Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.

Resumen

Demostrar un método de cuantificación y detección de parásitos en acuoso de glóbulos rojos (gr) mediante un simple Banco atenuada Total reflexión Fourier transforman (ATR-FTIR) Espectrómetro de infrarrojos junto con análisis de datos multivariantes ( MVDA). 3 7 p. falciparum fueron cultivados a los parásitos de etapa 10% parasitemia anillo y utilizado para glóbulos rojos del donante fresco aislado para crear una dilución en serie entre 0 – 1%. 10 μl de cada muestra se colocaron en el centro de la ventana de diamante ATR para adquirir el espectro. Los datos de la muestra fue tratados para mejorar la relación señal a ruido y eliminar el aporte de agua, y luego se aplicó la segunda derivada para resolver características espectrales. Luego se analizaron los datos utilizando dos tipos de MVDA: Análisis de componentes principales el primer (ACP) para determinar cualquier afloramiento y entonces regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R) para construir el modelo de cuantificación.

Introducción

La malaria está entre las enfermedades más devastadoras de nuestro tiempo; más de la mitad de la población vive en situación de riesgo en regiones endémicas y afecta desproporcionadamente los pobres^1,2,3,4. Una gran parte del problema es la portadores asintomáticos y pacientes etapa temprana que actúan como reservorios de mosquitos vectores⁵, provocando picos de infección durante las temporadas húmedas y permitiendo que persisten en las comunidades. La malaria es causada por cinco parásitos Plasmodium , el más mortal de la que es p. falciparum , que causa la forma más severa de la enfermedad².

Actualmente, las técnicas para el diagnóstico de la malaria son menos que perfecto. Microscopio óptico, el estándar de oro actual, sólo puede detectar 62-88 parásitos/μl dependiendo del método utilizado⁶. Además, debido a la intensidad y alta habilidad requerida, en muchas regiones la microscopia diagnostica > 50% de los casos, especialmente aquellos con baja parasitemia², que puede ser directamente atribuido a la falta de recursos en el área y los resultados en los niveles el mal uso de medicamentos contra la malaria. Los 2 principales métodos de diagnóstico son pruebas de diagnóstico rápido (PDR), que utilizan anticuerpos para la detección y análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que discriminan y cuantificación de parásitos de ADN. En la actualidad, PDR sólo es capaces de detectar por p. falciparum y p. vivax de al menos 100 parásitos/μl de sangre dando como resultado formas más raras de la enfermedad que sin tratamiento. ^{7 , 8} por el contrario, ensayos PCR discriminan y cuantificar diferentes especies de Plasmodium en una sensibilidad de 5 0.0004 parásitos/μl de sangre. Sin embargo, se requiere de costosos reactivos, equipos y habilidad técnica y así no es conveniente para el uso del campo.

Una técnica altamente sensible, fiable y asequible es esencial para mejorar el diagnóstico y así mejorar los resultados del paciente y posibilitando la eliminación de la enfermedad. Espectroscopia de transformación (ATR-FTIR) de Fourier reflexión Total atenuada ofrece una posible solución a este problema. Trabajo previo ha demostrado que es posible detectar y cuantificar por p. falciparum en metanol fijada películas de sangre alcanzar los límites de detección de < 1 parásito/μl de sangre (< 0.0002% de parasitemia)⁹, que es comparable a los métodos de PCR. Estudios recientes han demostrado que es posible detectar y cuantificar parásitos en las muestras acuosas y así eliminar el paso de fijación. Sin embargo, factores tales como el vapor de agua, de ruido espectral y tratamiento de los datos deben tomarse en cuenta para un resultado óptimo¹⁰.

Este protocolo tiene como objetivo mostrar a los nuevos usuarios cómo adquirir espectros ATR-FTIR y preparar un modelo de regresión para la detección de p. falciparum de acuoso de las muestras de células de sangre rojas (RBC)¹⁰.

Protocolo

Por favor consulte apropiado Material hojas de datos de seguridad (MSDS) y buscan una formación de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los pasos de cultivo deben realizarse en un gabinete BSL-2 utilizando una técnica aséptica, es decir hay un riesgo de exposición a la radiación UV perjudicial de descontaminación, produzcan lesiones accidentales con agujas y posible exposición biológica y la infección si la cultura del parásito entra en cualquier lesión. Además, sangre stock de bancos de sangre sólo defendido por ciertas enfermedades y el potencial para la difusión de enfermedades transmitidas por sangre es un riesgo potencial. Buscar ayuda médica inmediata en la ocurrencia de lesiones.

1. preparación y medición de 3 7 serie de diluciones de parásito falciparum del Plasmodium

Nota: Plasmodium SP. cultura es altamente sensible. Utilizar reactivos frescos/no vencido y alimentar los parásitos regularmente cambiando los medios de comunicación. Alimentación cultivos por debajo de 5% de parasitemia cada dos días; alimentación de las culturas entre 6-10% parasitemia una o dos veces al día; y culturas entre 11-20% hasta 4 veces al día. Parásitos que están empezando a morir de hambre perderá su forma y comienzan a contraerse. En tal caso, la alimentación y diluir inmediatamente cambiando los medios de comunicación y agregando valores gr. recoger la sangre de donantes en tubos de sangre con heparina como anticoagulante y medida en las primeras 6 h.

1. Cultura un total de 30 mL de 3 7 tensión parásitos Plasmodium falciparum según el protocolo estándar hasta que la parasitemia alcanza 10% anillos.
2. Sincronización de parásitos
   1. 11 h después de shizogeny en el ciclo de vida del parásito, Resuspender el cultivo y la transferencia en un tubo cónico de 50 mL con una pipeta automática.
   2. Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones estándar de laboratorio (25° C y 100 kPa) durante 5 minutos.
   3. Eliminar el sobrenadante por elaborar con una pipeta o con una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora sin perturbar el pellet. Desechar el medio inútil en una solución de cloro 10%.
   4. Lentamente agregar 12 a 15 mL de solución del sorbitol el 4% en el sedimento con una pipeta automatizada y mezclar la cultura capsular y la inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.
   5. Incubar el cultivo a 37 ° C durante 15 minutos.
   6. Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones normales de laboratorio durante 5 minutos.
   7. Quite el sobrenadante como se describe en el paso 1.2.3.
   8. Añadir 10-15 mL de solución salina al 0.9% para el pellet y mezclar la solución de recubrimiento y inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.
   9. Repita el 1.2.6–1.2.8 pasos dos veces más para lavar todos los restos de sorbitol.
3. Preparación de la serie de diluciones de parasitemia
   1. Lave el stock de glóbulos rojos como en pasos 1.2.6–1.2.9.
   2. Centrifugar el cultivo en condiciones estándar de laboratorio, stock gr a 300-400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante como en el paso 1.2.3.
   3. Calificar a tubos de microcentrífuga de 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, % 0.100, 0.250%, 0,750% y 1.000% y añadir 0 μL, 1 μl, 2.5 μl, 7.5 μl, 10 μl, 25 μl, 75 μl y 100 μl del cultivo respectivamente, usando una pipeta de 0,2-20 μl.
   4. Añadir 100 μl, 99 μl, 97,5 μl, μl 92.5, 80 μl, 75 μl, 0 y 25 μl de caldo glóbulos rojos tubos con 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0,250%, 0,750% y 1.000%, respectivamente.
   5. Centrifugar la sangre de donante fresco almacenada en tubos de anticoagulante en 1.200 x g y condiciones normales de laboratorio durante 10 minutos.
   6. Retire el plasma elaborar con una pipeta y desechando como se describe en el paso 1.2.3.
   7. Agregar 900 μl de glóbulos rojos aislados en cada tubo de microcentrífuga y homogeneizar por inversión del tubo 10 x.
4. Adquisición espectral
   1. Utilizando el programa acompañamiento de adquisición espectral, haga clic en "Configuración del instrumento" y establecer los parámetros de colección de datos a la siguiente: 128 análisis de fondo; 32 análisis de la muestra; y la resolución 8/cm sobre la gama máxima de la muestra del instrumento.
   2. Ajuste la temperatura de la espectrómetro de ATR-FTIR por recomendación del fabricante o durante la noche.
   3. Limpie el cristal frotando suavemente en un movimiento circular usando pelusa gratis trapos humedecidos con agua ultrapura. Bien seque con otro paño libre de pelusa.
   4. Tomar una medida de fondo del aire haciendo clic en "Fondo de medición". Cada 20 minutos, limpie el cristal como en el paso 1.4.3 y repita esta medición.
   5. Abrir la vista en vivo haciendo clic en "Vista previa". Observar una línea de base plana, horizontal, que indica que el cristal esté limpio.
   6. Pipetear 10 μl de agua desionizada directamente en el centro del cristal y haz click en "Medida muestra". Repita esta medición de agua después de cada quinto muestra.
   7. Seque el cristal con un paño libre de pelusa y un movimiento circular suave.
   8. Pipetear 10 μl de muestra y haga clic en "Muestra de la medida".
   9. Limpie el cristal entre las muestras como en el paso 1.4.3.
   10. Repita hasta que se adquieren 3 repeticiones, para aleatorizar el orden de las muestras y las repeticiones.

2. multivariante análisis (MVDA)

Nota: Tratamiento de los datos debe hacerse sobre el conjunto de datos entero para evitar el ruido y la adición de picos de origen no biológico. En cambio, analizar sobre las regiones biológicamente relevantes: 2980-2800/cm y 1750/cm 850.

1. Tratamiento de los datos
   Nota: Dos software, por ejemplo, Matlab (en adelante denominado software 1) y la X del posicionador (en adelante denominado "software 2") se utilizan como ejemplos para MVDA. 1 el software tiene la capacidad de realizar MVDA sin la adición de una interfaz gráfica de usuario (GUI). Sin embargo, se recomienda comprar una interfaz gráfica (Tabla de materiales). Las siguientes instrucciones cuando refiriéndose al software 1 asumirá que es junto con la caja de herramientas GUI disponible comercialmente, y se ha colocado el script de tratamiento de datos de ejemplo.
   1. Abra el software de análisis de datos multivariante apropiado, haga clic en "Importar datos" y seleccione el tipo de archivo para su análisis.
      1. Programa 1, la entrada "Análisis" en la ventana comando para abrir la GUI. Haga clic derecho el X box para encontrar "Importar datos".
      2. En software 2, haga clic en la ficha "Archivo" para encontrar "Importación".
   2. Importar espectros muestra, agua y línea de base como conjuntos de datos en el espacio de trabajo seleccionando todos los espectros en cada juego por separado y haciendo clic en "Abrir" y dar a cada grupo un nombre corto, por ejemplo, 'wat' conjunto de datos de espectros de agua.
   3. Seleccione nueva tabla/matriz haciendo clic en "nueva matriz, Vector" y generar un vector n × 1, donde n es el número de muestras. La parasitemia de cada muestra de entrada y el vector de nombre "Parasitemia".
      1. En 1 de software, haga clic en "Nueva Variable" en la ventana de comandos.
      2. En software 2, haga clic en el icono "Nueva matriz".
   4. Trama de datos haciendo clic en el icono"trazar datos". Inspeccione los espectros para los efectos del vapor de agua haciendo clic en "Zoom" y zoom 1800-1400/cm; más claramente observado como picos corto, agudos, estrechos a lo largo de las laderas de la amida y amida grupos II.
   5. En casos extremo de vapor de agua, abra la pestaña Editar/pre-procesos de datos y seleccione "Suavizado". Reducir el ruido o el vapor de agua fuertes contribuciones mediante el suavizado de los espectros de la muestra y agua hasta 25 puntos de suavizado o usar un método de corrección de vapor de agua.
   6. Correcta línea de base no horizontales mediante el algoritmo de corrección de línea base si es apropiado, en la misma pestaña datos editar/pre-procesos de paso 2.1.4.
   7. Promedio de agua espectros y copie las filas en una matriz de m × n equivalente al conjunto de datos muestra y reducir al 70% de intensidad multiplicándolo por 0.7.
      1. Software 1, hacerlo en la ventana de comandos, introducir la siguiente secuencia de comandos "AverageWater=mean(WaterDataset)". Luego copiar y pegar las filas para que coincida con el conjunto de datos de muestra. Para reducir la intensidad, la entrada "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
   8. Reste la media del agua en espectros de cada espectro de la muestra.
      1. Software 1, hacerlo en la ventana de comandos introduciendo la siguiente secuencia de comandos "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
   9. Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos para aplicar una segunda función derivada y luego normalizar los datos mediante la selección de función de una variable normal (SNV) y significa centro de datos.
      1. Software 1, hacerlo de una sola vez. En primer lugar seleccione "Derivada" y entrados 25 puntos de suavizado, orden Polinómico de 3 orden derivado de la muestra mediante una función de Savitzky-Golay y 25 puntos de suavizado. Continuación, seleccione "SNV" y "Media Center". Haga clic en "OK/Apply".
   10. Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos y en la columna "Variables", seleccione 2.980 – 2.800/cm y 1.750 – 850/cm asegurándose de que sólo sus cajas son marcadas.
2. Análisis de datos
   1. Análisis de componentes principales (PCA)
      1. Haga clic en "Análisis | Descomposición"y seleccione de la PCA.
         1. En 1 de software, haga clic en "Modelo de construcción".
         2. Software 2, entrada de los métodos de la PCA. Entrada el número óptimo de componentes principales (PC) - en este trabajo, 7 - y un máximo de 100 iteraciones y seleccionar validación cruzada para el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".
      2. Respete el límite de confianza de 95%, el anillo de puntos, en una parcela de puntuaciones entre PC1 y PC2.
      3. Marque los espectros de la muestra con las puntuaciones que ocurren fuera del límite como potenciales valores extremos utilizando la herramienta"seleccionar espectros".
      4. Si los espectros marcados tienen alto Hotellings T² valores y altos residuos Q excluyen de análisis posterior.
   2. Regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R)
      1. Haga clic en "Análisis | Regresión de"y seleccione"PLS-R".
         1. Software 1, derecha haga clic en bloquear Y y seleccione el vector "Parasitemia | Construcción de modelo".
         2. Software 2, entrada de los métodos de PLS. Seleccione el vector "Parasitemia" como "Y de referencia" y el conjunto de datos muestra como "conjunto de datos X" y seleccionar validación cruzada como el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".
      2. Analizar el modelo de regresión. Valores de R² 0,80 y raíz cuadrada media de error de validación cruzada (RMSECV) los valores menores que 0.1% parasitemia son modelos aceptables.
      3. Analizar el vector de regresión e identificar las bandas biológicas.

Resultados

Trama de cuadrados mínimos parciales (PLS-R) y su vector de regresión asociado, Figura 1a y 1b respectivamente, muestran que la señal de los parásitos son bastante diferentes de los hematíes que pueden ser utilizados para formar una regresión lineal del modelo a utilizar para la predicción de parásitos en futuros conjuntos de datos.

Se generó un modelo de PLS-R robusto, lin...

Discusión

Modelo PLS-R es un método multivariante supervisado que encuentra una relación lineal, Y = bX + E, entre las variables predictoras X (aquí, la absorbancia en cada número) y una variable continua Y (aquí, el nivel de parasitemia). En Resumen, el modelo combina las variables en X para crear un nuevo conjunto de variables latentes (LVs) que capturan la varianza en X correlacionada con Y y calcula un vector de regresión (b) que multiplicados por los resultados de un nuevo espectro en la estimación del valor y. La fuer...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Donor blood	-	-	Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood	Australian Red Cross`	-
3D7 Plasmodium falciparum	The Burnet Institute	-	Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
Sorbitol	Sigma Aldrich	S1876	Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
Immersion Oil	Thermofisher	M3004
50 mL culture dishes	Falcon	353025
25mL pipette tips	Falcon	357515
10mL pipette tips	Falcon	357530
Microscope Slides	Sigma Aldrich	S8902
Centrifuge tubes 50 mL	Sigma Aldrich	T2318
Automated pipette controller	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab	Mathworks Inc		Multivariate data analysis software
The Unscrambler X	CAMO		Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		GUI for Matlab