Procedimentos de transplantação ovariana ortotópico para investigar a influência de esperança de vida e saúde da senescência ovariana em ratos fêmeas

Resumo

Descritos aqui é ortotópico protocolos de transplante ovariano para modificar o ovário influência sobre a fisiologia do mouse destinatário. Este procedimento cirúrgico é usado para expor os ratos fêmeas para vários tipos de influência no ovário e pode incluir heterocrónico transplantes e transplante de ovários que foram submetidos a tratamentos de vários ex vivo .

Resumo

Transplante de ovário foi primeiramente conduzido na Utah State University em 1963. Em trabalhos mais recentes, heterocrónico transplante de ovários de mamíferos está sendo usado para investigar os efeitos de saúde-protetor dos jovens ovários em fêmeas jovens. Os procedimentos atuais empregam um método de transplante ortotópico, onde os ovários alogênico são transplantados volta para sua posição original na bursa ovariana. Isto está em contraste com o transplante heterotópico mais comumente usado de tecido ovariano/ovários por via subcutânea ou sob a cápsula renal. Todos os três locais fornecem eficiente revascularização de tecidos transplantados. No entanto, transplante ortotópico fornece o ovário com o ambiente de sinalização mais natural e é o único procedimento que fornece a oportunidade para que o animal para se reproduzir naturalmente no período pós-operatório. Um deve tomar cuidado para remover todo o tecido ovariano endógeno durante o procedimento de ovariectomia. Se qualquer tecido endógeno permanece, ou se apenas um ovário é removido, o tecido transplantado permanecerá inativo até que o tecido existente torna-se senescentes. Enquanto revascularização dos ovários transplantados ocorre muito rapidamente, o receptor pode levar uma quantidade considerável de tempo para se adaptar a um novo eixo de (HPG/A) do hipotálamo/hipófise/gonadal/adrenal sinalização regime associado com o transplantado tecido. Isto normalmente leva cerca de 100 dias no rato. Portanto, as experiências de transplantação devem ser projetadas para acomodar este período de adaptação. Resultados típicos com transplante de ovário irão incluir alterações na saúde do destinatário que refletem a idade do ovário transplantado, e não a idade cronológica do destinatário.

Introdução

A influência de reprodução sobre a saúde e a vida útil é muitas vezes erroneamente pensado tão restrito apenas para o período que engloba a competência reprodutiva. Enquanto o estilo de vida e fenótipos associados a fase reprodutivamente competente da esperança de vida são facilmente diferenciados das fases pré e postreproductive, status reprodutivo influencia a saúde em todas as fases da vida span. O período de competência reprodutiva é muitas vezes referido como a esperança de vida reprodutiva, diferenciando-se do tempo de vida cronológico. Esta terminologia se presta a uma separação artificial das duas denominações duração quando, na realidade, ambos são estreitamente vinculados entre si com eventos que afetam um, mais frequentemente do que não, que afetam o outro também.

Provas da última década indicam que status reprodutivo de um indivíduo é associado com um risco aumentado de desenvolver condições de saúde crônica¹. Um estudo documentou uma associação entre a expectativa de vida mais curta e falha reprodutiva de uma coorte de homens². A associação é ainda mais impressionante em mulheres. Doença cardiovascular é rara em mulheres pré-menopausicas³, mas insuficiência ovariana aumenta doenças cardiovasculares bruscamente na menopausa⁴ e em mulheres jovens com falência ovariana prematura⁵. Perda de⁶ e osso de resistência de insulin aumento na menopausa⁷ e quase dois terços dos americanos com a doença de Alzheimer são mulheres⁸. Bem alterações na sinalização ovariana marcam a transição de um estado de pré-menopausa, resistentes a doenças, para um estado pós-menopausa, doença sobrecarregados. Esta transição estável, apresenta uma oportunidade para identificar mecanismos que aceleram os riscos de doença no envelhecimento.

Recentemente, transplante de tecido ovariano criopreservado tem sido usado para restaurar a fertilidade em mulheres que se submetem a procedimentos médicos que podem pôr em risco as células da linha germinal, tais como quimioterapia. Transplante de tecido ovariano também pode ser usado para produzir prole viável em animais com infertilidade com base não-ovarianos, incluindo ratos transgénicos⁹. Transplante de ovário é um método eficiente para separar a influência da função reprodutora ou envelhecimento reprodutivo do envelhecimento cronológico por si.

O papel de apoio bem estabelecido para hormônios ovarianos em muitos aspectos da saúde feminina implica a perda de produção de hormônio de ciclismo ativamente as células germinativas, como a principal causa de riscos de doença aumento na menopausa. Enquanto o valor dos hormônios ovarianos na saúde feminina é inquestionável, substituir esses hormônios na peri e pós-menopausa tem sido confiável na restauração dos benefícios de saúde apreciado por jovens mulheres com ovários jovens. Estes benefícios de saúde confiável são restaurados pelo heterocrónico transplante de ovários jovens para ratos fêmeas postreproductive^{10,11,12,13,14}.

Status reprodutivo de ratos do dador e do receptor deve ser determinada antes e após o transplante ou procedimentos de ovariectomia. Ratos postreproductive presuntivas que exibem sinais de entrada gonadal antes da cirurgia com 12 meses de idade são excluídos destas experiências. Entrada gonadal é determinada pela citologia vaginal. Dados sobre a citologia vaginal são coletados para pré-cirurgia de pelo menos 10 dias consecutivos garantir um estado postreproductive em camundongos destinatários e ovários ativamente-ciclismo em ratos do doador. Um ciclo estral é definido como o período compreendido entre o dia nucleated células epiteliais aparecem pela primeira vez (ou seja, proestro) para o dia anterior a próxima aparição de células epiteliais nucleadas no esfregaço vaginal, desde que haja um período de leucócitos presença (ou seja, diestro) no meio. O cio é determinado pela presença de células epiteliais escamosas, grandes, com ou sem núcleos. Ratos que não exibir nenhuma atividade cíclica, por um período de 10 dias antes ou após cirurgia estão determinados a ter nenhuma entrada gonadal para o referido período. Ratos que exibir pelo menos um ciclo estral completo em um período de 10 dias antes e/ou após a cirurgia são determinados a ter entrada gonadal para o referido período. Ratos fêmeas devem ser alojados na presença de ratos masculinos ou expostos a roupa de cama suja da jaula de um macho para assegurar exposição consistente a estímulos ciclo de indução.

Esses procedimentos de transplante são realizados mais eficientemente com dois cirurgiões trabalham simultaneamente no doador e receptor ratos. No entanto, os procedimentos são facilmente realizados por um cirurgião, com os ovários de doador mais frequentemente recuperados antes de iniciar o procedimento de ovariectomia sobre o destinatário do mouse. Este protocolo descreve o procedimento para o único cirurgião. Exposição do trato reprodutivo e encerramento do site normalmente são feitas sem um microscópio, Considerando que a remoção e a substituição dos ovários é feito sob um microscópio. Como com qualquer procedimento cirúrgico de aprendizagem, locais de incisão podem ser maiores e cirurgias podem levar mais tempo ao primeiro aprender o procedimento e será geralmente diminuem com a experiência.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram desenvolvidos sob o Conselho de pesquisa nacional orientações encontraram no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo Comitê de uso e Utah estado Universidade institucional Cuidado Animal.

Nota: Procedimentos de transplantação ovariana podem envolver ratos (estirpe CBA/J) de 21 dias de idade de 18 meses de idade. Ratos da cepa CBA/J tornar-se reprodutivamente competentes entre 45 e 60 dias de idade e reprodutivamente senescentes entre 10 e 12 meses de idade.

1. transplante de ovários intactos aos ratos envelhecidos

Nota: Este primeiro protocolo descreve o procedimento usado durante a transferência de ovários de um rato jovem (60 dias de idade) para um postreproductive feminino (12 meses de idade) da mesma estirpe pura. O mesmo procedimento é usado para transplante de ovário entre quaisquer dois ratos fêmeas.

1. Pesar e anestesiar o animal dador por intraperitoneal (I.P., agulha de ga 27) injeção, por exemplo, usando um coquetel de cetamina, xilazina e acepromazina (65 mg/kg de cetamina, 13 mg/kg de xilazina 2,0 mg/kg, acepromazina; dose cocktail - 6,5 ml/kg). Retorna o animal da gaiola casa aquecida até a anestesia tem levado a efeito.
2. Uma vez anestesiado, retire o animal da gaiola em casa e coloque sobre toalhas de papel aquecida. Usando o remove de (lâmina #40 preferida), corta o cabelo alguns mm lateral mediana de cada lado, começando logo abaixo das costelas e movendo-se distalmente, preparando uma cortada 'patch' Praça de aproximadamente 2-3 cm de cada lado do mouse propenso deixando uma faixa de cabelo aproximadamente 1-2 cm cobrindo a linha média.
3. Levemente Limpe as áreas recortadas com etanol a 70% e aplicar solução de betadine no site cortado com um swab com ponta de algodão.
4. Aplicar o gel antibiótico para proteção dos olhos e administrar meloxicam (2,0 mg/kg) por via subcutânea (S.C., agulha de ga 27) na face lateral do pescoço do animal para alívio da dor pós-operatória.
5. Coloque o animal em posição prona, em um campo cirúrgico estéril aquecida e limpe a área cortada com uma gaze de algodão embebido em álcool etílico 2 x 2 cm 70%.
6. Faça uma incisão de paralumbar 1,0-1,5 cm e sem rodeios, dissecar a pele da fáscia subjacente. Fazer outra incisão através da fáscia. Sem rodeios dissecar lateralmente sob esta fáscia tão superficialmente possível até atingir a cavidade abdominal
7. Lugar uma pequena cortina cirúrgica sobre a incisão (corte de gaze 2 x 2 cm) e molhado a cortina com solução salina estéril.
8. Usando pequenas pinças, localize o tecido adiposo que rodeia o ovário na cavidade abdominal e suavemente extrair a almofada de gordura e ovário e coloque-o sobre a cortina de gaze umedecida. Do tecido ovariano aparecerá mais branco do que o tecido adiposo.
9. Coloque uma pinça Bulldog de 1,5 polegadas sobre a almofada de gordura (tomando cuidado para não obstruir a bursa ovariana) para manter o trato no local durante o procedimento.
10. Posicionem o dissecação microscópio e identificar claramente a bursa ovariana. Segure a bursa com duas pinças de relojoeiro e entalha a bursa ovariana em frente ao Hilo ovariano para expor o ovário. Se a área de acesso pretendido da bursa é altamente vascularizada, aplique uma gota de epinefrina (1: 100.000) com uma seringa à superfície bolsas serosas para reduzir a hemorragia no momento de rasgar.
11. Suavemente retire o ovário da bursa ovariana e excisar o ovário, fixando-se no hilo ovariano com uma pinça de relojoeiro para prevenir hemorragias.
12. Coloque o doador do ovário em vidro de relógio, preenchido com solução salina estéril de 4° C, tape e reserve até que esteja pronto para transplante. Idealmente, coloque o vidro de relógio sob um microscópio de dissecação adicional para que os ovários podem facilmente ser aproveitados pelo cirurgião no momento do transplante.
13. Neste ponto, eutanásia ou anular o mouse do doador (deve ser continuamente monitorado) para receber um ovário transplantado, tecidos, células ou um grânulo de vidro do espaço reservado em um momento posterior do tempo.
14. Com um campo cirúrgico limpo e instrumentos, ovariectomize o destinatário animal como acima. Os ratos mais velhos tendem a ter uma maior quantidade de tecido adiposo e podem exigir um anestésico maior dose (até 20%).
15. Após a excisão do ovário do destinatário, coloque um pedaço pequeno de almofada hemostática espuma dentro da bursa vazia para controlar o sangramento e auxiliar na coagulação e coloque um pequeno pedaço de gaze embebida em soro fisiológico sobre o site exposto.
16. Localize um ovário doador (ou tecido, células, grânulo de vidro do espaço reservado) com um relojoeiro fórceps em uma mão e mover para o microscópio de campo-de-vista. Com a outra pinça na mão oposta, remova a gaze e simultaneamente remover a almofada de espuma hemostática de bursa enquanto a colocação do ovário novo dentro da bursa.
17. Se o ovário novo não cabe dentro da bursa destinatário, corte o ovário doador pela metade (ou 1/3 ou 1/4) e coloque no bursa em pedaços. Se a bursa não cobrir completamente o ovário inteiro, coloque uma sutura através da bursa, através do ovário e através da bursa para segurar o ovário no lugar (veja a seção de discussão).
    Nota: Os grânulos de vidro porta-lugar podem ser difícil de lidar com a pinça de relojoeiro.
18. Ao colocar um grânulo de vidro dentro da bursa, apanhar a conta com pinças maiores e cair em cima a almofada de gordura junto a bursa ovariana. Enrole o cordão em bursa.
19. Pegar um porta-agulha Castroviejo já carregado com uma agulha cónica e sutura de monofilamento 0-9 ou 10-0, localize a borda rasgada da bursa e fechar a bursa usando uma ou duas suturas de Halsted.
    Nota: Sutura pode alternativamente ser executada com o relojoeiro ou outras pequenas pinças.
20. Irrigar o local levemente com soro fisiológico estéril, remova a braçadeira de gordura-almofada e retornar a almofada de ovário/gordura no abdômen.
21. Remover a cortina e perto da parede abdominal com intestino crómico ou vicryl 6-0. Este passo pode ser feito com ou sem o microscópio.
22. Mover o microscópio à parte (se não mudou na etapa anterior) e fechar a pele com clipes de 9mm a ferida.
23. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação aquecida à sombra da luz e monitorar o animal continuamente até a recuperação da anestesia. Meloxicam adicional pode ser utilizado 24 horas de pós-operatório, se indicado. Remova os clipes de ferida aproximadamente nove dias no período pós-operatório.
    Nota: Não imunossupressoras técnicas são empregadas e não foi detectada nenhuma evidência de doença do enxerto - versus - host pós-transplante ou na morte.

2. transplante de células germinativas empobrecido ovários de camundongos intactos.

Nota: Este protocolo envolve a transferência de ovários de um rato jovem de células germinativas-esgotada a uma fêmea postreproductive. Neste protocolo, os destinatários do ovário e os procedimentos de ovariectomia e transplante de órgãos são como acima com a exceção que os ovários transplantados foram quimicamente depleção de células primordiais e primários folículos/germe. Restantes folículos antrais e secundários passará por recrutamento/atresia deixando o ovário desprovido de células germinativas. Depleção de células germinativas com diepoxide 4-vinylcyclohexene (VCD) é bem descrito¹⁶. VCD é uma toxina. Porque os ovários VCD-tratados estão sendo transplantados para um rato não tratados, este procedimento beneficia de um ovário tratados com VCD em um mouse não exposto aos efeitos tóxicos do VCD. Este protocolo descreve o procedimento para esgotamento de células germinativas em ratos jovens, de ovário-doador.

1. Dilua o VCD (64 mg/mL) em óleo de gergelim para injeção e loja a 4° C até o uso.
2. Injete doadores de ovário uma vez por dia com VCD I.P. (160 mg/kg) por 15 dias, começando com 28 dias de idade. Injete o controle de ratos com óleo de gergelim, seguindo a mesma agenda.
3. Com 50 dias de idade, verificar ratos tratados com VCD e óleo-somente-tratados pela cessação de simbolo reprodutiva por 10 dias, como acima. Com 60 dias de idade, os ratos tratados com VCD não devem exibir nenhuma evidência citológica de entrada gonadal.
4. Recuperar os ovários de camundongos de 60 dias de idade e transplante como acima.
5. Determine o sucesso transplante de células germinativas empobrecido ovários através da detecção de uma falta de ciclismo reprodutiva e aumento dos níveis circulantes de androstenediona. Rácios de andrógeno: estrogênio aumentam significativamente após a depleção de células germinativas com VCD¹⁷.
6. Iniciar a citologia vaginal 10-14 dias no pós-operatório e coletar dados para pelo menos 10 dias consecutivos assegurar a determinação exata do simbolo.

Resultados

Ovariectomia em 21 dias de idade, evitam maior regulação do sistema reprodutor no início da puberdade e eliminar outras influências que a gônada feminina pode ter além de efeitos diretos de hormônios gonadais. Declínio reprodutivo em ratos CBA/J normalmente começa com ciclos irregulares, com 8-10 meses de idade. Com 11 meses de idade, a maioria das fêmeas nesta linha de ratos chegaram a um ponto de falha reprodutiva¹⁵ com uma completa perda de oócitos re...

Discussão

Ovariectomia e transplante de ovários intactos e células germinativas empobrecido foram realizados em camundongos, variando de 21 dias a 18 meses de idade. Ao realizar uma ovariectomia onde é desejável manter a bursa ovariana intacta, deve ter cuidado quando a incisão do tecido bolsas serosas. Em camundongos, mais de seis meses de idade, muito da bursa torna-se sobreposto com a almofada de gordura, o que limita as áreas que podem ser usadas para acesso. Nestes casos, muitas vezes é vantajoso abrir a bursa, perto d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Any dissecting scope with an adjustable working distance.
Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field.	Stryker/Gaymar	TP700	Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields.
Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure.			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Suture material for abdominal wall	eSutures	G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED
Suture material for ovarian bursa	eSutures	2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER	10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field.
Absorbable gelatin sponge	PFIZER.	Gelfoam- PFIZER 09-0315-08.	cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions.
Staples for skin closure	Becton Dickinson	MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)
Eye ointment.	MWI Veterinary Supply Co.	Puralube sterile opthalmic ointment
Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine	MWI Veterinary Supply Co.	BD 305536	27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml
Syringes for saline.	MWI Veterinary Supply Co.	BD 309657.	3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle
Clippers/blade	Andis	Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade.	Any clippers with a fine blade.
Ethanol	University chemical supply		dilute to 70% for use.
Betadine solution	MWI Veterinary Supply Co.	003233
2x2 gauze pads	MWI Veterinary Supply Co.	003073	autoclaved with surgery packs
Borosilicate glass beads	Sigma-Aldrich Co.	Z273619	Autoclave in sintilation vials
4-vinylcyclohexene diepoxide	Sigma-Aldrich Co.	94956
Sesame oil	Sigma-Aldrich Co.	S3547