Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

Özet

Burada, bir protokol için Plasmodium falciparum miktar virüslü sulu kırmızı kan hücrelerinde bir zayıflatılmış toplam yansıma kızılötesi Spektrometre ve çok değişkenli veri analizi kullanarak ve algılama mevcut.

Özet

Biz miktar yöntemi ve parazitler ve sulu kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) algılama çok değişkenli veri analizi () ile birlikte basit benchtop zayıflatılmış toplam yansıma Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spektrometresi kullanılarak göstermek MVDA). 3D 7 P. falciparum % 10 parasitemia yüzük sahne parazitler için kültürlü ve seri 0-1 arasında bir seyreltme oluşturmak için taze donör izole RBCs spike için kullanılan %. Her örneğinin 10 µL spektrum elde etmek için ATR elmas pencerenin ortasına yerleştirildi. Örnek verileri sinyal gürültü oranı artırmak için ve su katkısını kaldırmak için tedavi edildi ve sonra ikinci türev spektral özellikleri gidermek için uygulandı. Verileri daha sonra MVDA iki tür kullanarak analiz edildi: ilk asıl bileşen analizi (herhangi bir aykırı ve sonra kısmi en küçük kareler regresyon (PLS-R) miktar model oluşturmak için belirlemek için PCA).

Giriş

Sıtma bizim zaman en yıkıcı hastalıklar arasında olduğunu; endemik bölgelerde risk yarım nüfus yaşıyor ve orantısız yoksul^1,2,3,4durumu. Sorunun büyük bir parçası asemptomatik taşıyıcılar ve toplumlarda kalıcı olması izin ve sivri enfeksiyon sırasında ıslak mevsim neden rezervuarlar için sivrisinek vektörel çizimler⁵, aracı olarak erken sahne hastalar var. Sıtma en ölümcül hastalık²en ağır formu neden P. falciparum olduğunu beş Plasmodium parazitler tarafından nedeniyle oluşur.

Şu anda, sıtma tanısı için mükemmel daha az tekniklerdir. Optik mikroskobu, geçerli altın standart, sadece 62-88 parazitler/µL kullanılan yöntem⁶bağlı olarak algılayabilir. Ayrıca, intensiveness ve yüksek beceri gerekli, birçok bölgeler mikroskopi misdiagnoses nedeniyle > özellikle düşük parasitaemia sahip olanlar doğrudan kaynakları alanında ve sonuçlarında eksikliği bağlanabilir², seviyesi %50 Olguların anti-sıtma ilaçları suistimal. Hızlı tanı antikorlar algılama ve ayırımcılık ve parazitlerin DNA'ölçmek polimeraz zincir tepkimesi (PCR) deneyleri için kullanan testleri (RDTs), diğer 2 ana tanı yöntemleri vardır. Şu anda, RDTs sadece P. falciparum ve P. bağlı en az 100 parazit/µL kan hastalığı tedavi edilmezse nadir formlarda kaynaklanan tespit edebiliyoruz. ^{7 , 8} buna ek olarak, PCR deneyleri ayırımcılık ve Plasmodium farklı tür bir duyarlılık 0.0004-5, ölçmek parazitler/µL kan. Ancak, bu pahalı reaktifler, ekipman ve teknik beceri gerektirir ve böylece alan uygulama için uygun değildir.

Son derece hassas, güvenilir ve uygun fiyatlı bir teknik tanı kez, böylece hasta sonuçları iyileştirilmesi ve hastalık ortadan kaldırılması mümkün hale geliştirmek için önemlidir. Zayıflatılmış toplam yansıma Fourier dönüşümü (ATR-FTIR) spektroskopisi bu sorun için olası bir çözüm sunar. Önceki çalışma algılamak ve P. falciparum kan filmler algılama sınırları elde sabit metanol ölçmek mümkün olduğunu göstermiştir < 1 parazit/µL kan (< %0.0002 parasitemia) PCR yöntemleri için karşılaştırılabilir olan⁹,. Son yıllarda yapılan çalışmalarda algılamak ve parazitler sulu örneklerinde ölçmek ve böylece fiksasyon adım ortadan kaldırmak mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, su buharı, spektral gürültü ve veri tedavi gibi faktörler en iyi sonuçları¹⁰için dikkate alınması gerekir.

Yeni kullanıcılar ATR-FTIR spectra almak ve sulu kırmızı kan hücreleri (RBC) örnekleri¹⁰ P. falciparum tespiti için bir regresyon modeli hazırlamak nasıl göstermek için bu protokolü amaçlamaktadır.

Protokol

Lütfen uygun malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) başvurun ve uygun seviye 2 (BSL-2) eğitim aramak. Tüm kodlamayla adımları aseptik teknik kullanılarak, eğer zararlı UV ışınlarına maruz dekontaminasyon adımları, iğne sopa yaralanmalar ve biyolojik etkilenme olasılığını ortadan kaldırmak ve enfeksiyon riski olduğu anlamına gelir bir BSL-2 dolapta yapılmalıdır parazit kültür herhangi bir yaralanma girer. Ayrıca, stok kan kan bankalardan belirli hastalıklar ve kan hastalıkları kaynaklı yaymak için potansiyel ekranlı sadece potansiyel bir risk olduğunu. Yaralanma oluşumunu acil tıbbi yardım isteyin.

1. hazırlık ve 3D 7 ölçümü Plasmodium falciparum parazit seyreltme serisi

Not: Plasmodium sp. kültür son derece duyarlıdır. Taze/geçmemiş reaktifler kullanın ve parazitler düzenli olarak medya değiştirerek yem. Besleme kültürleri % 5 parasitemia iki günde aşağıda; kültürler arasında 6-%10 parasitemia bir veya iki kez bir gün besleme; ve kültürler arasında 11 – %20 4 kere a gün kadar yem. Açlıktan ölmeye başlıyor parazitler kaybetmek onların şekil ve sözleşme başlar. Böyle bir durumda, yem ve hemen da medyayı değiştirerek ve hisse senedi RBCs. toplamak donör kan antikoagülan ve ilk 6 saat içinde ölçü olarak heparin içeren kan toplama tüpler ekleyerek oranında seyreltin.

1. Kültür 3D 7 30 mL toplam parasitemia % 10 yüzük ulaşıncaya kadar Plasmodium falciparum parazitler standart protokolüne göre süzün.
2. Parazitler ve eşitleme
   1. 11 h parazit yaşam döngüsü içine shizogeny sonra resuspend kültür ve transfer bir otomatik pipet kullanarak bir 50 mL konik tüp içine.
   2. 300-400 x g ve 5 min için Standart laboratuvar koşulları (25 ° C ve 100 kPa) kültür santrifüj kapasitesi.
   3. Süpernatant pipet ile çizim veya pelet bozmadan bir vakuma bağlı bir Pasteur pipet kullanarak kaldırın. Atık medya % 10 çamaşır suyu çözüm atın.
   4. Yavaş yavaş 12-15 mL % 4 sorbitol çözeltisi kullanarak bir otomatik pipet Pelet ve kapatma ve kültür homojen olana tüp ters çevirme kültür karıştırın.
   5. 15 dakika 37 ° C'de kültür kuluçkaya.
   6. 300-400 x g ve 5 min için Standart laboratuvar koşulları kültür santrifüj kapasitesi.
   7. Süpernatant 1.2.3 adımda anlatıldığı gibi kaldırın.
   8. 10-15 mL % 0,9 serum için Pelet ve çözüm kapatma ve kültür homojen olana tüp ters çevirme karıştırın.
   9. Adımları 1.2.6–1.2.8 sorbitol tüm kalıntıları yıkamak için iki kez daha tekrarlayın.
3. Parasitemia seyreltme serisi hazırlanması
   1. Stok RBCs adımları 1.2.6–1.2.9 olduğu gibi yıkayın.
   2. Standart laboratuvar koşulları, hisse senedi RBCs 300 – 400 x g 5 min için de, kültür santrifüj kapasitesi ve süpernatant adım 1.2.3 olduğu gibi atın.
   3. Microcentrifuge tüpler % 0, %0.010, % 0,025, %0.075, %0,100, %0,250, %0.750 ve %1.000 etiketleyin ve 0 µL, 1 µL, 2.5 µL, 7.5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL ve kültürünün sırasıyla 0,2-20 µL pipet kullanarak 100 µL ekleyin.
   4. 100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92.5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 ve 0 µL stokunun RBCs tüpler etiketli %0, %0.010, % 0,025, %0.075, %0,100, %0,250, %0.750 ve %1.000, sırasıyla ekleyin.
   5. 1200 x g ve 10 min için Standart laboratuvar koşulları, antikoagülan tüpler santrifüj taze donör kan toplanır.
   6. Bu bir pipet ile çizerek ve 1.2.3. adımda açıklandığı gibi atarak plazma kaldırın.
   7. İzole RBCs 900 µL her microcentrifuge tüp içine ve 10 x ters çevirme tarafından iyice karıştırın.
4. Spektral edinme
   1. Eşlik eden spektral satın alma programı kullanarak, "Enstrüman Set-Up" tıklatın ve veri koleksiyon parametrelerini şu şekilde ayarlayın: 128 taramalar için arka plan; örnek için 32 inceden inceye gözden geçirmek; ve çözünürlük 8/cm enstrümanın en büyük örnek aralığında.
   2. ATR-FTIR Spektrometre üreticisinin tavsiye başı sıcaklık ayarlayın veya bir gece.
   3. Kristal ücretsiz mendil Ultrasaf Su ile nemlendirilmiş lint kullanarak dairesel bir hareketle hafifçe ovma tarafından temiz. O zaman başka bir tüysüz ücretsiz temizleme işlemi kullanarak iyice kurulayın.
   4. "Arka plan ölçüm" tıklatarak arka plan ölçüm hava almak. Her 20 dk, kristal adım 1.4.3 olduğu gibi temiz ve bu ölçüm yineleyin.
   5. Canlı görüntü "Önizleme" seçeneğini tıklatarak açın. Kristal temiz olduğunu gösterir bir düz, yatay temel gözlemlemek.
   6. Deiyonize su doğrudan orta kristalin üzerinde 10 µL pipet ve "Ölçü örnek"'ı tıklatın. Her beşinci örnek sonra bu su ölçüm yineleyin.
   7. Tüysüz ücretsiz mendil ve yumuşak dairesel hareketlerle kullanarak kristal kuru.
   8. Örnek 10 µL pipet ve "Ölçü örnek"'ı tıklatın.
   9. Adım 1.4.3 olduğu gibi örnek arasında kristal temiz.
   10. Örnekleri ve çoğaltır sırasını rastgele emin 3 çoğaltır iktisap kadar yineleyin.

2. çok değişkenli veri analizi (MVDA)

Not: Veri tedavi tüm veri kümesi üzerinde gürültü ve biyolojik olmayan kökenli doruklarına ilavesi önlemek için yapmanız gerekir. Buna ek olarak, biyolojik olarak ilgili bölgeleri üzerinde analiz: 2980-2800/cm ve 1750-850/cm.

1. Veri tedavi
   Not: İki yazılım, Örneğin, Matlab (bundan böyle 1 yazılım olarak da adlandırılır) ve Unscrambler (bundan böyle 2 yazılım olarak da adlandırılır) X MVDA için örnek olarak kullanılır. Yazılım 1 MVDA bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) ek gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Ancak, bu bir GUI (Tablo reçetesi) satın almak için tavsiye edilir. Yazılım 1 atıfta bu üstlenecek yaparken aşağıdaki talimatlara piyasada bulunan GUI araç kutusu ile birlikte, ve örnek veri tedavi senaryo bağlı.
   1. Uygun çok değişkenli veri analizi yazılımı açın, "Veri al" seçeneğini tıklatın ve çözümleme için dosya türünü seçin.
      1. Yazılım 1, "Analiz" GUI açmak için command window içine girdi. Sağ X box "Veri al" bulmak için tıklatın.
      2. Yazılım 2, "Alma" bulmak için "dosya" sekmesini tıklatın.
   2. Tüm spectra her kümede ayrı ayrı seçip "Aç" düğmesini tıklatarak veri kümeleri olarak örnek, su ve temel spectra çalışma alanına alma ve her kümesi, Örneğin, 'wat' su spectra ürününün veri kümesi için kısa bir ad verin.
   3. Yeni Tablo/Matris "yeni Matrix/vektör" tıklatarak seçin ve n örnek sayısına nerede bir n × 1 vektör oluşturmak. Her örnek parasitemia giriş ve vektör 'Parasitemia' adını verin.
      1. Yazılım 1, "Yeni değişken" komut penceresinde tıklatın.
      2. Yazılım 2, "Yeni Matrix" simgesini tıklatın.
   4. Verileri ' "Çizmek veri simgesini" çizmek. "Zoom" tıklayarak ve 1800-1400/cm üzerinde yakınlaştırma spectra su buharı efektler için incelemek; en açık biçimde gözlenen Amid yamaçları boyunca kısa, keskin, dar tepeler olarak ben ve Amid II bantları.
   5. Aşırı su buharı durumlarda Düzenle/pre-process data sekmesini açın ve "Düzeltme" seçin. Gürültü ve/veya güçlü su buharı katkıları düzgünleştirme 25 puan kullanarak örnek ve su spectra yumuşatma tarafından azaltmak veya su buharı düzeltme yöntemini kullanabilirsiniz.
   6. Uygunsa, adım 2.1.4 aynı Düzenle/pre-process veri sekmesindeki temel düzeltme algoritması kullanarak doğru yatay-temel.
   7. Su spectra ortalama ve örnek veri kümesi için eşdeğer bir n × m matris satırları kopyalayın ve 0,7 tarafından çarpılarak % 70 yoğunluğu azaltmak.
      1. Yazılım 1, bunu komut penceresinde aşağıdaki komut dosyası "AverageWater=mean(WaterDataset)" girerek. Sonra Kopyala-Yapıştır örnek veri kümesi eşleşen satırları. Giriş yoğunluğu azaltmak için "AverageWater70 AverageWater = * 0,70".
   8. Her örnek spektrum üzerinden ortalama su spectra çıkarma.
      1. Yazılım 1, komut penceresinde aşağıdaki komut dosyası girerek bunu "WaterCorrectedData SampleDataset-AverageWater70 =".
   9. İkinci türev işlevi uygular ve sonra verileri tek normal değişken (SNV) işlevi seçerek normal duruma getirmeye ve ortalama Merkezi veri Düzenle/pre-process veri sekmesini açın.
      1. Yazılım 1, tek seferde bunu. Önce "Türev" ve giriş 25 puan yumuşatma, polinom 3 sırasını ve düzgünleştirme 25 puan ve çetinkaya-deniyordun işlevini kullanarak Ayarla örnek üzerinde türev sipariş seçin. O zaman seçme "SNV" ve "Demek Merkez". Tamam/Uygula "'ı" tıklatın.
   10. Düzenle/pre-process data sekmesini açın ve sadece onların kutuları işaretli olmasını sağlayarak 2.980-2800/cm ve 1750 – 850/cm "Sütun değişkenleri", seçin.
2. Veri Analizi
   1. Asıl adı bileşen analizi (PCA)
      1. Tıklatın "analiz | Ayrışma"ve seçme PCA.
         1. Yazılım 1, "Model inşa"'i tıklatın.
         2. Yazılım 2, PCA yöntemleri girdi. En iyi dizi sorumlusu bileşen (adet) - iş, 7 - giriş ve en çok 100 yinelemeden ve seçim çapraz doğrulama için doğrulama yöntemi. "Çalıştır" ı tıklatın.
      2. % 95 güven sınırı, kesikli halkada puanları Arsa PC1 ve PC2 arasında gözlemlemek.
      3. Örnek spectra sınırı dışında "Seçin Spectra aracı" kullanarak potansiyel aykırı ortaya puanları ile işaretleyin.
      4. İşaretli spectra yüksek varsa Hotellings T² değerleri ve yüksek Q fazlalıklar onları daha fazla çözümleme dışı bırakmak.
   2. Kısmi en küçük kareler regresyon (PLS-R)
      1. Tıklatın "analiz | Regresyon"ve seçme"PLS-R".
         1. Yazılım 1, şu Y bloğu'nu tıklatın ve vektör seçin "Parasitemia | Model oluşturmak".
         2. Yazılım 2, PLS-R yöntemleri girdi. "Parasitemia" vektör seçim çapraz doğrulama doğrulama yöntemi olarak örnek veri kümesi olarak "X veri kümesi" ve "Y başvuru" olarak seçin. "Çalıştır" ı tıklatın.
      2. Regresyon modelini analiz. R² değerleri üzerinden 0,80 ve %0,1 parasitemia daha az olan çapraz doğrulama (RMSECV) değerleri, ortalama karekök hata kabul edilebilir modellerdir.
      3. Regresyon vektör analiz ve biyolojik grupları tanımlar.

Sonuçlar

Kısmi en küçük kareler (PLS-R) Arsa ve onun ilişkili regresyon vektör, Şekil 1a ve 1b sırasıyla, parazit sinyal bir doğrusal regresyon modeli için kullanılacak form için kullanılabilir RBCs yeterince farklı olduğunu göstermektedir tahmin parazitler ve gelecekteki veri kümesi.

Sağlam, doğrusal PLS-R modeli 0,87 bir R-kare değeri ile oluşturulan ve %0.13 parasite...

Tartışmalar

PLS-R modeli Doğrusal bir ilişki, Y bulduğu bir yöntemdir denetimli birden fazla varyasyon = bX + E on, akıllı değişken X arasındaki (burada, her wavenumber absorbans) ve sürekli değişken Y (burada, parasitemia düzey). Kısacası, model değişkenleri x korelasyon x ile Y farkı yakalamak gizli değişkenler (LVs) yeni bir dizi oluşturmak için birleştirir ve regresyon vektör (b) hesaplar bu y değeri tahmin yeni bir spektrum sonuçları ile çarpılır. İki değer modeli gücünü alınabilir: R²

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Donor blood	-	-	Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood	Australian Red Cross`	-
3D7 Plasmodium falciparum	The Burnet Institute	-	Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
Sorbitol	Sigma Aldrich	S1876	Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
Immersion Oil	Thermofisher	M3004
50 mL culture dishes	Falcon	353025
25mL pipette tips	Falcon	357515
10mL pipette tips	Falcon	357530
Microscope Slides	Sigma Aldrich	S8902
Centrifuge tubes 50 mL	Sigma Aldrich	T2318
Automated pipette controller	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab	Mathworks Inc		Multivariate data analysis software
The Unscrambler X	CAMO		Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		GUI for Matlab