Procedure di trapianto ovarico di Orthotopic per studiare l'influenza di durata di vita e di salute della senescenza ovarica nei topi femmina

Riepilogo

È descritti qui orthotopic protocolli di trapianto ovarico per modificare ovarico influenza sulla fisiologia del destinatario mouse. Questa procedura chirurgica viene utilizzata per esporre topi femmina a vari tipi di influenza ovarico e può includere eterocronico trapianti e trapianto delle ovaie che hanno subito i vari trattamenti di ex vivo .

Abstract

Trapianto ovarico in primo luogo è stato condotto presso la Utah State University nel 1963. Nei lavori più recenti, mediante trapianto delle ovaie dei mammiferi è utilizzato per studiare gli effetti di salute-protettivo del giovane ovaie in giovani femmine. Le attuali procedure di impiegano un metodo di trapianto ortotopico, dove allogenico ovaie vengono trapiantate nella loro posizione originale a bursa ovarico. Questo è in contrasto con il più comunemente usato heterotopic trapianto di tessuto ovarico/ovaie per via sottocutanea o sotto la capsula del rene. Tutti e tre posizioni forniscono efficiente rivascolarizzazione dei tessuti trapiantati. Tuttavia, trapianto orthotopic fornisce l'ovaio con l'ambiente di segnalazione più naturale ed è l'unica procedura che offre l'opportunità per l'animale di riprodursi naturalmente postoperatorio. Uno deve fare attenzione a rimuovere tutto il tessuto ovarico endogeno durante la procedura di ovariectomia. Se qualsiasi tessuto endogeno rimane o se solo un'ovaia viene rimosso, il tessuto trapiantato rimarrà dormente fino a che il tessuto esistente diventa senescente. Mentre la rivascolarizzazione delle ovaie trapiantate si verifica molto rapidamente, il destinatario del trapianto può richiedere una notevole quantità di tempo per adattarsi ad un nuovo ipotalamo/ipofisi/gonadi/surrene (HPG/A) asse regime associato con il trapiantato di segnalazione tessuto. Questo normalmente dura circa 100 giorni nel topo. Quindi, esperimenti di trapianto dovrebbero essere progettati per ospitare questo periodo di adattamento. Risultati tipici con trapianto ovarico includono cambiamenti nella salute del destinatario che riflettono l'età dell'ovaia trapiantato, piuttosto che l'età cronologica del destinatario.

Introduzione

L'influenza di riproduzione sulla salute e la durata di vita è spesso erroneamente pensato come limitato solo al periodo che comprende la competenza riproduttiva. Mentre il lifestyle e fenotipi associati con la fase riproduttivo competente della durata sono facilmente distinguibili dalle fasi pre- e postreproductive, lo stato riproduttivo influenza la salute in tutte le fasi della durata. Il periodo di competenza riproduttiva si riferisce spesso come la durata della vita riproduttiva, differenziandosi dall'arco cronologico di vita. Questa terminologia si presta ad una separazione artificiale delle due denominazioni durata quando in realtà, entrambi sono strettamente legato un l'altro con gli eventi che interessano uno, più spesso, che colpisce l'altro pure.

Prova nell'ultimo decennio indica che lo stato riproduttivo di un individuo è associato con un rischio aumentato di sviluppare cronici delle condizioni¹. Uno studio ha documentato un'associazione tra durate più brevi e problemi riproduttivi per un gruppo di uomini². L'associazione è ancora più evidente nelle donne. La malattia cardiovascolare è rara in donne premenopausal³, ma insufficienza ovarica aumenta la malattia cardiovascolare acutamente a menopausa⁴ e in giovani donne con guasto ovarico prematuro⁵. Perdita di osso e⁶ di resistenza di insulina aumentano a menopausa⁷ e quasi due terzi degli americani con il morbo di Alzheimer sono donne⁸. Cambiamenti ben definite nella segnalazione ovarico segnano il passaggio da uno stato di premenopausa, resistenti alle malattie, a uno stato postmenopausa, gravati di malattia. Questa transizione stabile, rappresenta un'opportunità per identificare i meccanismi che accelerano i rischi di malattia nell'invecchiamento.

Recentemente, il trapianto di tessuto ovarico crioconservati è stato utilizzato per ripristinare la fertilità in donne che subiscono le procedure mediche che potrebbero compromettere le cellule germinali, come la chemioterapia. Trapianto di tessuto ovarico può essere utilizzato anche per produrre la prole vitali in animali con sterilità di base non-ovarico, compreso topi transgenici⁹. Trapianto ovarico è un metodo efficace per separare l'influenza della funzione riproduttiva o invecchiamento riproduttivo da invecchiamento cronologico per sé.

Il ruolo di sostegno ben consolidato per ormoni ovarici in molti aspetti della salute femminile implica la perdita di produzione di ormoni da ciclismo attivamente le cellule di germe, come la principale causa dei rischi di malattia aumentata a menopausa. Mentre il valore degli ormoni ovarici in salute della donna è indiscutibile, sostituzione di questi ormoni in peri - e postmenopausa è stato inaffidabile nel restauro di benefici per la salute apprezzato da giovani donne con le ovaie giovane. Questi benefici per la salute vengono ripristinati in modo affidabile da eterocronico trapianto delle ovaie giovane a topi femmina postreproductive^{10,11,12,13,14}.

Lo stato riproduttivo dei topi del donatore e del ricevente dovrebbe essere determinato prima e dopo trapianto o ovariectomia procedure. Presuntivi topi postreproductive che mostrano segni di input gonadica prima dell'intervento a 12 mesi dell'età sono esclusi da questi esperimenti. Ingresso gonadica è determinata dalla citologia vaginale. Dati su citologia vaginale sono raccolti per la pre-chirurgia almeno 10 giorni consecutivi garantire uno stato postreproductive in topi destinatari e ovaie attivamente-ciclismo nei topi di donatore. Ciclo di estro è definito come il periodo dal giorno epiteliale cellule nucleate prima che venga visualizzato uno (cioè, proestro) fino al giorno precedente la successiva apparizione di cellule nucleate epiteliale nello striscio vaginale, purché non vi sia un periodo di leucocitic presenza (cioè, diestro) in mezzo. Estro è determinato dalla presenza di cellule epiteliali squamose, grandi, con o senza nuclei. Topi che non visualizzare alcuna attività ciclica, per un periodo di 10 giorni prima e/o dopo la chirurgia sono determinato ad non avere nessun input gonadico per detto periodo. Topi che visualizzare almeno un ciclo estrale completo in un periodo di 10 giorni prima e/o dopo la chirurgia sono determinato ad avere ingresso gonadica per detto periodo. Topi femmina dovrebbero essere alloggiati in presenza di topo maschio o esposti a biancheria sporca dalla gabbia di un maschio per garantire la costante esposizione a stimoli che inducono ciclo.

Queste procedure di trapianto sono compiute in modo più efficiente con due chirurghi operano simultaneamente sul donatore e destinatari topi. Tuttavia, le procedure sono facilmente realizzabile da un chirurgo, con ovaie donatore più spesso recuperate prima di iniziare la procedura di ovariectomia sul destinatario mouse. Questo protocollo descrive la procedura per il singolo chirurgo. Esposizione del tratto riproduttivo e la chiusura del sito avviene normalmente senza un microscopio, considerando che la rimozione e la sostituzione delle ovaie è fatto sotto un microscopio. Come con qualsiasi procedura chirurgica di apprendimento, siti di incisione possono essere più grandi e gli ambulatori possono richiedere più tempo durante la procedura di apprendimento prima e sarà generalmente diminuisce con l'esperienza.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati sviluppati sotto consiglio di ricerca nazionale linee guida trovano la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali con istituzionale Utah State University.

Nota: Le procedure di trapianto ovarico possono comportare topi (ceppo CBA/J) da 21 giorni di età a 18 mesi di età. Topi del ceppo CBA/J diventano riproduttivo competenti tra 45 e 60 giorni di età e riproduttivo senescenti tra 10 e 12 mesi di età.

1. il trapianto di ovaie intatte per topi invecchiati

Nota: Questo primo protocollo descrive il procedimento usato per il transfer delle ovaie da un giovane topo (60 giorni di età) per un postreproductive femminile (12 mesi di età) dello stesso ceppo inbred. La stessa procedura viene utilizzata per trapianto ovarico tra qualsiasi due topi femminili.

1. Pesare e anestetizzare l'animale donatore di intraperitoneale (I.P., 27 ga needle) iniezione, per esempio usando un cocktail di ketamina, xilazina e acepromazina (65 mg/kg ketamina, xilazina 13 mg/kg 2,0 mg/kg, acepromazina; dose cocktail - 6,5 ml/kg). Tornare l'animale dalla gabbia riscaldata fino a quando l'anestesia ha avuto effetto.
2. Una volta anestetizzato, rimuovere l'animale dalla gabbia a casa e posto sui tovaglioli di carta riscaldata. Utilizzando clippers (#40 lama preferita), rimuovere i capelli pochi mm laterale alla linea mediana su ogni lato, partendo appena sotto le costole e lo spostamento distale, preparando un ritagliato 'patch' circa 2-3 cm quadrati su entrambi i lati del mouse incline lasciando una striscia di capelli circa 1-2 cm che copre la linea mediana.
3. Leggermente pulire le aree ritagliate con etanolo al 70% e applicare una soluzione di betadine il sito ritagliato con un batuffolo di cotone con punta.
4. Applicare il gel antibiotico per protezione degli occhi e amministrare meloxicam (2,0 mg/kg) per via sottocutanea (S.C., 27 ga needle) sulla funzione laterale del collo dell'animale per rilievo di dolore postoperatorio.
5. Metti l'animale in posizione prona su un campo chirurgico sterile riscaldato e pulire l'area ritagliata con una garza di cotone imbevuto di etanolo 2 cm x 2 cm 70%.
6. Fare un'incisione di paralumbar di 1.0-1.5 cm e sezionare senza mezzi termini la pelle dalla fascia sottostante. Fare un'altra incisione attraverso la fascia. Senza mezzi termini sezionare lateralmente sotto questa fascia superficiale possibile fino a raggiungere la cavità addominale
7. Posto un piccolo telo chirurgico sopra l'incisione (taglio da garza 2 x 2 cm) e bagnato il drappo con soluzione fisiologica sterile.
8. Usando piccole pinze, individuare il tessuto adiposo che circonda l'ovaia nella cavità addominale e delicatamente estrarre il cuscinetto di grasso e dell'ovaia e metterlo drappeggio garza bagnata sul. Il cuscinetto di grasso ovarico apparirà più 'bianco' che il tessuto adiposo circostante.
9. Collocare un 1,5 pollici Bulldog morsetto sul tappetino di grasso (facendo attenzione per non ostruire il bursa ovarico) per tenere il tratto in posizione durante la procedura.
10. Spostare il microscopio per dissezione in luogo e identificare chiaramente il bursa ovarico. Afferrare il bursa con due pinze di orologiaio e incise ovarico bursa di fronte l'ILO ovarico per esporre l'ovaia. Se l'area di accesso previsto di bursa è altamente vascolarizzato, applicare una goccia di epinefrina (1: 100.000) con una siringa sulla superficie bursal per ridurre il sanguinamento al momento della lacrimazione.
11. Rimuovere l'ovaio da bursa ovarico delicatamente e asportare l'ovaio di bloccaggio al hilum ovarico con un forcipe orologiaio per prevenire le emorragie.
12. Posizionare il donatore dell'ovaia in vetro d'orologio riempito con soluzione fisiologica sterile di 4° C, coprire e mettere da parte fino a che pronto per il trapianto. Idealmente, posizionare il vetro d'orologio sotto un microscopio per dissezione aggiuntivo in modo che le ovaie possono essere afferrate facilmente dal chirurgo al momento del trapianto.
13. A questo punto, eutanasia o mettere da parte il mouse di donatore (deve essere continuamente monitorato) per ricevere un ovaio trapiantato, tessuti, cellule o una perlina di vetro segnaposto in un secondo tempo.
14. Con un campo operatorio pulito e strumenti, ovariectomize l'animale destinatario come sopra. Più vecchi topi tendono ad avere una maggiore quantità di tessuto adiposo e possono richiedere un anestetico aumento della dose (fino al 20%).
15. Dopo l'asportazione dell'ovaia dal destinatario, è necessario inserire un piccolo pezzo di gommapiuma emostatico dentro la borsa vuota per controllare lo spurgo e aiuto nella coagulazione e mettere un piccolo pezzo di garza imbevuta di soluzione fisiologica sopra il sito esposto.
16. Individuare un'ovaia di donatore (o tessuto, cellule, perle di vetro segnaposto) con un orologiaio forcipe in una mano e spostare il microscopio campo di vista. Con un'altra pinza nella mano opposta, rimuovere la garza e contemporaneamente rimuovere il tampone emostatico schiuma da bursa pur ponendo l'ovaia nuovo all'interno di bursa.
17. Se l'ovaio nuovo non rientra all'interno di bursa destinatario, tagliate l'ovaia donatore a metà (o 1/3 o 1/4) e in bursa in pezzi. Se la borsa non copre completamente l'intera ovaia, collocare una sutura attraverso il bursa, ovaia e indietro attraverso il bursa per tenere l'ovaio in posizione (Vedi sezione discussione).
    Nota: Le perle di vetro segnaposto possono essere difficile da gestire con il forcipe di orologiaio.
18. Quando si inserisce una perlina di vetro all'interno di bursa, pick up il tallone con il più grande forcipe e drop in cima il rilievo grasso accanto a bursa ovarico. Rotolare il tallone in bursa.
19. Pick up un porta-aghi Castroviejo già caricato con un ago conico e sutura monofilamento 9-0 o 0-10, individuare il bordo strappato di bursa e chiudere il bursa utilizzando una o due suture di Halsted.
    Nota: La sutura può essere eseguita in alternativa con altre piccole pinze o orologiaio.
20. Irrigare il sito leggermente con soluzione salina sterile, rimuovere il morsetto di grasso-pad e restituire il pad ovaia/grasso all'addome.
21. Rimuovere il drappo e chiudere la parete addominale con intestino cromico vicryl o 6-0. Questo passaggio può essere fatto con o senza il microscopio.
22. Spostare il microscopio da parte (se non spostati nel passaggio precedente) e chiudere la pelle con clip 9 mm della ferita.
23. Metti l'animale in una gabbia riscaldata recupero ombreggiata dalla luce e monitorare l'animale ininterrottamente fino al recupero dall'anestesia. Meloxicam aggiuntivi possono essere utilizzati 24 ore postoperatorio se indicato. Rimuovere le clip di ferita circa nove giorni postoperatorio.
    Nota: Nessun tecniche immunosoppressivo sono impiegato e nessuna evidenza di malattia dell'innesto - contro - ospite è stata rilevata dopo il trapianto o alla morte.

2. trapianto di cellule germinali impoverito ovaie ai topi intatti.

Nota: Questo protocollo prevede il trasferimento delle ovaie da un topo giovane, delle cellule di germe-vuotati a una femmina di postreproductive. In questo protocollo, i destinatari di ovaio e le procedure di ovariectomia e trapianto sono come sopra con l'eccezione che le ovaie trapiantate sono stati chimicamente impoverito di cellule primordiali e primario follicoli/germinali. Restanti follicoli antrali e secondari subirà reclutamento/atresia lasciando l'ovaia privo di cellule germinali. Lo svuotamento delle cellule di germe con diepoxide 4-vinylcyclohexene (VCD) è descritta bene¹⁶. VCD è una tossina. Perché le ovaie VCD-trattati sono essere trapiantate a un mouse non trattata, questa procedura beneficia di un'ovaia VCD-trattati in un mouse non esposto agli effetti tossici di VCD. Questo protocollo descrive la procedura per la deplezione delle cellule di germe in topi giovani, ovaia-donatore.

1. Diluire VCD (64 mg/mL) in olio di sesamo per iniezione e conservare a 4° C fino all'utilizzo.
2. Iniettare i donatori dell'ovaia una volta al giorno con VCD I.P. (160 mg/kg) per 15 giorni a partire da 28 giorni di età. Iniettare topi di controllo con olio di sesamo, seguendo la stessa pianificazione.
3. A 50 giorni di età, è possibile controllare topi trattati con VCD e olio-solo-trattati per cessazione della ciclicità riproduttiva per 10 giorni come sopra. 60 giorni di età, topi trattati con VCD non dovrebbero visualizzare nessuna prova citologica dell'input gonadica.
4. Recuperare le ovaie da 60-giorno-vecchi topi e trapianto come sopra.
5. Determinare riuscito trapianto delle cellule germinali-vuotati ovaie tramite rilevazione di una mancanza del ciclismo riproduttiva e aumento dei livelli di androstenedione in circolazione. Rapporti dell'androgeno: dell'estrogeno aumentano significativamente dopo lo svuotamento delle cellule di germe con VCD¹⁷.
6. Avviare la citologia vaginale 10-14 giorni postoperatorio e raccogliere dati per almeno 10 giorni consecutivi assicurare la determinazione accurata della ciclicità.

Risultati

Ovariectomia a 21 giorni di età sarà evitare principali up-regolazione dell'apparato riproduttivo all'inizio della pubertà ed eliminare altre influenze che la gonade femmina potrebbe essere inoltre necessario effetti diretti degli ormoni gonadici. Riproduttivo declino nei topi di CBA/J di solito inizia con cicli irregolari a 8-10 mesi di età. A 11 mesi di età, la maggior parte delle femmine in questa linea di topi hanno raggiunto un punto di problemi riproduttivi^15<...

Discussione

L'ovariectomia e trapianto delle ovaie intatte e delle cellule di germe-vuotati sono stati condotti in topi che vanno da 21 giorni a 18 mesi di età. Quando si esegue un'ovariectomia dove è desiderabile mantenere la borsa ovarica intatta, si deve prestare attenzione quando incidendo il tessuto bursal. Nei topi di età superiore a sei mesi di età, tanto di bursa diventa sovrapposto con il cuscinetto di grasso, che limita le aree che possono essere utilizzate per l'accesso. In questi casi, è spesso vantaggioso per strap...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Any dissecting scope with an adjustable working distance.
Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field.	Stryker/Gaymar	TP700	Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields.
Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure.			Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Suture material for abdominal wall	eSutures	G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED
Suture material for ovarian bursa	eSutures	2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER	10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field.
Absorbable gelatin sponge	PFIZER.	Gelfoam- PFIZER 09-0315-08.	cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions.
Staples for skin closure	Becton Dickinson	MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)
Eye ointment.	MWI Veterinary Supply Co.	Puralube sterile opthalmic ointment
Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine	MWI Veterinary Supply Co.	BD 305536	27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml
Syringes for saline.	MWI Veterinary Supply Co.	BD 309657.	3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle
Clippers/blade	Andis	Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade.	Any clippers with a fine blade.
Ethanol	University chemical supply		dilute to 70% for use.
Betadine solution	MWI Veterinary Supply Co.	003233
2x2 gauze pads	MWI Veterinary Supply Co.	003073	autoclaved with surgery packs
Borosilicate glass beads	Sigma-Aldrich Co.	Z273619	Autoclave in sintilation vials
4-vinylcyclohexene diepoxide	Sigma-Aldrich Co.	94956
Sesame oil	Sigma-Aldrich Co.	S3547