נהלים השתלת השחלות Orthotopic לחקור את ההשפעה ואת בריאות-תוחלת החיים של השחלות הזדקנות ביולוגית בעכברים הנשי

Summary

המתוארים כאן הם orthotopic השתלת השחלות פרוטוקולים עבור שינוי השחלות השפעה על הפיזיולוגיה של העכבר הנמען. הליך כירורגי זה משמש כדי לחשוף עכברים הנשי לסוגים שונים של השחלות השפעה והוא עשוי לכלול heterochronic השתלות והשתלות השחלות שעברו טיפולים שונים ex-vivo .

Abstract

השתלת השחלות נערך לראשונה באוניברסיטת יוטה בשנת 1963. עבודה עדכנית יותר, משמש heterochronic השתלת השחלות יונקים לחקור את ההשפעות בריאות-מגן צעיר השחלות אצל נקבות צעירות. ההליכים הנוכחי מעסיקים שיטת השתלת orthotopic, איפה השחלות allogenic מושתלים בחזרה למיקום המקורי שלהם ב בורסה השחלות. זאת בניגוד השתלת הטרוטופי הנפוצות של רקמת השחלה/השחלות subcutaneously או מתחת הקפסולה כליות. כל המיקומים שלושה לספק revascularization יעיל של רקמות המושתלים. עם זאת, השתלת orthotopic מספק את השחלה עם הסביבה הטבעית ביותר איתות והוא ההליך היחיד המספק את ההזדמנות לבעל החיים להתרבות באופן טבעי וכאב לאחר הניתוח. אחד צריך לדאוג כדי להסיר את כל רקמת השחלה אנדוגני במהלך ההליך ovariectomy. אם כל רקמות אנדוגני תישאר או אם רק שחלה אחת יוסר, הרקמה המושתלים יישאר רדום עד הרקמה הקיימת הופך senescent. בעוד revascularization של השחלות המושתלים מתרחשת במהירות רבה, מושתלי יכול לקחת כמות ניכרת של זמן להסתגל ציר חדש ההיפותלמוס/יותרת המוח/האשכים/בלוטת יותרת הכליה (HPG/א) איתות המשטר המשויך המושתלים רקמות. זה בדרך כלל לוקח בערך 100 ימים בתוך העכבר. לכן, צריך להיות מתוכנן השתלת ניסויים כדי להכיל את תקופת הסתגלות זו. תוצאות טיפוסי עם השתלת השחלות יכלול שינויים הבריאות של המטופל המשקפים את הגיל של השחלה המושתלים, ולא את הגיל הכרונולוגי של הנמען.

Introduction

ההשפעה של רבייה על הבריאות ועל תוחלת החיים היא לעתים קרובות בטעות חשבתי כמו מוגבלת רק על התקופה המקיף כשירות הרבייה. בעוד אורח החיים ואת פנוטיפים המשויך השלב reproductively המוסמכת של אורך החיים נבדלים בקלות שלבי קדם ו- postreproductive, מצב הרבייה משפיע על בריאותו לאורך כל שלבי תוחלת החיים. תקופת הרבייה כשירות הוא המכונה לעתים קרובות תוחלת החיים הרבייה, להבדיל עצמה מן תוחלת החיים בסדר כרונולוגי. זה המינוח הוא משאיל את עצמו ההפרדה המלאכותית בין שני וכינוים תוחלת החיים כאשר במציאות, שניהם אחד המשפיעים על קשר הדוק קשורים אחד לשני עם אירועים, לעתים קרובות יותר מאשר לא, להשפיע על השני גם כן.

ראיות בעשור האחרון מציין מצב הרבייה של הפרט הוא קשור עם סיכון מוגבר לפתח בריאות כרוניות תנאים¹. מחקר אחד תיעד שיוך בין תוחלת חיים קצרה יותר וכישלון הרבייה עבור קבוצה של גברים². האגודה הוא בולט יותר אצל נשים. מחלות לב וכלי דם נדירה בקרב נשים בגיל המעבר³, אך שחלות מגביר למחלות לב וכלי דם בחדות גיל המעבר⁴ , בנשים צעירות עם שחלות מוקדמת⁵. ⁶ עמידות לאינסולין וירידה עצם להגדיל ב גיל המעבר⁷ , כמעט שני שלישים של האמריקאים עם מחלת אלצהיימר הן נשים⁸. מוגדר היטב לשינויים איתות השחלות לסמן המעבר ממצב בגיל המעבר, מחלות עמידים, מצב לאחר גיל המעבר, מחלות-נטל. המעבר הזה יציב, מציג הזדמנות לזהות מנגנונים להאיץ את הסיכונים מחלת הזדקנות.

לאחרונה, השתלת רקמת השחלה cryopreserved שימש כדי לשחזר את פוריות אצל נשים שעוברים פרוצדורות רפואיות אשר עלולים לסכן את תאי השורה נבט, כגון כימותרפיה. השתלת רקמת השחלה יכול לשמש גם כדי לייצר צאצאים קיימא בבעלי חיים ללא השחלות פוריות מבוסס, כולל העכברים הטרנסגניים⁹. השתלת השחלות הוא שיטה יעילה כדי להפריד בין ההשפעה של תפקוד הרבייה או הרבייה הזדקנות כרונולוגית להזדקן כשלעצמה.

תפקיד הדמות התומכת ומבוססת על הורמוני השחלה בהיבטים רבים של נשים בריאות מרמז על אובדן ייצור הורמון ממנו באופן פעיל בתאי הנבט, כגורם העיקרי של סיכון מוגבר למחלה-גיל המעבר. אמנם הערך של הורמוני השחלה בבריאות נשים מעורערים, החלפת הורמונים אלה פרי - ו נשים לאחר גיל המעבר כבר לא אמין שיחזור של היתרונות הבריאותיים נהנו נשים צעירות עם השחלות צעירים. אלה היתרונות הבריאותיים משוחזרים באופן אמין על ידי השתלת heterochronic של השחלות צעיר עכברים הנשי postreproductive^{10,11,12,13,14}.

מצב הרבייה של עכברים התורם והן הנמען צריך להיקבע לפני ואחרי השתלת או פרוצדורות ovariectomy. עכברים postreproductive הרב, שעורר המציגים סימני קלט האשכים לפני הניתוח-בגיל 12 חודשים אינם נכללים ניסויים אלה. קלט האשכים נקבעת על ידי ציטולוגיה הנרתיק. נתונים על הנרתיק ציטולוגיה נאספים לניתוח מראש לפחות 10 ימים רצופים להבטיח מדינה postreproductive בעכברים הנמען באופן פעיל-רכיבה על אופניים השחלות בעכברים התורם. אחד estrous מחזור המוגדר כ התקופה מיום nucleated לתאי האפיתל מופיעים תחילה (קרי, proestrus) ליום שלפני ההופעה הבאה של nucleated בתאי אפיתל השמצות הנרתיק, בתנאי שלא קיים תקופה של נוסחת לייקוציטים נוכחות (קרי, diestrus) שביניהם. ייחום נקבעת על ידי הנוכחות של תאי אפיתל גדול, קשקש, של או בלי גרעינים. עכברים זה להציג שום פעילות מחזורית לתקופה 10 יום לפני או אחרי הניתוח נחושים יש קלט האשכים עבור התקופה האמורה. עכברים זה להציג ייחום מלא אחד לפחות בתקופה 10 יום לפני או אחרי הניתוח נקבע שיש האשכים קלט עבור התקופה האמורה. עכברים הנשי צריך להיות שוכן בנוכחות עכברים זכרים או נחשפים מצעים המלוכלכים מהכלוב של הזכר כדי להבטיח עקביות חשיפה לגירויים בתדר מחזור.

הליכים אלה השתלת מוכשרות באופן היעיל ביותר עם שני מנתחים לעבוד בו זמנית על התורם ועכברים הנמען. עם זאת, ההליכים מוכשרות בקלות על ידי רופא מנתח אחד עם השחלות תורם לרוב התאושש לפני תחילת ההליך ovariectomy על העכבר הנמען. פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור המנתח יחיד. חשיפה של מערכת הרבייה, סגירת האתר נעשה בדרך כלל ללא מיקרוסקופ, ואילו הסרה והחלפה של השחלות מתבצעת תחת מיקרוסקופ. עם למידה בכל הליך כירורגי, אתרי החתך עשוי להיות גדול יותר, ניתוחים עשויים להימשך זמן רב יותר תוך ההליך למידה הראשון, יהיה בדרך כלל ירידה עם ניסיון.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן פותחו תחת המועצה הלאומית למחקר הנחיות למצוא במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי יוטה המדינה אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה.

הערה: ההליכים השתלת השחלות עשויה להיות כרוכה עכברים (זן כקבוצת/J) מ- 21 יום של גיל עד גיל 18 חודשים. עכברים של המתח כקבוצת/J להפוך reproductively המוסמכת בין 45 ל- 60 ימים של גיל reproductively senescent בגיל 10 ו- 12 חודשים.

1. השתלת השחלות תקין לעכברים בגילאי

הערה: הפרוטוקול הראשון מתאר את ההליך בשימוש במהלך העברת השחלות של עכבר צעיר (של גיל 60 ימים) כדי postreproductive הנקבה (12 חודשים של גיל) המתח באותה המפגרים. אותו הנוהל משמש עבור השתלת השחלות בין כל שני עכברים הנשי.

1. שוקל, עזים ומתנגד החיה התורמים מאת בקרום הבטן (I.P., המחט ga 27) זריקה, לדוגמה באמצעות קוקטייל של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים, איזופרומאזין (65 מ"ג/ק"ג קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים 13 מ"ג/ק"ג 2.0 mg/kg, איזופרומאזין; מנה קוקטייל - 6.5 ml/kg). להחזיר את החיה לכלוב הביתה מחוממת עד ההרדמה יתחיל להשפיע.
2. ברגע מרדימים, הסר את החיה הכלוב הביתה והמקום על מגבות נייר מחוממת. באמצעות הסרה (העדיפו להבים #40), קוצץ שיער מ מ כמה לרוחב על קו האמצע בכל צד, מתחילים ממש מתחת לצלעות, זז רחוק, הכנת החתוכים של 'תיקון' כ 2-3 ס מ מרובע משני צדדיו של העכבר נוטה להשאיר רצועת שיער כ 1-2 ס מ מכסה את קו האמצע.
3. בקלילות לנגב את האזורים החתוכים עם 70% אתנול, להחיל פתרון betadine אתר החתוכים עם אוזניים.
4. החלת ג'ל לאנטיביוטיקה הגנה העין ולפקח meloxicam (2.0 mg/kg) subcutaneously (ספורטינג, המחט ga 27) על הפן הלטראלי של הצוואר של החיה לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
5. למקם את החיה שכיבה על שדה מחוממת כירורגי סטרילי, לנגב את האזור החתוכים עם גזה צמר גפן ספוג אתנול 2 ס"מ על 2 ס"מ 70%.
6. עושים חתך paralumbar 1.0-1.5 ס"מ ומנתחים שמותחת את העור מפני fascia המשמש כבסיס. לעשות חיתוך נוסף דרך fascia. בלשון בוטה לנתח רוחבית מתחת זה fascia שטחי ככל האפשר עד שהגיע הבטני
7. מקום קטן תלוי כירורגי על החתך (לחתוך מ- 2 ס"מ על 2 ס"מ גזה) ועל רטוב הכיסוי ותאבטחי עם סליין סטרילי.
8. באמצעות מלקחיים קטנים, לאתר את רקמת שומן המקיף את השחלה בחלל הבטן, בעדינות לחלץ את fat pad ו השחלה ומניחים אותו על הכיסוי ותאבטחי גזה שנרטבו. כרית השומן השחלות יופיעו יותר 'לבן' מאשר רקמת שומן שמסביב.
9. במקום מלחציים בולדוג 1.5 ס מ על משטח שמן (מטפל לא להפריע בורסה השחלות) להחזיק את דרכי במקום במהלך ההליך.
10. להזיז את המיקרוסקופ ויבתר למקומו, לזהות בבירור בורסה השחלות. ולהיאחז בורסה בעזרת מלקחיים שען שני, פצעים וחתכים בורסה השחלות מול hilum השחלות כדי לחשוף את השחלה. אם האזור המיועד גישה של בורסה מאוד vascularized, להחיל טיפה של אפינפרין (1: 100, 000) בעזרת מזרק השטח bursal כדי להפחית את הדימום בזמן קורע.
11. בעדינות להסיר את השחלה בורסה השחלות, לסלק את השחלה על ידי מחבר חובק למעקה ב hilum השחלות עם מלקחיים שען כדי למנוע דימום.
12. הכנס את השחלה התורם זכוכית שעון מלא מלח סטרילית 4° C, לכסות ברפיון, להפריש עד מוכן עבור השתלת. באופן אידיאלי, המקום הזכוכית watch תחת מיקרוסקופ ויבתר נוספים כך השחלות יכול בקלות להתפס על ידי המנתח בזמנו של השתלת.
13. בשלב זה, או המתת חסד, או להפריש את העכבר התורם (חייב להיות רציף פיקוח) לקבל השחלה המושתלים, רקמות, תאים או חרוז זכוכית מציין המיקום בנקודת זמן מאוחרת יותר.
14. שדה נקי כירורגי, כלי נגינה, ovariectomize החיה הנמענים כמתואר לעיל. עכברים בוגרים נוטים להיות בעלי כמות מוגברת של רקמת שומן, עשוי לדרוש הרדמה מוגברת מנה (עד 20%).
15. לאחר כריתה של השחלות של הנמען, מניחים חתיכה קטנה של משטח קצף hemostatic בתוך בורסה ריק הדימום, לסייע לקרישה ולמקם חתיכה קטנה של תמיסת מלח ספוג גזה מעל האתר חשוף.
16. אתר של התורם שחלות (או רקמות, תאים, חרוז זכוכית מציין מיקום) עם שען מלקחיים באחד יד ולהעביר מיקרוסקופ השדה-of-view. עם מלקחיים עוד ביד הנגדית, להסיר את הגזה ולהסיר בו-זמנית משטח קצף hemostatic בורסה תוך הצבת השחלה חדש בתוך בורסה.
17. אם השחלה החדש לא מתאים בתוך בורסה הנמען, לחתוך את השחלה תורם חצי (או 1/3 או 1/4), למקם את בורסה בחתיכות. אם בורסה אינה מכסה לחלוטין את השחלה כולה, מקום suture דרך בורסה, דרך השחלה, חזרה דרך בורסה להחזיק את השחלה במקום (ראו סעיף דיון).
    הערה: החרוזים המקום-מחזיק כוס יכול להיות קשה להתמודד עם המלקחיים של שען.
18. בעת הצבת חרוז זכוכית בתוך בורסה, לאסוף החרוז עם מלקחיים גדול ושחרר משטח שמן ליד בורסה השחלות. תתקהלו החרוז בורסה.
19. לאסוף בעל מחט Castroviejo כבר טעון עם מחט מחודדות, תפר monofilament 9-0 או 10-0, לאתר לקצה הקרוע של בורסה וסגור בורסה בעזרת תפרים האלסטד אחד או שניים.
    הערה: תפירת לחלופין ניתן לבצע עם שען או מלקחיים קטנים אחרים.
20. להשקיית אתר בקלילות עם מלח סטרילית, להסיר את המלחציים שומן-pad ולחזור משטח השחלה/שומן בבטן.
21. הסר את הכיסוי ותאבטחי וסגור לקיר הבטן עם 6-0 כרום הבטן או איחוי. שלב זה יכול להתבצע עם או בלי המיקרוסקופ.
22. להזיז את המיקרוסקופ הצידה (אם לא עבר בשלב הקודם) וסגור את העור עם 9 מ מ פצע קליפים.
23. למקם את החיה בתוך כלוב ההתאוששות מחוממת מוצל האור ונטר החיה ברציפות עד ההתאוששות מן ההרדמה. Meloxicam נוספים עשוי לשמש 24 שעות וכאב לאחר הניתוח אם צוין. הסר את הקליפים הפצע כ 9 ימים וכאב לאחר הניתוח.
    הערה: אין טכניקות לדיכוי המערכת החיסונית הם מועסקים, אין עדות שתל – מול – מארח מחלות זוהה שלאחר השתלת או לאחר המוות.

2. השתלת של תא הנבט דלה השחלות לעכברים ללא פגע.

הערה: פרוטוקול זה כרוך בהעברת השחלות של עכבר צעיר, מדולדל תא נבט כדי נקבה postreproductive. ב פרוטוקול זה, הם הנמענים השחלה ונוהלי ovariectomy והשתלות לעיל למעט כי השחלות המושתלים יש כימית התרוקן תאי זקיקי הקדמוני, ראשי/נבט. הנותרים זקיקים משני ולא antral יעבור גיוס/בהכנת עוזב את השחלה חסר בתאי הנבט. תא נבט דלדול עם 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) הוא תיאר היטב¹⁶. VCD הוא רעלן. בגלל השחלות שטופלו VCD להיות מושתלים עכבר שאינם מטופלים, הליך זה נהנה השחלה VCD שטופלו בעכבר אינה נחשפת ההשפעות הרעילות של VCD. פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור תא נבט-דלדול בעכברים השחלה-תורם צעיר.

1. לדלל VCD (64 מ"ג/מ"ל) בשמן שומשום על הזרקת וחנות ב 4° C עד השימוש.
2. להזריק תורמים שחלה פעם ביום עם VCD I.P. (160 מ"ג/ק"ג) במשך 15 ימים שמתחילים ב- 28 ימים של גיל. להזריק בקרת עכברים עם שמן שומשום בעקבות לוח הזמנים אותו.
3. ב- 50 ימים של גיל, בדוק עכברים שטופלו VCD ו שמן בלבד-שטופלו על הפסקת הרבייה לאחר תקופת היובש במשך 10 ימים כאמור לעיל. ב- 60 יום של גיל, VCD מטופלים עכברים צריך להציג הוכחות cytological של קלט האשכים.
4. להתאושש השחלות בת 60 יום עכברים והשתלת כמפורט לעיל.
5. לקבוע בהצלחה השתלת השחלות מדולדל תא נבט על ידי זיהוי של חוסר רכיבה הרבייה, רמות גבוהות של מחזורי androstenedione. אנדרוגן: אסטרוגן יחסי להגדיל באופן משמעותי לאחר דלדול תא נבט עם VCD¹⁷.
6. ליזום ציטולוגיה הנרתיק 10-14 ימים במשככי ולאסוף נתונים לפחות 10 ימים רצופים להבטיח קביעה מדויקת של לאחר תקופת היובש.

תוצאות

Ovariectomy ב- 21 ימים של גיל להימנע הגדולות למעלה-ויסות מערכת הרבייה מיד עם תחילת גיל ההתבגרות ולחסל את השפעות אחרות שבלוטת המין הנשי שיש בנוסף להשפעות ישירה של הורמוני האשכים. ירידה הרבייה בעכברים כקבוצת/J מתחילה בדרך כלל עם מחזורים לא סדיר בגיל 8-10 חודשים של גיל. בגיל 11 חודשים ?...

Discussion

Ovariectomy והשתלת השחלות שלמים ולא מדולדל תא הנבט שנערכו בעכברים ועד 21 ימים בגיל 18 חודשים. בעת ביצוע של ovariectomy שבהם רצוי לשמור על בורסה השחלות תקין, יש לנקוט כאשר אם הרקמה bursal. בעכברים שגילן עולה על גיל שישה חודשים, הרבה בורסה הופך בשכבות עם כרית השומן, אשר מגביל את האזורים שיכול לשמש עבור גישה. ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Any dissecting scope with an adjustable working distance.
Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field.	Stryker/Gaymar	TP700	Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields.
Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure.			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Suture material for abdominal wall	eSutures	G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED
Suture material for ovarian bursa	eSutures	2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER	10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field.
Absorbable gelatin sponge	PFIZER.	Gelfoam- PFIZER 09-0315-08.	cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions.
Staples for skin closure	Becton Dickinson	MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)
Eye ointment.	MWI Veterinary Supply Co.	Puralube sterile opthalmic ointment
Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine	MWI Veterinary Supply Co.	BD 305536	27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml
Syringes for saline.	MWI Veterinary Supply Co.	BD 309657.	3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle
Clippers/blade	Andis	Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade.	Any clippers with a fine blade.
Ethanol	University chemical supply		dilute to 70% for use.
Betadine solution	MWI Veterinary Supply Co.	003233
2x2 gauze pads	MWI Veterinary Supply Co.	003073	autoclaved with surgery packs
Borosilicate glass beads	Sigma-Aldrich Co.	Z273619	Autoclave in sintilation vials
4-vinylcyclohexene diepoxide	Sigma-Aldrich Co.	94956
Sesame oil	Sigma-Aldrich Co.	S3547