Détection et Quantification de Plasmodium falciparum dans aqueux globules rouges par atténuée totale réflexion spectroscopie infrarouge et analyse de données

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification de Plasmodium falciparum infectés aqueuse globules rouges à l’aide d’un spectromètre infrarouge de la réflexion totale atténuée et analyse de données multivariées.

Résumé

Nous démontrons une méthode de dosage et détection des parasites en solution aqueuse des globules rouges (hématies) en utilisant une simple paillasse atténuée totale réflexion Fourier Transform (IRTF) spectromètre infrarouge conjointement avec (analyse de données LCVA). 3 7 P. falciparum ont été cultivés à 10 % parasitémie anneau stade des parasites et utilisé pour doper les globules rouges fraîches donateur isolé afin de créer une dilution série entre 0 – 1 %. 10 µL de chaque échantillon ont été placés au centre de la fenêtre de diamant de RTA pour acquérir le spectre. Les exemples de données a été traitées afin d’améliorer le rapport signal sur bruit et à supprimer la contribution de l’eau, et alors la dérivée seconde a été appliquée pour résoudre des caractéristiques spectrales. Les données ont été ensuite analysées à l’aide de deux types de LCVA : première analyse de composantes principales (ACP) pour déterminer les valeurs aberrantes puis régression des moindres carrés partiels (PLS-R) pour construire le modèle de quantification.

Introduction

Le paludisme est parmi les maladies les plus dévastatrices de notre époque ; plus de la moitié de la population vit en péril dans les régions d’endémie et il pèse disproportionnellement faible^1,2,3,4. Une grande partie de la question est les porteurs asymptomatiques et tôt les patients de stade qui agissent comme des réservoirs de moustiques vecteurs⁵, causant des pointes d’infection au cours de la saison humide et ce qui lui permet de persister dans les collectivités. Le paludisme est causé par des parasites Plasmodium cinq, la plus meurtrière dont est à P. falciparum , qui provoque la forme la plus sévère de la maladie².

Actuellement, les techniques pour le diagnostic du paludisme sont loin d’être parfaites. La microscopie optique, la norme actuelle de l’or, peut seulement détecter 62-88 parasites/µL selon la méthode utilisée⁶. En outre, en raison de la forte intensité et hautes compétences requises, dans nombreuses régions microscopie échogrammes > 50 % des cas, en particulier ceux avec faible parasitémie niveaux², qui sont directement attribuables au manque de ressources dans le domaine et les résultats en l’utilisation abusive de médicaments antipaludiques. Les 2 autres méthodes diagnostiques principales sont des Tests de Diagnostic rapide (TDR), qui utilisent des anticorps pour la détection et des essais de réaction en chaîne de la polymérase (PCR), qui discriminent et quantifier les parasites de l’ADN. Actuellement, les TDR sont seulement capables de détecter P. falciparum et P. vivax d’au moins 100 parasites/µL de sang résultant en des formes plus rares de la maladie étant non traitée. ^{7 , 8} en revanche, tests de PCR discriminer et quantifier les différentes espèces de Plasmodium à une sensibilité de 0,0004-5 parasites/µL de sang. Toutefois, elle nécessite des réactifs coûteux, des équipements et des compétences techniques et n’est donc pas approprié pour l’application sur le terrain.

Une technique très sensible, fiable et abordable est essentielle pour améliorer les temps de diagnostic et ainsi améliorer les résultats pour les patients et permettant l’élimination de la maladie. Atténué totale réflexion spectroscopie transformée de Fourier (IRTF) offre une solution à ce problème. Travaux antérieurs ont montré qu’il était possible de détecter et de quantifier à P. falciparum dans le méthanol fixé des frottis sanguins, atteindre les limites de détection de < 1 parasite/µL de sang (< 0,0002 % parasitémie)⁹, qui est comparable aux méthodes PCR. Des études récentes ont montré qu’il est possible de détecter et quantifier des parasites dans des échantillons aqueux et ainsi éliminer l’étape de fixation. Cependant, des facteurs tels que la vapeur d’eau, le bruit spectrale et traitement des données doivent être prises en considération pour des résultats optimaux,¹⁰.

Ce protocole vise à montrer aux nouveaux utilisateurs comment acquérir des spectres IRTF- et préparer un modèle de régression pour la détection de P. falciparum d’aqueux d’échantillons de globules rouges (RBC)¹⁰.

Protocole

Veuillez consulter approprié matériel fiches signalétiques (FS) et le solliciter une formation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Toutes les étapes de culture doivent se faire dans un cabinet de BSL-2 à l’aide d’une technique aseptique, indiquant qu’il existe un risque d’exposition aux rayonnements UV nocifs de mesures de décontamination, blessures par piqûre d’aiguille et biologiques potentiels d’exposition et l’infection si la culture du parasite pénètre dans les blessures. En outre, le sang stock provenant des banques de sang est seulement projeté pour certaines maladies et le potentiel de propagation de maladies à diffusion hématogène représente un risque potentiel. Chercher une aide médicale immédiate dans la survenue de blessures.

1. préparation et mesure de 3 7 séries de dilutions pour le Parasite Plasmodium falciparum

Remarque : La culture de Plasmodium sp est très sensible. Utiliser des réactifs frais/expirés et nourrir les parasites régulièrement en changeant les médias. Cultures fourragères au-dessous de parasitémie 5 % tous les deux jours ; flux des cultures entre 6-10 % parasitémie une ou deux fois par jour ; et se nourrir des cultures entre 11 et 20 % jusqu'à 4 fois par jour. Parasites qui sont en train de mourir de faim vont se déforment et commencent à se contracter. Dans ce cas, se nourrissent et diluer immédiatement en changeant les médias et en ajoutant des stock RBCs. recueillir le sang du donneur dans les tubes de prélèvement sanguin contenant de l’héparine comme anticoagulant et mesure dans les 6 premières heures.

1. Un total de 30 mL de 3 7 la culture souche parasites Plasmodium falciparum selon le protocole standard jusqu'à ce que la parasitémie atteigne 10 % anneaux.
2. Synchronisation des parasites
   1. 11 h après shizogeny dans le cycle de vie du parasite, remettre en suspension de la culture et les transvaser dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette automatisée.
   2. Centrifuger la culture à 300 – 400 x g et des conditions de laboratoire standard (25° C et 100 kPa) pendant 5 min.
   3. Éliminer le surnageant par élaborer avec une pipette ou à l’aide d’une pipette Pasteur attachée à un vide sans déranger le culot. Jeter des déchets médias dans une solution d’eau de Javel de 10 %.
   4. Lentement, ajouter 12 – 15 mL de solution de sorbitol de 4 % pour le plomb à l’aide d’une pipette automatisée et la culture de la composition de bouchage et renversant le tube jusqu'à ce que la culture soit homogène.
   5. Incuber la culture à 37 ° C pendant 15 min.
   6. Centrifuger la culture à 300 – 400 x g et des conditions de laboratoire standard pendant 5 min.
   7. Retirez le surnageant comme indiqué au point 1.2.3.
   8. Ajouter 10 à 15 mL de solution saline à 0,9 % au culot et mélanger la solution de bouchage et renversant le tube jusqu'à ce que la culture soit homogène.
   9. Répétez les étapes 1.2.6–1.2.8 deux fois plus pour laver tous les restes de sorbitol.
3. Préparation de la série de dilution de parasitémie
   1. Laver le stock de globules rouges comme étapes 1.2.6–1.2.9.
   2. Centrifuger la culture à des conditions de laboratoire standard, stock de globules rouges à 300 – 400 g pendant 5 min et jeter le surnageant comme à l’étape 1.2.3.
   3. Microtubes à qualifier de 0 %, 0,010 %, 0.025 %, 0,075 %, 0,100 %, 0,250 %, 0.750 % et 1.000 % et ajoutez 0 µL, 1 µL, 2,5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL et 100 µL de la culture, respectivement à l’aide d’une pipette de 0,2 à 20 µL.
   4. Ajouter 100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92,5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 et 0 µL de stock RBCs aux tubes marqués 0 %, 0,010 %, 0.025 %, 0,075 %, 0,100 %, 0,250 %, 0.750 % et 1.000 %, respectivement.
   5. Centrifuger le sang frais donneurs prélevé sur des tubes anticoagulant à 1 200 x g et des conditions de laboratoire standard pendant 10 min.
   6. Retirer le plasma en établissant avec une pipette et en jetant comme indiqué au point 1.2.3.
   7. Ajouter 900 µL d’hématies isolés dans chaque tube de microcentrifuge et bien mélanger en retournant le x 10.
4. Acquisition de spectrale
   1. Grâce au programme d’acquisition spectrale qui l’accompagne, cliquez sur « Set-up Instrument » et réglez les paramètres de collection de données à ce qui suit : 128 scans pour le fond ; 32 scans pour échantillon ; et la résolution de 8/cm au-dessus de la portée maximale de l’échantillon de l’appareil.
   2. Régler la température du spectromètre IRTF-par la recommandation du manufacturier ou toute la nuit.
   3. Nettoyer le cristal en frottant doucement dans un mouvement circulaire à l’aide de charpie gratuits Lingettes imbibé d’eau ultrapure. Sécher soigneusement à l’aide d’une autre lingette gratuit de peluches.
   4. Prendre une mesure de fond de l’air en cliquant sur « Mesure de fond ». Toutes les 20 min, nettoyer le cristal comme au point 1.4.3 et répéter cette mesure.
   5. Ouvrez l’affichage en direct en cliquant sur « Preview ». Observer une base plane et horizontale qui indique que le cristal est propre.
   6. Déposer 10µl d’eau désionisée directement sur le milieu du cristal et cliquez sur « Mesure Sample ». Répéter cette mesure de l’eau après chaque cinquième échantillon.
   7. Sécher le cristal à l’aide d’une lingette gratuit de peluches et un léger mouvement circulaire.
   8. Déposer 10µl d’échantillon, puis cliquez sur « Mesure Sample ».
   9. Nettoyer le cristal entre les échantillons comme au point 1.4.3.
   10. Répétez jusqu'à ce que 3 répétitions sont acquis, en vous assurant de randomiser l’ordre des échantillons et de la réplique.

2. analyse des données multivariée (LCVA)

NOTE : Le traitement de données doit être fait sur le groupe de données entier afin d’éviter le bruit et l’ajout des pics d’origine non biologique. En revanche, analyser les régions biologiquement pertinente : 2980-2800/cm et cm-850/1750.

1. Traitement de données
   Remarque : Deux logiciels, par exemple, Matlab (désormais dénommé logiciel 1) et The Unscrambler X (désormais dénommé logiciel 2) sont utilisées comme exemples pour IMPOSERA. Logiciel 1 a la capacité d’exécuter IMPOSERA sans l’ajout d’une interface utilisateur graphique (GUI). Toutefois, il est recommandé d’acheter un GUI (Table des matières). Les instructions suivantes lorsque se référant au logiciel 1 qui assumera est en conjonction avec la boîte à outils GUI disponible dans le commerce, et le script de traitement de données exemple a été attaché.
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données multivariées approprié, cliquez sur « Importer des données » et sélectionnez le type de fichier pour l’analyser.
      1. Dans le logiciel 1 entrée « Analyse » dans la fenêtre de commande pour ouvrir l’interface graphique. Faites un clic droit la X box pour trouver « Importer des données ».
      2. Dans le logiciel 2, cliquez sur l’onglet « Fichier » pour trouver « Import ».
   2. Importer des spectres de l’échantillon, d’eau et base sous forme d’ensembles de données dans l’espace de travail en sélectionnant tous les spectres dans chaque jeu séparément et en cliquant sur « Ouvrir » et donner à chaque groupe un nom court, par exemple, « wat » de jeu de données de spectres de l’eau.
   3. Sélectionnez tableau/matrice à nouveau en cliquant sur « nouveau vecteur/matrice » et générer un vecteur de n × 1, où n est le nombre d’échantillons. D’entrée de la parasitémie de chaque échantillon et donnez le vecteur le nom « Parasitémie ».
      1. Dans le logiciel 1, cliquez sur « Nouvelle Variable » dans la fenêtre commande.
      2. Dans le logiciel 2, cliquez sur l’icône « Nouvelle Matrix ».
   4. Tracer les données en cliquant sur l’icône « tracer des données ». Inspecter les spectres pour les effets de la vapeur d’eau en cliquant sur « Zoom » et en zoomant sur 1400/1800-cm ; plus clairement observées comme des pics courts, pointus, étroits le long des pentes de l’amide I et amide bandes II.
   5. Dans les cas extrême de vapeur d’eau, ouvrez l’onglet edit/pre-quadrichromie données et sélectionnez « Lissage ». Réduire le bruit et/ou de la vapeur d’eau forte contribution en lissant les spectres d’échantillon et de l’eau à l’aide de jusqu'à 25 points de lissage ou d’utiliser une méthode de correction de vapeur d’eau.
   6. Bonne base non horizontales en utilisant l’algorithme de correction de référence le cas échéant, sous le même onglet edit/pre-quadrichromie données à l’étape 2.1.4.
   7. Les spectres de l’eau en moyenne et copiez les lignes dans une matrice de m × n équivalente à l’exemple de dataset et réduire à 70 % d’intensité en le multipliant par 0,7.
      1. Dans le logiciel 1, faire dans la fenêtre de commande en entrant le script suivant « AverageWater=mean(WaterDataset) ». Puis copiez-collez les lignes pour faire correspondre le jeu de données d’exemple. Pour réduire l’intensité, l’entrée « AverageWater70 = AverageWater * 0,70 ».
   8. Soustraire des spectres de la moyenne de l’eau de chaque spectre de l’échantillon.
      1. Dans le logiciel 1, faire dans la fenêtre de commande en entrant le script suivant « WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70 ».
   9. Ouvrez l’onglet edit/pre-quadrichromie données pour appliquer une fonction dérivée seconde et puis normaliser les données en sélectionnant la fonction unique variables normales (SNV) et centre de donnée.
      1. Dans le logiciel 1, faire en une seule fois. Sélectionnez d’abord « Dérivé » et entrée de 25 points de lissage, polynomial de 3 et un ordre dérivé sur l’échantillon à l’aide de 25 points de lissage et une fonction de Savitzky-Golay. Sélectionnez ensuite « SNV » et « Signifie Center ». Cliquez sur « OK/appliquer ».
   10. Ouvrez l’onglet edit/pre-quadrichromie données et en Variables « colonne », sélectionnez – 2 800/2 980 et 1 750 – 850/cm en veillant à ce que seulement leurs cases sont cochées.
2. Analyse des données
   1. Analyse en composantes principales (PCA)
      1. Cliquez sur « analyse | Decomposition » et sélectionnez APC.
         1. Dans le logiciel 1, cliquez sur « Construire un modèle ».
         2. Dans le logiciel 2 entrée les méthodes de l’APC. Entrez le nombre optimal de composants principaux (PC) - dans ce travail, 7 - et un maximum de 100 itérations et sélectionnez la validation croisée pour la méthode de validation. Cliquez sur « Exécuter ».
      2. Respectez la limite de confiance de 95 %, l’anneau en pointillés, sur le terrain de scores entre PC1 et PC2.
      3. Marquer les spectres de l’échantillon avec des scores qui se produisent à l’extérieur de la limite comme aberrantes possibles à l’aide de l’outil « Sélection spectres ».
      4. Si les spectres marqués ont élevé Hotellings T² valeurs et haute Q résidus les excluent de l’analyse.
   2. Régression des moindres carrés partiels (PLS-R)
      1. Cliquez sur « analyse | Régression » et sélectionnez « PLS-R ».
         1. Dans le logiciel 1 clique droit Y bloc, puis sélectionnez le vecteur « parasitémie | Construire modèle ».
         2. Dans le logiciel 2, entrée des méthodes PLS-R. Sélectionnez le vecteur « Parasitémie » la référence « Y » et l’exemple de dataset comme « X Data Set » et sélectionnez la validation croisée comme la méthode de validation. Cliquez sur « Exécuter ».
      2. Analyser le modèle de régression. R² valeurs sur 0,80 et l’erreur quadratique moyenne de validation croisée (RMSECV) les valeurs inférieure à 0,1 % parasitémie sont modèles acceptables.
      3. Analyser le vecteur de régression et d’identifier les bandes biologiques.

Résultats

Tracer des moindres carrés partiels (PLS-R) et son vecteur de régression associés, Figure 1 a et 1 b respectivement, montrent que le signal de parasites sont assez distincte de la SCFR qu’ils peuvent être utilisés pour former une régression linéaire modèle à utiliser pour la prédiction des parasites dans les ensembles de données futures.

Un modèle linéaire robuste PLS...

Discussion

Modèle PLS-R est une méthode multivariée encadrée qui trouve une relation linéaire, Y = bX + E, entre les variables prédictives X (ici, l’absorbance à chaque nombre d’onde) et une variable continue Y (ici, le niveau de la parasitémie). En bref, le modèle combine les variables x pour créer un nouvel ensemble de variables latentes (LVs) qui captent la variance sur X en corrélation avec Y et calcule un vecteur de régression (b) qui a multiplié par un nouveau résultats de spectre dans l’estimation de la v...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Donor blood	-	-	Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood	Australian Red Cross`	-
3D7 Plasmodium falciparum	The Burnet Institute	-	Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
Sorbitol	Sigma Aldrich	S1876	Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
Immersion Oil	Thermofisher	M3004
50 mL culture dishes	Falcon	353025
25mL pipette tips	Falcon	357515
10mL pipette tips	Falcon	357530
Microscope Slides	Sigma Aldrich	S8902
Centrifuge tubes 50 mL	Sigma Aldrich	T2318
Automated pipette controller	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab	Mathworks Inc		Multivariate data analysis software
The Unscrambler X	CAMO		Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		GUI for Matlab