Ortotópico trasplante ovárico procedimientos para investigar la influencia de la vida y salud de la senescencia ovárica en ratones hembra

Resumen

Aquí descritos es orthotopic trasplante ovárico protocolos para modificar el ovario influencia sobre la fisiología del ratón receptor. Este procedimiento quirúrgico se utiliza para exponer ratones hembra a los varios tipos de influencia ovárico y puede incluir trasplantes heterocrónicas y el trasplante de ovarios que han experimentado diversos tratamientos ex vivo .

Resumen

Trasplante de ovario fue realizado primero en Utah State University en 1963. En la obra más reciente, heterocrónicas trasplante de ovarios mamíferos se utiliza para investigar los efectos protectores de la salud de jóvenes ovarios en mujeres jóvenes. Los procedimientos actuales emplean un método de trasplante orthotopic, donde se trasplantaron ovarios alógenos regresa a su posición original en la bursa ovárica. Esto está en contraste con el más comúnmente usado heterotopic trasplante de tejido ovárico/ovarios por vía subcutánea o bajo la cápsula renal. Todos los tres lugares ofrecen eficiente revascularización de los tejidos trasplantados. Sin embargo, el trasplante orthotopic del ovario proporciona el medio de señalización más natural y es el único procedimiento que ofrece la oportunidad del animal para reproducirse naturalmente postoperatoriamente. Uno debe tener cuidado para eliminar todo el tejido ovárico endógeno durante el procedimiento de la ovariectomía. Si queda cualquier tejido endógeno o si sólo se extirpa un ovario, el tejido trasplantado permanecerá inactivo hasta que el tejido existente se vuelve senescente. Mientras que la revascularización de los ovarios trasplantados se produce muy rápidamente, el receptor de trasplante puede tomar una cantidad considerable de tiempo para adaptarse a un nuevo eje de (HPG/A) hipotalámico/pituitario/gonadal/suprarrenal señalización régimen asociado con el trasplante tejido. Esto normalmente toma alrededor de 100 días en el ratón. Por lo tanto, experimentos de trasplante deben ser diseñados para acomodar este período de adaptación. Resultados típicos con el trasplante de ovario incluyen cambios en la salud de la receptora que reflejan la edad del ovario trasplantado, en lugar de la edad cronológica del destinatario.

Introducción

La influencia de la reproducción sobre la salud y la vida es a menudo erróneamente considerado como restringido sólo al período que abarca la competencia reproductiva. Mientras que el estilo de vida y fenotipos asociados a la fase reproductivamente competente de la vida se distinguen fácilmente de las fases previas y postreproductive, estado reproductivo influye en la salud en todas las fases de la vida. El período de capacidad reproductiva se refiere a menudo como la vida reproductiva, diferenciarse de la vida cronológica. Esta terminología se presta a una separación artificial de las dos designaciones de vida cuando en realidad, ambos están estrechamente ligada entre sí con los eventos que afectan a uno, más a menudo que no, que afectan a la otra así.

Evidencia en la última década indica que estado reproductivo de un individuo se asocia con un mayor riesgo de desarrollar condiciones de salud crónicas¹. Un estudio documentaron una asociación entre vidas más cortas y falla reproductiva para una cohorte de hombres². La asociación es aún más llamativo en las mujeres. La enfermedad cardiovascular es rara en las mujeres premenopáusicas³, pero fallo ovárico aumenta la enfermedad cardiovascular considerablemente en la menopausia⁴ y en mujeres jóvenes con falla ovárica prematura⁵. Pérdida de hueso y⁶ de resistencia de insulina aumentan en la menopausia⁷ y casi dos tercios de los estadounidenses con la enfermedad de Alzheimer son mujeres⁸. Cambios bien definidos en la señalización de ovario marcan la transición de un estado premenopáusico, resistentes a enfermedades, a un estado posmenopáusico, carga de enfermedad. Esta transición estable, presenta una oportunidad para identificar mecanismos que aceleren los riesgos de enfermedad en el envejecimiento.

Recientemente, el trasplante de tejido ovárico criopreservado se ha utilizado para restaurar la fertilidad en las mujeres que se someten a procedimientos médicos que pueden poner en peligro las células de la línea del germen, como la quimioterapia. Trasplante de tejido ovárico también puede utilizarse para producir descendencia viable en animales con infertilidad en base no ovárico, incluyendo ratones transgénicos⁹. Trasplante de ovario es un método eficiente para separar la influencia de la función reproductiva o envejecimiento reproductivo de envejecimiento cronológico por sí.

El papel de apoyo bien establecido para las hormonas ováricas en muchos aspectos de la salud implica la pérdida de producción de la hormona de ciclismo activamente las células germinales, como la principal causa de los riesgos de la enfermedad creciente en la menopausia. Mientras que el valor de las hormonas ováricas en la mujer salud es incuestionable, reemplazo de estas hormonas en peri y postmenopáusicas ha sido poco fiable en la restauración de los beneficios de salud de mujeres jóvenes con ovarios pequeños. Estos beneficios para la salud se restauran confiablemente por heterocrónicas trasplante de ovarios joven a ratones hembra postreproductive^{10,11,12,13,14}.

Estado reproductivo de los ratones tanto donante como receptor debe determinarse antes y después del trasplante o procedimientos de ovariectomía. Ratones postreproductive presuntivos que muestran signos de entrada gonadal antes de la cirugía a los 12 meses de edad quedan excluidos de estos experimentos. Entrada gonadal está determinado por citología vaginal. Se recogen datos sobre citología vaginal cirugía previa por lo menos 10 días consecutivos para un estado postreproductive en ratones receptores y ciclismo activamente los ovarios de ratones donantes. Un ciclo estral se define como el período comprendido entre el día nucleated células epiteliales aparecen por primera vez (es decir, proestro) hasta el día anterior a la próxima aparición de las células epiteliales nucleadas en el frotis vaginal, siempre que exista un período de leucocitos presencia (es decir, diestro) en el medio. Estro es determinado por la presencia de células epiteliales escamosas, grandes, con o sin núcleos. Ratones no mostrar ninguna actividad cíclica para un período de 10 días antes o después de la cirugía están decididos a no tener ninguna entrada gonadal para dicho período. Ratones mostrar al menos un ciclo estral completo en un período de 10 días antes o después de la cirugía están decididos a tener entrada gonadal para dicho período. Ratones hembra deben ubicados en presencia de ratones machos o expuestos a la ropa de cama sucia de la jaula del macho para asegurar la constante exposición a los estímulos inductores de ciclo.

Estos procedimientos de trasplante se logran más eficientemente con dos cirujanos trabajando simultáneamente en donante y receptoras ratones. Sin embargo, los procedimientos se logran fácilmente por un cirujano, con los ovarios de la donante suele recuperados antes de iniciar el procedimiento de la ovariectomía sobre el ratón receptor. Este protocolo describe el procedimiento para el cirujano solo. Exposición del tracto reproductivo y el cierre del sitio normalmente se hacen sin un microscopio, mientras que la remoción y reemplazo de los ovarios se hace bajo un microscopio. Como con cualquier procedimiento quirúrgico de aprendizaje, sitios de la incisión pueden ser más grandes y cirugías pueden durar mientras el procedimiento de aprendizaje primera y generalmente disminuyen con la experiencia.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos se desarrollaron bajo el Consejo Nacional de investigación pautas encontraron en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y han sido aprobadas por la Comisión de uso y de Utah estado Universidad institucional Animal Care.

Nota: Procedimientos de trasplante ovárico pueden involucrar ratones (cepa CBA/J) de 21 días de edad a los 18 meses de edad. Ratones de la cepa CBA J ser reproductivamente competentes entre 45 y 60 días de edad y reproductivo senescente entre 10 y 12 meses de edad.

1. trasplante de ovarios intactos a los ratones envejecidos

Nota: Este primer protocolo describe el procedimiento utilizado durante la transferencia de ovarios de un ratón joven (60 días de edad) a una postreproductive hembra (12 meses de edad) de la misma cepa endogámica. El mismo procedimiento se utiliza para trasplante ovárico entre cualquier dos ratones hembra.

1. Pesar y anestesiar el animal donante por intraperitoneal (I.P., 27 ga aguja) inyección, por ejemplo, usando una combinación de ketamina y xilacina acepromazina (65 mg/kg ketamina, 13 mg/kg xilacina 2.0 mg/kg, acepromazina; dosis cóctel - 6,5 ml/kg). Devolver el animal a la jaula casa climatizada hasta la anestesia ha hecho efecto.
2. Una vez anestesiados, quitar el animal de la jaula casera y en toallas de papel caliente. Usando tijeras (#40 cuchilla preferido), desmontar el pelo unos mm lateral a la línea media de cada lado, empezando justo por debajo de las costillas y movimiento distal, preparando una recortada 'parche' Plaza de 2 a 3 cm aproximadamente a ambos lados del ratón propensos a dejar una franja de pelo aproximadamente 1-2 cm sobre la línea media.
3. Suavemente Limpie las áreas recortadas con etanol al 70% y, aplicar betadine solución al sitio recortado con un hisopo de algodón.
4. Aplique el gel antibiótico protección para los ojos y administrar meloxicam (2.0 mg/kg) por vía subcutánea (S.C., 27 ga aguja) en el aspecto lateral del cuello del animal para aliviar el dolor postoperatorio.
5. Coloque el animal en posición prona sobre un campo quirúrgico estéril calentado y limpie el área recortado con una gasa de algodón empapado en etanol 2 cm x 2 cm 70%.
6. Haga una incisión de paralumbar 1.0-1.5 cm y sin rodeos, disecar la piel de la fascia subyacente. Hacer otra incisión a través de la fascia. Sin rodeos diseca lateralmente bajo esta fascia superficial como sea posible hasta llegar a la cavidad abdominal
7. Lugar un pequeño paño quirúrgico sobre la incisión (corte de Gasa de 2 x 2 cm) y húmedo el paño con solución salina estéril.
8. Utilizando pinzas pequeñas, localizar el tejido adiposo que rodea el ovario en la cavidad abdominal y suavemente Extraiga la almohadilla de grasa y el ovario y colóquelo en el drapeado de gasa mojada. El cojín gordo ovárico aparece más blanco que el tejido adiposo circundante.
9. Coloque una pinza de Bulldog de 1,5 pulgadas en la almohadilla de grasa (teniendo cuidado de no obstruir la bursa ovárica) para mantener las vías en su lugar durante el procedimiento.
10. Mover el microscopio de disección en lugar e identificar claramente la bursa ovárica. Agarre la bursa con dos pinzas de relojero y haga una incisión en la bursa ovárica frente el hilio ovárico a exponer el ovario. Si el área prevista de la bursa es altamente vascularizado, aplique una gota de la epinefrina (1: 100, 000) con una jeringa a la superficie bursal para reducir el sangrado en el momento del desgarro.
11. Suavemente Retire el ovario de la bursa ovárica y suprimir el ovario por fijación en el hilio ovárico con unas pinzas de relojero para prevenir el sangrado.
12. Colocar los ovarios de la donante en vidrio de reloj con solución salina estéril de 4° C, cubra ligeramente y reservar hasta que esté listo para el trasplante. Ideal el vidrio de reloj con un microscopio de disección adicional para que los ovarios pueden ser fácilmente captados por el cirujano en el momento del trasplante.
13. En este punto, eutanasia o apartar el ratón donante (deben ser continuamente vigilados) para recibir un ovario trasplantado, tejido, células o un grano de cristal del marcador de posición en un momento posterior.
14. Con instrumentos y un campo quirúrgico limpio, ovariectomize el animal receptor que el anterior. Ratones más viejos tienden a tener un aumento en la cantidad de tejido adiposo y pueden requerir un anestésico mayor dosis (hasta 20%).
15. Después de la supresión del ovario del receptor, colocar un pequeño trozo de esponja hemostática dentro de la bursa vacíela para controlar el sangrado y ayuda en la coagulación y coloque un pedazo pequeño de Gasa remojados en solución salina en el sitio expuesto.
16. Localizar un ovario donante (o tejido, células, grano de cristal del marcador de posición) con un relojero pinzas en una mano y mover en el microscopio de campo de visión. Con otro fórceps en la otra mano, retire la gasa y al mismo tiempo Retire la esponja hemostática de la bursa colocando el nuevo ovario dentro de la bursa.
17. Si el ovario nuevo no encaja dentro de la bursa destinataria, cortar de los ovarios de la donante en la mitad (1/3 o 1/4) y en la bursa en pedazos. Si la bursa no cubre totalmente el ovario entero, colocar una sutura a través de la bursa, el ovario y a través de la bursa para sostener al ovario en su lugar (véase la sección discusión).
    Nota: Los granos de cristal de marcador de posición pueden ser difíciles de manejar con pinzas de relojero.
18. Al colocar un grano de cristal dentro de la bursa, recoger el grano con el fórceps mayor y colocar encima de la almohadilla de grasa al lado de la bursa ovárica. Rodar las bolas en la bursa.
19. Recoger un Portaagujas de Castroviejo ya cargadas con una afilada aguja y sutura de monofilamento de 9-0 o 10-0, localizar el borde desgarrado de la bursa y cerca de la bursa con una o dos suturas de Halsted.
    Nota: Puede también ser realiza la sutura con relojero u otras pinzas pequeñas.
20. Regar el sitio ligeramente con solución salina estéril, retire la abrazadera de panículo adiposo y retomar la almohadilla del ovario o la grasa del abdomen.
21. Quite el cobertor y cerrar la pared abdominal con gut crómico o vicryl 6-0. Este paso puede hacerse con o sin el microscopio.
22. Mover el microscopio a un lado (si no se mueve en el paso anterior) y cierre la piel con los clips de 9 mm de la herida.
23. Coloque el animal en una jaula de recuperación climatizada bajo la sombra de la luz y controlar al animal continuamente hasta la recuperación de la anestesia. Meloxicam adicional puede usarse 24 horas postoperatoriamente si está indicado. Quite los clips de herida aproximadamente nueve días postoperatoriamente.
    Nota: Hay técnicas de inmunosupresores se emplean y se ha detectado ninguna evidencia de injerto - versus - host disease posterior al trasplante o a la muerte.

2. trasplante de la célula de germen había agotado los ovarios de ratones intactos.

Nota: Este protocolo consiste en la transferencia de ovarios de un ratón joven, agotado de la célula de germen para una mujer postreproductive. En el presente Protocolo, los destinatarios del ovario y los procedimientos de trasplante y ovariectomía son igual que el anterior con la excepción de que los ovarios trasplantados han sido químicamente agotado de las células de los folículos primordiales y primarios/germen. Restante los folículos antrales y secundarios será sometidos a reclutamiento/atresia dejando el ovario desprovisto de células germinales. Agotamiento de la célula de germen con diepoxide 4-vinylcyclohexene (VCD) es descrito bien¹⁶. VCD es una toxina. Porque los ovarios tratados con VCD son ser trasplantados a un ratón no tratadas, este procedimiento se beneficia de un ovario tratados con VCD en un ratón no expuesto a los efectos tóxicos de VCD. Este protocolo describe el procedimiento de agotamiento de la célula de germen en ratones jóvenes, de ovario y los donantes.

1. Diluir VCD (64 mg/mL) aceite de sésamo para la inyección y conservar a 4° C hasta su uso.
2. Se inyectan a los donantes del ovario una vez al día con VCD I.P. (160 mg/kg) durante 15 días empezando a los 28 días de edad. Inyectar a ratones control con aceite de sésamo, después del horario del mismo.
3. A los 50 días de edad, comprobar ratones tratados con VCD y aceite sólo tratados para el cese de la ciclicidad reproductiva durante 10 días que el anterior. A los 60 días de edad, los ratones tratados con VCD no deben mostrar ninguna evidencia citológica de entrada gonadal.
4. Recuperar los ovarios de ratones de 60 días de edad y de trasplante como el anterior.
5. Determinar el exitoso trasplante de ovarios de la célula de germen-agotado por la detección de una falta de ciclo reproductivo y aumento de los niveles de androstenediona en circulación. Relación estrógeno: andrógeno aumenta significativamente después del agotamiento de la célula de germen con VCD¹⁷.
6. Iniciar citología vaginal 10-14 días después de la operación y recoger datos durante al menos 10 días consecutivos para asegurar la exacta determinación de la ciclicidad.

Resultados

Ovariectomía en 21 días de edad se evite grandes para arriba-regulación del sistema reproductivo en el inicio de la pubertad y eliminar otras influencias que la gónada femenina puede tener además efectos directos de las hormonas gonadales. Disminución de la reproducción en ratones CBA/J comienza generalmente con ciclos irregulares en 8-10 meses de edad. A los 11 meses de edad, mayoría de las hembras en esta línea de ratones ha alcanzado un punto de falla reproductiva

Discusión

Ovariectomía y a trasplante de ovarios intactos y agotamiento de la célula de germen se han realizado en ratones de 21 días hasta 18 meses de edad. Cuando se realiza una ovariectomía donde es conveniente mantener la bursa ovárica intacta, se debe tener cuidado cuando incidiendo el tejido bursal. En los ratones mayores de seis meses de edad, gran parte de la bursa se convierte overlaid con la almohadilla de grasa, lo que limita las zonas que pueden utilizarse para el acceso. En estos casos, es a menudo ventajoso para...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Any dissecting scope with an adjustable working distance.
Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field.	Stryker/Gaymar	TP700	Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields.
Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure.			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Suture material for abdominal wall	eSutures	G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED
Suture material for ovarian bursa	eSutures	2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER	10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field.
Absorbable gelatin sponge	PFIZER.	Gelfoam- PFIZER 09-0315-08.	cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions.
Staples for skin closure	Becton Dickinson	MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)
Eye ointment.	MWI Veterinary Supply Co.	Puralube sterile opthalmic ointment
Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine	MWI Veterinary Supply Co.	BD 305536	27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml
Syringes for saline.	MWI Veterinary Supply Co.	BD 309657.	3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle
Clippers/blade	Andis	Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade.	Any clippers with a fine blade.
Ethanol	University chemical supply		dilute to 70% for use.
Betadine solution	MWI Veterinary Supply Co.	003233
2x2 gauze pads	MWI Veterinary Supply Co.	003073	autoclaved with surgery packs
Borosilicate glass beads	Sigma-Aldrich Co.	Z273619	Autoclave in sintilation vials
4-vinylcyclohexene diepoxide	Sigma-Aldrich Co.	94956
Sesame oil	Sigma-Aldrich Co.	S3547