipicamente somente detectam um alvo em um teste de¹⁵ e eles exigem electricidade e sofisticados equipamentos profissionais.

Outra tecnologia promissora para a detecção de ácidos nucleicos é mediada por Loop isotérmica amplificação (lâmpada), que foi descrita pela primeira vez em 2000,¹⁶. A lâmpada é uma método de deteção de DNA de alta eficiência. Teoricamente, ele pode amplificar de 1 cópia de 10 exemplares⁹ amplicons dentro de uma hora, tudo realizado a uma temperatura constante, (ou seja, entre 60-65 ° C). Amplificação bem-sucedida irá produzir uma grande quantidade de pirofosfato o subproduto insolúvel e causar uma mudança na turbidez¹⁷, que poderia ser diretamente observado a olho nu. Uma mudança de cor também pode ser observada pela adição de íons metálicos ou corantes fluorescentes como calceína¹⁸, ácido nucleico tintura¹⁹e hidroxila naftol azul²⁰. Por causa da conveniência da operação e as vantagens de alta sensibilidade, lâmpada está sendo amplamente aplicada na deteção de ácido nucleico.

Atualmente, existem principalmente duas estratégias para ensaios de luz multiplex. Um é executar múltiplos ensaios de lâmpada por ter vários lâmpada cartilha define em um tubo^21,22,23. No entanto, a multiplicidade e a eficiência de amplificação iria ser limitadas pela interferência intrínseca e competição entre diferentes da primeira demão de moda. Além disso, pode ser difícil identificar os diferente produtos de lâmpada na mesma reação. Outra estratégia baseia-se no isolamento físico. Primeira demão diferentes conjuntos foram isolados em compartimentos individuais de miniaturizado, e várias reações de lâmpada então são executadas simultaneamente^24,25. Essas abordagens, que são geralmente baseadas em chips microfluídicos, fornecem uma solução em potencial para reações de lâmpada de alta produtividade. No entanto, a fabricação dos chips e o multiplex pre-revestimento da primeira demão de moda é complicado, que podem aumentar os custos e diminuir a reprodutibilidade.

Recentemente, alguns estudos descreveram realizando reações de lâmpada em capilares para ignorar a complicado fabricação de chips microfluídicos e alcançaram a deteção de baixo custo^26,27. No entanto, com relação à análise de alta produtividade, esses capilares são semelhantes às versões em miniatura de tira da polimerase, porque as amostras e os reagentes da reação (incluindo os conjuntos de diferentes da primeira demão) devem ser individualmente preparados e entregues a diferentes unidades de reação dentro de capilares. Para realizar a análise paralela e multiplex, equipamento adicional, por exemplo, uma bomba de seringa multicanal, é necessário para carregamento paralelo de amostras ou reagentes.

Para superar as limitações associadas com os atuais métodos para multiplex detecção de ácidos nucleicos, desenvolvemos uma plataforma miniaturizada que combina tecnologia de iluminação visual com uma matriz capilar. Esta plataforma é para vários destinos, compacto em tamanho, baixo custo e fácil de operar²⁸. Aqui, descrevemos os detalhes de como fabricar a matriz capilar e realizar as reações de lâmpada na matriz. O protocolo descrito aqui tem sido padronizado usando a deteção de organismo geneticamente modificado (OGM) como um modelo. Importante, este protocolo também pode ser usado para detecção de alta produtividade de outros alvos de ácido nucleico.

Protocolo

Nota: Este protocolo assume que já se tornaram o molde de aço inoxidável, tendo a forma para os microcanais desejados e o adaptador de carregamento (arquivos 3D são fornecidos como suplementar arquivos 1 e 2. ). Este protocolo também pressupõe que planta isolamento de DNA já foi efectuada a.

1. fabricação da fita com base em matriz capilar Ready-to-use

1. limpar o molde de aço inoxidável.
   1. Lavar o molde de aço inoxidável, detergente, etanol e água desionizada para remover os contaminantes potenciais. Secar o molde por nitrogênio.
2. Limpar os capilares
   1. desgaste óculos de protecção, luvas de proteção, uniforme e química laboratório.
   2. Capilares de lugar para um copo. Limpar os capilares com 30 mL de acetona por 5 min remover matéria orgânica e em seguida, lave os capilares com água desionizada.
      Atenção: Lidar com acetona em uma coifa.
   3. Despeje 10 mL de H ₂ O ₂ o copo e adicione 30 mL de H ₂ para ₄ no H ₂ O ₂ com lenta agitação para evitar o sobreaquecimento. Certifique-se de que a solução (solução de piranha) cobre completamente os capilares pelo menos 30 min.
      Cuidado: Tenha cuidado ao manipular a solução piranha (H ₂ SO 4/h ₂ O ₂ = 3: 1, v/v) _. Se a solução de piranha é derramada, lave a solução rapidamente com uma grande quantidade de água e limpe a superfície com papel toalha.
      Nota: A limpeza completa dos capilares é um dos pontos chaves para garantir o sucesso da reação da lâmpada. É necessário agitar o cilindro ácido durante o processo de limpeza para remover as bolhas em capilares, e o tempo limpo também pode ser estendido quando necessário.
   4. Lavar a solução piranha com uma grande quantidade de água. Lave os capilares com etanol e água desionizada para 5 min cada. Seque os capilares em um forno de secagem.
3. Pour polydimethylsiloxane (PDMS)
   1. peso para fora os reagentes de base e curando de PDMS com uma proporção de 1:1 em um tubo de 50 mL. Normalmente, misturar 5 g de elastômero base de 5 g de elastômero, agente de cura.
   2. Agitar a mistura completamente por cerca de 5 min com uma vareta de vidro. Coloque o tubo com PDMS em uma redoma de vidro a vácuo durante 30 min para desgaseificação.
   3. Despeje lentamente o PDMS o cilindro do molde de aço inoxidável. Permitir que o PDMS curar para 3h em um forno de secagem a 60 ° C
      Nota: tenha cuidado para evitar bolhas de ar quando deitar PDMS. Após o derramamento de PDMS, permitir carrinho por 5 min para remoção natural de bolhas de PDMS.
4. Remover o molde de PDMS
   1. após a cura o PDMS, remover a moldeira, puxando para fora o molde com o cilindro. Retire o cilindro cortando a margem do molde com um bisturi PDMS.
   2. PDMS lavar três vezes com água desionizada e etanol. Secar os PDMS suporte com nitrogênio.
5. Tratar a superfície inferior do suporte PDMS ser hidrofóbico. Embeba os PDMS apoiar em um super hidrofóbico para 1 s. seco faz bem durante 10 minutos à temperatura ambiente.
6. Inserir o capilar no suporte PDMS
   1. Inserir os capilares limpos 4 mm nos orifícios do suporte do PDMS e deixa 0,5 mm de capilares fora a superfície superior do suporte de PDMS. Certifique-se de que as extremidades dos capilares estão no mesmo nível.
7. Tratar a superfície exterior dos capilares e a superfície superior do suporte ser hidrofóbicos PDMS. Suporte
   1. casaco super hidrofóbico de adicionar 15 µ l para a superfície superior do PDMS. Note-se que o revestimento imediatamente se espalha por toda a superfície superior (incluindo a superfície superior do suporte de PDMS e as superfícies externas da parte exposta dos capilares) pela força capilar.
   2. Ar seco a matriz capilar modificada super hidrofóbica.
8. Corrigir a primeira demão em matriz capilar
   1. preparar a solução da primeira demão. Peso fora de 0,65 g de quitosana (fórmula molecular: (C ₆ H _{11 4}) _n) e dissolvê-lo em 50 mL de água desionizada, ajustando o pH para 4,5-5,5 com ácido acético para atingir uma concentração de quitosana de 1,3%. Prepare a mistura de componentes da primeira demão conforme tabela 1. Consulte tabela complementar 1 para primeiras demão
   2. Adicionar 1,6 µ l da mistura de um conjunto de primers para preencher um capilar correspondente da matriz capilar, de acordo com uma ordem pre-projetado.
      Nota: Os restantes dois capilares em branco foram definidos como controles negativos.
   3. A matriz em um poço transparente de uma placa de 96 poços de fundo plano padrão de ancoragem e secar a matriz a 60 ° C, durante pelo menos 2 h.

< td > 1.0/1.0

cartilha lâmpada fixação de componentes de mistura (concentração inicial)	Volume (μL)
ddH 2 O	17,0
quitosana (1,3%)	1.0
cartilha FIP/BIP (20 μM)	2.0/2.0
LoopF/LoopB cartilha (20 μM)
cartilha F3/B3 (20 μM)	0,5/0,5
volume Total	25,0

tabela 1: componentes da lâmpada primeira demão fixação reagentes. Os componentes da primeira demão de lâmpada mistura de fixação estão listados na coluna da esquerda da tabela, e o volume de cada componente é listado na coluna à direita.

9. montar a fita da seguinte forma. Colocar um adaptador de carregamento até o topo da matriz ancorado. Certifique-se de que o prato do adaptador de cobre apenas as partes expostas de todos os dez capilares (ver Figura 1).

Figura 1: A gaveta fabricação e montagem. (um) inoxidável molde e o PDMS suporte. O molde é composto por 3 partes: cilindro, placa de barragem e placa de pilar. (b), o esquema de PDMS suporte fabricação e montagem da fita capilar. O processo inteiro contém 5 etapas: 1. PDMS derramando, 2. molde remoção, 3. capilar inserindo e revestimento de superfície, 4. fixação da primeira demão e 5. fita de ancoragem. 1. Despeje PDMS cilindro do molde; 2. Empurre a placa da barragem para remover o molde de PDMS suporte; 3. revestimento da superfície para baixo de PDMS suporte e em seguida Insira os capilares do PDMS apoiar, por fim revestir a superfície superior do suporte PDMS e expostos os capilares. A linha azul grossa indica o casaco super hidrofóbico; 4. carregar a cartilha definida em capilares individuais; 5. a matriz capilar em uma única placa de 96 poços de ancoragem e instalar uma amostra carregar adaptador para ele. Os detalhes foram descritos em etapas protocolo 1.1-1.9. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. reação de desempenho da lâmpada na matriz capilar

1. Prepare a mistura de reação
   1. preparar a mistura de reação de lâmpada conforme T 2 capaz.
   2. Reagentes de adicionar à mistura de acordo com a ordem escolhida, como na tabela 2 e o vórtice a mistura de reação para 5 s após a adição de calceína. Suavemente emverter o tubo 20 vezes depois do polymerase Bst é adicionado.

componentes de lâmpada (iniciais de concentração)	Volume (μL)
ddH 2 O	11,6
MgSO 4 (100mm)	2.0
dNTPs (25 mM)	1.4 < / t d >
betaína (5m)	4.0
(10 x) do Buffer	2.5
calceína (1,25 mM)	0.5
MnCl 2 (25 mM)	0.5
Bst < /em > polimerase (8 U/μL)	1.5
DNA de plantas (10 ng/μL)	1.0
volume Total	25,0

Tabela 2: O sistema de reação da matriz capilar-lâmpada. Os componentes do sistema de reação dos componentes de matriz capilar lâmpada estão listados na coluna da esquerda, e o volume de cada componente é listado na coluna à direita.

2. carregar os reagentes e fechar a gaveta
   dica de
   1. mistura de reacção de pipeta 20 µ l da lâmpada com um padrão de 100 µ l. Insira a ponta na entrada do adaptador de carregamento para travá-lo. Injetar a mistura de reação delicadamente o prato de adaptador; a mistura de reação será rapidamente encher o prato e em seguida, carregar os capilares automaticamente através da força capilar.
   2. Remover o adaptador com a ponta fechada e selar o poço por uma película de vedação compatível com PCR transparente.
      Nota: Somente os capilares tocando a mistura de reação no prato hidrofílico poderiam ser preenchidos. Então certifique-se que o lado superior de todos os capilares é da mesma altura (ver Figura 2).

Figura 2: diagrama de exemplo usando o adaptador de carregamento carregamento. A imagem mostra o processo de carregamento, empregando solução azul como exemplo. Insira a ponta na entrada e injete a amostra no adaptador lentamente e em seguida, remova o adaptador com ponta fechada. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. incubar a matriz capilar em uma incubadora a 63 ° C, durante 1 h.

3. resultados de leitura e análise de dados

1. adquirir imagens da emissão de fluorescência.
   1. Consertar um filtro UV na superfície superior de uma pequena lanterna de mão LED UV para filtrar a luz visível.
   2. Excitar a calceína dissociada para emitir fluorescência com a lanterna UV. Capturar imagens da parte superior da matriz capilar por uma câmera digital ou um smartphone.
   3. Quando se toma uma imagem, certifique-se de que a câmera é ampliada sobre a área de capilares, tanto quanto possíveis obter alta qualidade, imagens nítidas e.
2. Analisar os resultados
   1. abrir o software de análise de imagem por imagem e em seguida, selecione " imagem > molde > em tons de cinza > Sim " e " imagem > molde > 16 bits > Sim ". Selecione " arquivo > salvar como > formato > TIFF " para converter a imagem em formato TIFF de 16 bits.
   2. Extrair o valor da intensidade de fluorescência
      1. abrir o software de análise de microarray. Arraste a imagem formato TIFF de 16 bits para a interface do software e, em seguida, selecione o comprimento de onda de " 532 nm " e uma cor de " verde " para exibir a imagem.
      2. Criar um novo bloco para localizar o sinal de fluorescência de capilares. Selecione " ferramentas > novos blocos " e o número de colunas e linhas como de entrada " 1; 1 " e " 2; 5 " no ' blocos ' e ' recursos ' interfaces separadamente.
      3. Direita clique e selecione " características " modelo e ajustar a localização e diâmetro para se ajustar à área de fluorescência dos capilares. Selecione " Analyze " para extrair o valor da intensidade de fluorescência.
      4. Select " arquivo > salvar as configurações como " para salvar os documentos de blocos e selecione " arquivo > salvar os resultados como " para salvar a fluorescência resultados de intensidade. Calcular o SNR para definir se a lâmpada é executada com êxito em capilares.
         Nota: Sinais de capilares foram obtidos por gravação que os valores de cinza das manchas e sinal de rácios de ruído (SNRs) foram definidos como rácios de valores médios dos sinais de primeiro plano dos alvos a médios valores médios de sinais de primeiro plano do negativo dois controles. O corte para determinar sinais positivos foi definido como SNR > 2.

Resultados

Neste método, é importante evitar a contaminação cruzada entre diferentes capilares durante o carregamento da amostra. Para este efeito, quitosana foi introduzida, que poderia manter os primers em capilares individuais. Para testar se funcionava ou não, pre-consertamos o primer de ADH1 (gene endógeno referência de milho) definido na gaveta capilar com o padrão de "T" e "U", conforme ilustrado no Figura 3a. Conforme ...

Discussão

A plataforma calma demonstrado aqui, que combina a tecnologia da lâmpada com uma matriz capilar, permite a detecção simultânea de múltiplos alvos de gene OGM-relacionados em um único, altamente eficaz e fácil de operar o teste.

Para executar com êxito as reações de lâmpada multiplex na gaveta, três pontos críticos precisam ser notado. Em primeiro lugar, alcançar a mesma altura para o lado superior dos capilares e o padrão hidrofílico e hidrofóbico da matriz capilar são críti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat)	UltraTech	4001	supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS	Dow Corning	8332557
Bst polymerase	New England BioLabs	M0275L
betain	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
calcein	Sigma-Aldrich	C0875-5G
MnCl2	Sigma-Aldrich	MKBP0495V
MgSO4	New England BioLabs	B1003S
dNTPs	Shanghai Sangon	B804BA0022
chitosan	Shanghai Sangon	LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software	Adobe Systems Inc., CA, USA		Image analysis
GenePix Pro 6.1	Molecular Devices, CA, USA		microarray analysis software
AutoCAD	Adobe Systems Inc.		3D construction software
UV filter (ZWB2)	YXSensing		supplier : taobao