검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화

요약

여기, 선물이 탐지 및 정량화의 변형 체 falciparum 감염 수성 적혈구 감쇠 총 반사 적외선 분석기 및 다변량 데이터 분석을 사용 하는 프로토콜.

초록

복수 데이터 분석 (와 함께에서 간단한 벤치탑 감쇠 총 반사 푸리에 변환 적외선 (ATR FTIR) 분석기를 사용 하 여 정량화 하는 방법 및 수성 적혈구 (Rbc)에 기생충의 탐지 설명 MVDA)입니다. 3D 7 P. falciparum 10 %parasitemia 링 무대 기생충에 교양 있었다 및 시리즈를 만들 희석 0-1 사이의 절연 신선한 기증자 Rbc 스파이크 사용 %. 10 µ L 각 샘플의 스펙트럼을 얻으려고 ATR 다이아몬드 윈도우의 중앙에 배치 했다. 샘플 데이터 취급 신호 대 잡음 비를 개선 하 고 물의 기여를 제거 하 고 두 번째 파생 스펙트럼 기능 해결에 적용 했다. 데이터 다음 MVDA의 두 종류를 사용 하 여 분석 했다: 어떤 outliers 그리고 부분 최소 제곱 회귀 (PLS-R) 정량화 모델 확인 첫 번째 주요 구성 요소 분석 (PCA).

서문

말라리아는 우리 시대의; 가장 치명적인 질병 중 하나입니다. 발병 지역에서 위험이 절반 이상의 인구가 살고 그리고 그것은 어울리지 않게 가난한^1,2,,34짐. 문제의 큰 부분 무 증상 사업자 및 초기 단계 환자⁵모기 벡터 대 한 저수지 역할을 젖은 계절 중에 감염의 스파이크를 일으키는 원인이 되 고 지역 사회에서 계속 하 허용 이다. 말라리아는 가장 치명적인 질병²의 가장 심각한 형태를 일으키는 원인이 되는 P. falciparum 은 5 변형 체 기생충에 의해 발생 합니다.

현재, 말라리아의 진단 위한 기술을 완벽 미만입니다. 광학 현미경 검사 법, 현재 골드 표준만 사용 되는 방법⁶에 따라 62-88 기생충 / µ L를 검색할 수 있습니다. 많이 하 고 많은 지역 현미경 오진에서 요구 하는 높은 기술 때문에 또한, >의 경우 50%, 특히 그 낮은 parasitaemia 레벨²는 직접의 영역에 리소스 부족에 기 인할 수 있다 안티-말라리아 약의 오용입니다. 다른 2 주요 진단 메서드는 급속 한 진단 테스트 (RDTs), 검색 및 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험, 차별 하 고 계량 DNA에서 기생충에 대 한 항 체를 활용 하는. 현재, RDTs만 치료 되는 질병의 희귀 한 형태로 발생 하는 혈액의 적어도 100 기생충 / µ L의 P. vivax 그리고 P. falciparum 감지 수 있습니다. ^{7 , 8} 반대로, PCR 분석 실험 차별 및 감도 0.0004-5의 변형 체 의 종 계량 기생충 / µ L의 혈액. 그러나, 그것은 비싼 시 약, 장비 및 기술, 필요 하 고 따라서 필드 응용 프로그램에 적합 하지 않습니다.

매우 민감한, 안정적이 고 저렴 한 기술 때 진단 시간을 따라서 환자 결과 개선 및 질병 제거를 가능 하 게 하 고 향상 시키기 위해 필수적 이다. 감쇠 총 반사 푸리에 변환 (ATR FTIR) 분광학이이 문제에 대 한 잠재적인 해결책을 제공합니다. 이전 작업으로 감지 하 고 고정 피 영화의 검출 한계를 달성 하는 메탄올에 P. falciparum 계량 가능 했다 나타났습니다 < 혈액의 1 기생 / µ L (< 0.0002 %parasitemia)⁹, PCR 방법에 비해. 최근 연구 결과 검출 및 계량 수성 샘플에서 기생충 따라서 정착 단계를 제거 하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 수증기, 스펙트럼 잡음 및 데이터 처리 같은 요인 최적의 결과¹⁰고려 될 필요가 있다.

이 프로토콜 ATR FTIR 스펙트럼을 취득 하 고 수성 적혈구 (RBC) 샘플¹⁰ P. falciparum 에의 검출에 대 한 회귀 모델을 준비 하는 방법 새 사용자를 표시 하는 것을 목표로.

프로토콜

적절 한 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하 고 적절 한 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 훈련을 추구 하십시오. BSL-2 캐비닛 무 균 기술을 사용 하 여, 의미 오염 제거 단계, 바늘 지팡이 상해, 및 생물 학적 노출 및 감염에서 유해한 UV 방사선에 노출의 모험 경우에 모든 자란 단계를 완료 해야 합니다 기생충 문화 어떤 상해를 입력합니다. 또한, 혈액 은행에서 주식 혈액은 특정 질병 및 혈액 질병 부담을 확산에 대 한 잠재적인 상영만 잠재적인 위험. 상해의 발생에 즉각적인 의료 처치를 추구 합니다.

1. 준비 및 3D 7의 측정 변형 체 falciparum 기생충 희석 시리즈

참고: 변형 체 sp. 문화는 매우 중요 한. 신선한/만료 시 약을 사용 하 고 미디어를 변경 하 여 기생충을 정기적으로 피드. 5 %parasitemia; 두 번째 매일 아래 피드 문화 하루에 한 두 번; 6-10 %parasitemia 사이의 문화를 피드 그리고 하루에 4 회 11 ~ 20% 사이의 문화를 피드. 기생충을 굶 어 시작 하는 그들의 모양을 분실 하 고 계약을 시작 합니다. 이러한 경우, 피드 및 미디어 변경 하 고 추가 주식 Rbc. 수집 기증자 혈액 혈액 컬렉션 튜브 응고 제 및 첫 번째 6 h 내에서 측정값으로 헤 파 린을 포함 하 여 즉시 희석.

1. 문화 3D 7의 30 mL의 총 변형 표준 프로토콜에 따라 변형 체 falciparum 기생충은 parasitemia 10% 반지에 도달할 때까지.
2. 기생충의 동기화
   1. 기생충의 수명 주기에 shizogeny 후 11 h resuspend 문화 및 자동된 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브로 전송.
   2. 300-400 g x 5 분에 대 한 표준 실험실 조건 (25 ° C와 100 kPa)에 문화 원심
   3. 피 펫 그리기 또는 진공에는 펠 렛을 방해 하지 않고 연결 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 여는 상쾌한을 제거 합니다. 10% 표 백제 솔루션으로 폐기물 미디어를 삭제 합니다.
   4. 천천히 자동된 피 펫을 사용 하 여 펠 릿을 4 %sorbitol 솔루션의 12-15 mL을 추가 하 고 상한 및 문화는 균질 성 때까지 튜브를 거꾸로 하 여 문화를 혼합.
   5. 15 분 동안 37 ° C에서 문화를 품 어.
   6. 300-400 g x 5 분에 대 한 표준 실험실 조건에서 문화 원심
   7. 1.2.3 단계에서 설명한 대로 상쾌한을 제거 합니다.
   8. 펠 릿을 0.9% 염 분의 10-15 mL을 추가 하 고 상한 및 문화는 균질 성 때까지 튜브를 거꾸로 하 여 솔루션을 혼합.
   9. 단계 1.2.6–1.2.8 sorbitol의 모든 잔재를 씻어 두 번 더 반복 합니다.
3. Parasitemia 희석 시리즈의 준비
   1. 세척 단계 1.2.6–1.2.9에서 Rbc 증권.
   2. 표준 실험실 조건, 5 분 동안 300-400 x g에서 Rbc 증권에서 문화 원심 하 고 상쾌한 1.2.3 단계에서 삭제.
   3. 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% 및 1.000%, microcentrifuge 튜브 라벨 고 0 µ L, 1 µ L, 2.5 µ L, 7.5 µ L, 10 µ L, 25 µ L, 75 µ L 및 문화의 각각 0.2-20 µ L 피 펫을 사용 하 여 100 µ L를 추가 합니다.
   4. 추가 100 µ L, 99 µ L, 97.5 µ L, 92.5 µ L, 80 µ L, 75 µ L, 25, 0 µ L 재고 RBCs의 관 이라는 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750%, 및 1.000%, 각각.
   5. 분리기 신선한 기증자 혈액 항 응 혈 약 튜브 1200 x g 및 10 분에 대 한 표준 실험실 조건에서 수집.
   6. 플라즈마는 피 펫 드로잉 하 고 1.2.3 단계에서 설명한 대로 삭제 하 여 제거 합니다.
   7. 각 microcentrifuge 튜브로 격리 된 RBCs의 900 µ L을 추가 하 고 10 배를 반전 하 여 철저 하 게 혼합.
4. 스펙트럼 획득
   1. 동반 스펙트럼 수집 프로그램을 사용 하 여, "악기 설정"을 클릭 하 고 다음에 데이터 컬렉션 매개 변수를 설정: 배경에; 128 검색 32 스캔 샘플; 그리고 8/cm 악기의 최대 샘플 범위를 해결.
   2. 하룻밤 또는 제조업체의 추천 당 ATR FTIR 계의 온도 설정 합니다.
   3. 크리스탈 원형 모션 린 트를 사용 하 여 무료 잎사귀 초순 물 적셔 부드럽게 닦 고 하 여 청소. 다음 다른 린 트 무료 지우기를 사용 하 여 완전히 건조 합니다.
   4. "배경 측정"를 클릭 하 여 공기의 배경 측정을 가져가 라. 모든 20 분 단계 1.4.3에서 크리스탈을 청소 하 고이 측정을 반복.
   5. "미리 보기"를 클릭 하 여 라이브 뷰를 엽니다. 크리스탈이 깨끗 한 나타내는 평면, 수평 기준선을 관찰 합니다.
   6. 10 µ L의 중간에 직접 이온된 수의 플라스틱을 "샘플 측정"을 클릭 합니다. 모든 5 샘플 후이 물 측정을 반복 합니다.
   7. 크리스탈 린 트 무료 지우기와 부드러운 원형 모션을 사용 하 여 건조.
   8. 플라스틱 샘플의 10 µ L을 "샘플 측정"을 클릭 합니다.
   9. 크리스탈 단계 1.4.3에서 샘플 사이 청소.
   10. 3 복제 인수, 샘플 및는 복제의 순서를 무작위로 확인 될 때까지 반복 합니다.

2. 다변량 데이터 분석 (MVDA)

참고: 데이터 처리 수행 되어야 합니다 전체 데이터 집합을 통해 소음과 비 생물학 근원의 봉우리의 추가 피하기 위하여. 반면, 생물학으로 관련 된 지구에 분석: 2980-2800/cm와 1750-850/cm.

1. 데이터 처리
   참고: 두 개의 소프트웨어, 예를 들면, Matlab (향후 소프트웨어 1 이라고 함)와 (이제 소프트웨어 2 라고도 함)는 Unscrambler X MVDA에 대 한 예제로 사용 됩니다. 소프트웨어 1은 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 추가 없이 MVDA 수행 수 있습니다. 그러나, GUI (테이블의 재료)를 구입 하는 것이 좋습니다. 가정 것 이다 소프트웨어 1 참조 하는 경우 다음 지침에 따라 상업적으로 사용할 수 있는 GUI 도구 상자와 함께에서 이며 예제 데이터 처리 스크립트 첨부 되었습니다.
   1. 적절 한 다변량 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다, 그리고 "데이터 가져오기"를 클릭 하 고 분석을 위해 파일의 유형을 선택 합니다.
      1. 1 소프트웨어에서 GUI를 열려면 명령 창에 "분석"을 입력 합니다. 오른쪽 X 상자 찾을 "데이터 가져오기"를 클릭 합니다.
      2. 2 소프트웨어에서 "가져오기"를 찾으려고 "파일" 탭을 클릭 합니다.
   2. 별도로 각 집합에서 모든 스펙트럼을 선택 하 고 "열기"를 클릭 하 여 작업 영역에 데이터 집합으로 샘플, 물, 기준선 스펙트럼을 가져올 고 각 설정 예를 들어, '와트' 물 스펙트럼의 데이터 집합에 대 한 짧은 이름을 합니다.
   3. "새로운 행렬/벡터"를 클릭 하 여 새 테이블/행렬을 선택 하 고 n은 샘플의 수 n × 1 벡터를 생성. 각 샘플의 parasitemia를 입력 하 고 이름을 벡터는 'Parasitemia'.
      1. 1 소프트웨어에서 명령 창에 있는 "새 변수"을 클릭 합니다.
      2. 2 소프트웨어에서 "새로운 매트릭스" 아이콘을 클릭 합니다.
   4. "플롯 데이터 아이콘"을 클릭 하 여 데이터를 플롯 합니다. "확대"를 클릭 하 여 확대 1800-1400/cm; 수증기 효과 대 한 스펙트럼을 검사 가장 명확 하 게 관찰는 아 미드의 경사면을 따라 짧고, 날카로운, 좁은 봉우리로 나 아 미드 II 밴드.
   5. 극단적인 수증기의 경우, 편집/사전 과정 데이터 탭을 열고 "스무 딩"을 선택 합니다. 잡음 및 강한 수증기 기여 스무 딩의 최대 25 포인트를 사용 하 여 샘플 및 물 스펙트럼을 부드럽게 하 여 줄이거나 수증기 수정 방법을 사용 하 여.
   6. 2.1.4 단계에서 동일한 편집/사전 과정 데이터 탭에서 해당 되는 경우 기본 보정 알고리즘을 사용 하 여 올바른 비 수평 기준선.
   7. 물 스펙트럼 평균 샘플 데이터 집합에 해당 n × m 행렬에 행을 복사 하 고 0.7을 곱하여 70% 강도를 감소.
      1. 1 소프트웨어에서 그렇게 명령 창에서 다음 스크립트 "AverageWater=mean(WaterDataset)"를 입력 하 여. 그런 다음 복사-붙여넣기 행 일치 하는 샘플 데이터 집합을. 농도를, 입력 "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
   8. 각 샘플의 스펙트럼에서 평균 물 스펙트럼을 뺍니다.
      1. 1 소프트웨어에서 그렇게 명령 창에서 다음 스크립트를 입력 하 여 "WaterCorrectedData SampleDataset-AverageWater70 =".
   9. 두 번째 파생 기능을 적용 하 고 다음 단일 정상적인 변량 (SNV) 기능을 선택 하 여 데이터를 정규화 센터 데이터 의미 편집/사전 과정 데이터 탭을 엽니다.
      1. 1 소프트웨어에서 한 가지에 이렇게. 먼저 "" 및 스무 딩, 3의 다항식 순서 및 스무 딩의 25 점과 Savitzky Golay 함수를 사용 하 여 설정 하는 샘플에 파생 순서 입력된 25 포인트를 선택 합니다. 다음 선택 "SNV"와 "센터"를 의미 합니다. "좋아/적용"을 클릭 합니다.
   10. 편집/사전 과정 데이터 탭을 열고 선택한 변수에"열", 2980-2800/cm와 1, 750-850/cm 그들의 상자를만 났는 다는 것을 확인 합니다.
2. 데이터 분석
   1. 주요 구성 요소 분석 (PCA)
      1. 클릭 "분석 | 분해"고 선택 PCA입니다.
         1. 1 소프트웨어에서 "빌드 모델"을 클릭 합니다.
         2. 2 소프트웨어에서 PCA 메서드를 입력 합니다. 이 작품에서-7-주 구성 요소 (PCs)의 최적의 수 입력 100 번 및 유효성 검사 방법에 대 한 선택 교차 유효성 검사의 최대. "실행"을 클릭 합니다.
      2. 95% 신뢰 한계, p c 1과 PC2 사이 점수 플롯에서 점선된 반지를 관찰 합니다.
      3. 샘플 스펙트럼으로 잠재적인 outliers "선택 스펙트럼 도구"를 사용 하 여도 밖에 서 발생 하는 점수를 표시 합니다.
      4. 만약 표시 된 스펙트럼 높은 Hotellings T² 값과 높은 Q 오차 제외 그들 추가 분석에서.
   2. 부분 최소 제곱 회귀 (PLS-R)
      1. 클릭 "분석 | 회귀"그리고 선택" PLS-R ".
         1. 소프트웨어 1, 오른쪽 Y 블록을 클릭 하 고 선택 벡터 "Parasitemia | 모델 작성할 ".
         2. 2 소프트웨어, PLS-R 메서드를 입력 합니다. "Y" 및 샘플 데이터 집합으로 "X 데이터 집합" 및 유효성 검사 방법으로 선택 교차 유효성 검사로 벡터 "Parasitemia"를 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다.
      2. 회귀 모델을 분석 합니다. 0.80 및 교차 유효성 검사 (RMSECV) 값을 0.1 %parasitemia 보다는 더 적은의 평균 제곱근 오차 R² 값은 수락 가능한 모델입니다.
      3. 회귀 벡터 분석 및 생물 학적 밴드를 식별 합니다.

결과

부분 최소 제곱 (PLS-R) 플롯 및 그것의 관련 된 회귀 벡터, 그림 1a 및 1b 각각 기생충에서 신호는 충분히 Rbc 양식에 사용 되는 선형 회귀 모델에 사용할 수 있는 다른 표시는 미래의 데이터 세트에서 기생충 예측

강력 하 고, 선형 PLS-R 모델 0.87의 R-제곱 값이 생성 하 고 루트 평균 제곱

토론

PLS-R 모델은 Y 선형 관계를 찾는 감독된 복수 방법 = bX + E, 예측 변수 X 사이 (여기에서, 각 wavenumber에 흡 광도)와 연속 변수 Y (여기, parasitemia 수준). 모델 변수 x Y, X 상관에 차이 캡처 잠재 변수 (LVs)의 새로운 집합을 만들 결합 하 고 회귀 벡터 (b)를 계산 하는 즉, 새로운 스펙트럼 결과 y 값의 추정에 의해 하는. 모델의 강도 두 값에서 반입할 수 있습니다: R² 값과 평균 제곱근 오차의 교차 유?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Donor blood	-	-	Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood	Australian Red Cross`	-
3D7 Plasmodium falciparum	The Burnet Institute	-	Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
Sorbitol	Sigma Aldrich	S1876	Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
Immersion Oil	Thermofisher	M3004
50 mL culture dishes	Falcon	353025
25mL pipette tips	Falcon	357515
10mL pipette tips	Falcon	357530
Microscope Slides	Sigma Aldrich	S8902
Centrifuge tubes 50 mL	Sigma Aldrich	T2318
Automated pipette controller	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab	Mathworks Inc		Multivariate data analysis software
The Unscrambler X	CAMO		Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		GUI for Matlab