여성 쥐에서 난소 노화의 수명 및 건강 영향 조사를 Orthotopic 난소 이식 절차

요약

여기에 설명 된 orthotopic 수정 난소 영향 받는 사람 마우스의 생리학에 대 한 난소 이식 프로토콜이 있습니다. 이 수술 난소 영향의 다양 한 종류를 여성 쥐를 노출 하는 데 사용 하 고 heterochronic 이식 및 이식 다양 한 비보 전 치료 받은 난소의 포함 될 수 있습니다.

초록

난소 이식 1963 년에 유타 주립 대학에서 처음 실시 되었다. 최근 작품에서 포유류 난소의 heterochronic 이식 젊은 여성에서 젊은 난소의 건강 보호 효과 조사 하기 위해 사용 됩니다. 현재 절차 allogenic 난소 난소 부르사에서 그들의 원래 위치에 다시 이식는 orthotopic 이식 메서드를 사용 합니다. 이것은 난소/난소 조직의 더 일반적으로 사용 되 heterotopic 이식 달리 피하 또는 신장 캡슐 아래입니다. 모든 3 개의 위치는 이식 조직의 효율적인 revascularization를 제공합니다. 그러나, orthotopic 이식 가장 자연 스러운 신호 환경으로 난소를 제공 하 고 post-operatively 자연스럽 게 재현 동물에 대 한 기회를 제공 하는 유일한 프로시저입니다. 하나 ovariectomy 절차 동안 모든 생 난소 조직을 제거를 주의 해야 합니다. 어떤 생 조직 유지 하는 경우, 하나의 난소를 제거 하는 경우에 이식된 조직을 기존 조직 노화 될 때까지 휴면 유지 됩니다. 이식 받는 상당한 양의 새로운 hypothalamic/뇌/gonadal/부 신 (HPG/A)를 축 하는 정권 관련는 이식 된 신호에 적응 하는 시간을 걸릴 수 있습니다 revascularization 이식된 난소의 매우 신속 하 게 발생 하는 동안 조직입니다. 이 일반적으로 마우스에 100 일 정도 걸립니다. 따라서, 이식 실험이 적응 기간에 맞게 설계 되어야 한다. 전형적인 결과 난소 이식으로 이식된 난소의 나이 보다는 받는 사람의 연대기 나이 반영 하는 받는 사람의 건강 변화 포함 됩니다.

서문

건강과 수명에 재생산의 영향력은 종종 실수로 생식 능력을 포괄 하는 기간에만 제한 된의 생각. 라이프 스타일 및 생활 스팬의 재생산으로 유능한 단계와 관련 된 고기는 쉽게 사전 및 postreproductive 단계에서 분화 된다, 하는 동안 생식 상태 수명의 모든 단계에 걸쳐 건강 영향. 생식 능력의 기간은 종종 생식 수명, 연대기 수명에서 자신을 차별화 라고 합니다. 이 용어 라는 현실에서 두 수명 지정의 인공 분리, 모두에 이벤트와 서로 밀접 하 게 묶인된에 영향을 미치는 한, 보다 더 자주는 아니지만, 뿐만 아니라 다른 영향을 미치는입니다.

지난 10 년간 증거 개인의 생식 상태 만성 건강 상태¹을 개발의 위험 증가와 관련 있음을 나타냅니다. 한 연구는 남자²의 동료에 대 한 짧은 수명을 생식 실패 사이 연결을 문서화. 협회는 여성에서 더욱 눈에 띄는. 심혈 관 질환은 드문 premenopausal 여자³, 하지만 난소 실패 심장 혈관 질병⁵조기 난소 실패 젊은 여성, 폐 경⁴ 에서 급격히 증가. 인슐린 저항⁶ 와 뼈 손실 폐 경⁷ 에 증가 하 고 거의 2/3 미국인의 Alzheimer의 질병과 여자⁸입니다. 난소 신호에 잘 정의 된 변화는 폐 경 후, 질병 부담 상태로 premenopausal, 질병 저항 상태에서 전환을 표시합니다. 이 안정적인 전환 메커니즘을 가속 노화 질병 위험을 식별 하는 기회를 선물 한다.

최근, cryopreserved 난소 조직 이식 생식 선 세포 화학 요법 등을 위태롭게 수 있는 의료 절차를 받아야 하는 여성 불 임 복원 사용 되었습니다. 난소 조직 이식 또한 난소 비 기반으로 불 임, 유전자 변형 마우스⁹를 포함 하 여 동물에 가능한 자손 생산을 사용할 수 있습니다. 난소 이식 생식 기능 또는 연대기 노화 se 당에서 생식 노화의 영향을 분리 하는 효율적인 방법입니다.

여성 건강의 여러 측면에서 난소 호르몬에 대 한 잘 설립 지원 역할에서 적극적으로 폐 경에서 위험 증가 질병의 주 원인으로 생식 세포, 순환 호르몬 생산의 손실 연루. 여성 건강에 난소 호르몬의 값은 의심, peri-및 폐 경 후 여성에서이 호르몬 대체 되었습니다 젊은 난소를 가진 젊은 여자에 의해 즐기 게 하는 효능의 복원에 신뢰할 수 있는. 이러한 건강 혜택 postreproductive 여성 쥐^{10,11,12,,1314}젊은 난소의 heterochronic 이식 하 여 안정적으로 복원 됩니다.

이식 또는 ovariectomy 절차 이전 전후 모두 기증자와 받는 사람 쥐의 생식 상태를 결정 합니다. 나이의 12 개월에 수술 전에 gonadal 입력의 흔적을 표시 하는 추정 postreproductive 쥐이 실험에서 제외 됩니다. Gonadal 입력 질 세포학에 의해 결정 됩니다. 데이터 질 세포학에 적어도 10 일 연속 사전 수술 받는 사람 마우스에서 postreproductive 국가 기증자 쥐에서 난소 적극적으로 자전거를 위해 수집 됩니다. 날 로부터 기간 nucleated 상피 세포로 estrous 주기 정의 하나 표시 (즉, proestrus)는 leukocytic의 기간이 질 얼룩에 nucleated 상피 세포의 다음 모습을 앞에 존재 (즉, diestrus) 사이. 발 정기는 큰, 편평 상피 세포, 또는 핵 없이 존재에 의해 결정 됩니다. 전에 10 일 동안 또는 수술 했다 동안 gonadal 입력을 결정 후 마우스는 순환 활동이 표시 됩니다. 전에 10 일 동안 또는 수술 했다 동안 gonadal 입력을 결정 한 후 마우스를 하나 이상 전체 estrous 주기 표시 합니다. 여성 쥐 남성 쥐의 존재 유 숙 하거나 주기 유도 하는 자극에 일관 된 노출 되도록 남자의 케이지에서 더럽혀진된 침구에 노출 해야 합니다.

이러한 이식 절차는 기증자와 받는 사람 마우스에 동시에 작동 하는 두 명의 외과로 가장 효율적으로 수행 됩니다. 그러나, 절차는 쉽게 수행 한 외과 의사에 의해 가장 자주 받는 사람 마우스에서 ovariectomy 프로시저를 시작 하기 전에 복구 기증자 난소와 함께. 이 프로토콜에서는 단일 외과 의사에 대 한 절차를 설명합니다. 생식 관의 노출 및 사이트의 폐쇄는 일반적으로 없이 이루어집니다 현미경, 반면 제거 및 교체는 난소의 현미경으로 이루어집니다. 와 학습 어떤 수술, 절 개 사이트 더 큰 수 있습니다 수술 절차를 학습 하면서 더 오래 걸릴 수 있습니다 및 일반적으로 것입니다 경험을 가진 감소.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법 지침 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 발견 하 고 유타 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 국가 연구 위원회에서 개발 되었다.

참고: 난소 이식 절차 포함 수 있습니다 쥐 (긴장 CBA/J) 나이의 21 일에서 18 개월. CBA/J 긴장의 쥐 나이의 45 ~ 60 일 reproductively 능력과 나이의 10의 그리고 12 달 사이 재생산으로 노화 된다.

1. 세 쥐 그대로 난소의 이식

참고:이 첫 번째 프로토콜 전송 하는 동안 난소의 젊은 마우스 (나 두 일)에서 postreproductive 여성을 (12 개월 나이의) 같은 타고 난된 긴장의 사용 하는 프로시저를 설명 합니다. 동일한 절차는 어떤 두 여성 쥐 사이 난소 이식에 사용 됩니다.

1. 무게 및 anesthetize 복 (I.P., 27가 바늘)에 의해 기증자 동물 주입, 케 타 민, xylazine 및 acepromazine의 칵테일을 사용 하 여 예 (65 밀리 그램/kg 케 타 민, 13 mg/kg xylazine 2.0 mg/kg, acepromazine; 칵테일 복용량-6.5 ml/kg). 때까지 마 취 효과 열띤된 홈 케이지를 동물을 반환 합니다.
2. 취, 일단 홈 케이지 및 온수 종이 타 올에 장소에서 동물을 제거 합니다. '패치' 헤어 스트립을 떠나 경향이 마우스의 양쪽에 약 2-3 cm 광장 갈비뼈 바로 아래 시작 distally 이동, 준비는 클리핑된 각 편이 중간에 옆 머리 몇 mm 클리퍼 스 (#40 블레이드 선호), 제거를 사용 하 여 약 1-2 cm는 중간을 취재입니다.
3. 가볍게 70% 에탄올으로 잘린된 영역을 닦 고, 면 기울 ㄴ 면봉으로 클리핑된 사이트에 betadine 솔루션을 적용.
4. 눈 보호를 위한 항생제 젤을 적용 하 고 피하 meloxicam (2.0 mg/kg)를 관리 (사우스 캐롤라이나, 27가 바늘) 수술 후 통증 완화를 위해 동물의 목의 옆 부분에.
5. 온수 메 마른 외과 분야에서 발생 하기 쉬운 위치에 동물을 놓고 70% 에탄올 배어 2 cm x 2 cm 면 거 즈로 잘린된 영역을 닦으십시오.
6. 1.0-1.5 c m paralumbar 절 개를 하 고 퉁 명 스럽게 기본 근 막에서 피부를 해 부. 간판을 통해 또 다른 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 해 부 옆이 근 막 아래 최대한으로 복 부 구멍에 도달할 때까지
7. 장소 (2 cm x 2 cm 거 즈에서 잘라) 절 개 그리고 젖은 멸 균 식 염 수와 드 레이프 작은 수술 주름 잡아 드리운 다.
8. 작은 집게를 사용 하 여 복 부 구멍에서 난소를 둘러싸는 지방 조직 그리고 부드럽게 지방 패드와 난소 추출 찾아서 젖은 거 즈 드 레이프에 배치. 난소 지방 패드 주변 지방 조직 보다 더 '화이트' 표시 됩니다.
9. 뚱뚱한 패드 (복용 하지 않도록 주의 난소 부르사 방해)에 1.5 인치 불독 클램프를 배치 절차 동안은 장소에서 개최.
10. 곳으로 해 현미경을 이동 하 고 명확 하 게 난소 부르사를 식별 합니다. 두 시계 집게와 부르사를 파악 하 고 노출 난소 난소 hilum 반대 난소 부르사 incise. 부르사의 의도 된 액세스 영역 나가도록 높은 경우 찢 어 시 출혈을 줄이기 위해 bursal 표면에 주사기와 피 네 프 린 (1: 100, 000)의 한 방울을 적용 됩니다.
11. 부드럽게 난소 부르사에서 난소를 제거 하 고 출혈을 방지 하기 위해 시계 집게와 난소 hilum에 클램핑 함으로써 난소를 삭제할.
12. 기증자 난소 4 ° C 살 균 염 분 가득한 시계 유리에, 느슨하게 커버 놓고 이식에 대 한 준비까지 따로 설정 합니다. 이상적으로, 난소 장악 될 수 있다 쉽게는 외과 의사에 의해 이식 시 되도록 추가 해 현미경 시계 유리를 놓습니다.
13. 이 시점에서, 안락사 하거나 이식된 난소, 조직, 세포 또는 나중 시간에 자리 표시자 유리 비드를 (지속적으로 모니터링 해야) 기증자 마우스를 따로 설정 합니다.
14. 깨끗 한 수술 필드와 악기, 위와 같이 받는 사람 동물을 ovariectomize. 더 오래 된 쥐 지방 조직의 양이 증가 하는 경향이 고 증가 마 취 복용량 (최대 20%까지) 하는 것을 요구할 수 있습니다.
15. 받는 사람에서 난소의 절제, 후 내부 출혈을 제어 및 응고에 도움이 노출된 사이트를 통해 식 염 수에 젖은 거 즈의 작은 조각을 배치 하 빈 부르사 hemostatic 거품 패드의 작은 조각을 넣으십시오.
16. 기증자의 난소 (또는 조직, 세포, 개체 틀 유리 구슬) 시계 집게를 한 손으로 고 현미경 시야의 이동으로 찾습니다. 반대 손에 다른 집게와 거 즈를 제거 하 고 동시에 부르사 내 새로운 난소를 배치 하면서 부르사에서 hemostatic 거품 패드를 제거 합니다.
17. 새로운 난소 내부 받는 사람 부르사 맞지 않으면, 절반 (1/3 또는 1/4) 기증자 난소를 잘라 고 조각에 버 합니다. 부르사 전체 난소를 완전히 커버 하지 않습니다, 경우 배치는 부르사, 난소 및 장소에는 난소를 부르사 통해 다시 봉합 (토론 섹션 참조).
    참고: 유리 자리 표시자 구슬 시계의 집게와 처리 하기 어려울 수 있습니다.
18. 부르사 내부 유리 구슬 때, 큰 집게로 비드를 선택 하 고 난소 부르사 옆 지방 패드 위에 놓습니다. 부르사에 비드를 롤.
19. Castroviejo 바늘 홀더 이미 로드 테이퍼 바늘 및 9-0 또는 10-0 monofilament 봉합 사를 선택 하 고 부르사의 찢어진된 가장자리를 찾아 하나 또는 두 개의 Halsted의 봉합을 사용 하 여 부르사를 닫습니다.
    참고: 봉합 또는 수행할 수 있습니다 시계 또는 다른 작은 집게로.
20. 멸 균 식 염 수로 가볍게 사이트 관개, 지방 패드 클램프를 제거 하 고 복 부에 난소/지방 패드를 반환 합니다.
21. 에 드 레이프를 제거 하 고 6-0 크롬 창 자 또는 vicryl 복 벽을 닫습니다. 이 단계는 또는 현미경 없이 할 수 있습니다.
22. 옆으로 (만약 이전 단계에서 이동 하지) 현미경을 이동 하 고 9mm 상처 있는 피부를 닫습니다.
23. 빛에서 음영 온수 복구에에서 동물을 놓고 동물 마 취에서 회복까지 지속적으로 모니터링 합니다. 추가 meloxicam 표시 하는 경우에 post-operatively 24 시간 사용할 수 있습니다. Post-operatively 상처 클립 약 9 일 제거 합니다.
    참고: 없음 면역 기술을 고용 하 고 후 이식 또는 죽음에서 이식-비교-호스트 질병의 증거가 발견 되었습니다.

2. 세균 세포의 이식 그대로 쥐 난소 고갈.

참고:이 프로토콜 젊은, 생식 세포 고갈 마우스에서 postreproductive 여성 난소의 전송이 포함 됩니다. 이 프로토콜에서 난소 받는 사람 및 ovariectomy 및 이식 절차는 위의 예외의 원시 및 기본 모 공/세균 세포의 고갈 이식된 난소 화학적으로 되었습니다. 보조 및 antral 낭 나머지 모집/이 폐쇄 증 없는 생식 세포 난소를 떠나 받게 된다. 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)와 생식 세포 소모는 잘 설명된¹⁶. VCD는 독 소입니다. VCD 치료 난소 치료 비 마우스에 이식 되는, 때문에이 절차는 VCD의 독성 효과에 노출 되지 마우스에 VCD 치료 난소에서 혜택. 이 프로토콜에서는 젊은, 난소 기증자 생쥐 생식 세포 고갈에 대 한 절차를 설명합니다.

1. 참 깨 오일 주입 및 4 ° C에서 저장소에 대 한 사용까지 VCD (64 mg/mL)을 희석.
2. 주사 난소 기증자는 하루에 한 번 VCD I.P. (160 mg/kg)와 15 일의 나 두 일에 시작. 참 깨 오일 같은 일정에 따라 통제 쥐를 주사.
3. 나이의 50 일에서 위와 같이 10 일 동안 VCD 처리 고 오일만 처리 마우스 생식 cyclicity의 중단을 확인 합니다. 나이의 60 일, VCD 치료 쥐 gonadal 입력의 cytological 증거가 표시 됩니다.
4. 60 일 된 쥐에서 난소를 복구 하 고 위와 같이 이식 합니다.
5. 난소 생식 세포 고갈의 성공적인 이식 생식 사이클의 부족과 androstenedione 순환의 증가 수준을의 검출 하 여 확인 합니다. 안 드로 겐: 에스트로겐 비율 VCD¹⁷생식 세포 고갈 후 크게 증가.
6. Postoperatively 질 세포학 10-14 일을 시작 하 고 cyclicity의 정확한 결정을 위해 적어도 10 일 연속에 대 한 데이터를 수집 합니다.

결과

Ovariectomy 21 일의 나이에 사춘기의 개시에 생식 시스템의 주요 업 규제를 피하기 위해 하 고 여성 생식 gonadal 호르몬의 직접 효과 또한 있을 다른 영향을 제거 것입니다. CBA/J 쥐에 생식 감소 일반적으로 8-10 개월에 불규칙 한 주기 시작합니다. 대부분 여성 쥐의이 라인에에 나이의 11 개월에서 12 개월에 의해 응답 oocytes의 완전 한 손실 생식 실패¹⁵ 의 포인트...

토론

Ovariectomy 및 손상과 세균 세포 고갈 난소 이식 18 개월 21 일에서 배열 하는 생쥐에 실시 되었습니다. 수행 된 ovariectomy 난소 부르사를 그대로 유지 하는 것은 때 incising bursal 조직 배려를가지고 한다. 쥐 나이의 6 개월 이상, 부르사의 많은 액세스를 위해 사용할 수 있는 영역을 제한 하는 지방 패드와 중첩 된다. 이러한 경우에, 그것은 종종 지방 패드 국경 거의 오픈 부르사 눈물을. 이 메서드는 종종 ...

자료

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