熱帯熱マラリア原虫減衰全反射赤外分光法と多変量データ解析による水溶液赤い血球での検出と定量

要約

ここでは、検出及び減衰全反射赤外分光光度計と多変量解析を使用して感染した水溶液赤い血液細胞で熱帯熱マラリア原虫の定量化のプロトコルを提案する.

要約

多変量データ解析 (と共に簡単な卓上型減衰全反射フーリエ変換赤外 (ATR FTIR) 分光計を使用して定量法と水溶液中の赤い血球 (赤血球) の寄生虫の検出を示すMVDA)。3 7マラリア10% 寄生リング ステージ寄生虫に培養、希釈に 0-1 の間にシリーズを作成する分離された新鮮なドナーの赤血球をスパイクに使用 %。10 μ L 各サンプルのスペクトルを取得する ATR ダイヤモンド ウィンドウの中央に置かれました。信号対雑音比を改善するために、水の寄与を削除するサンプル データが扱われ、二次導関数はスペクトルの特徴を解決に適用されます。データは、MVDA の 2 種類を使用して行った: 最初主成分分析 (PCA) とを決定する任意の飛び地、偏最小 2乗回帰 (PLS-R) 計量化モデルを構築します。

概要

マラリアは私達の時間の最も破壊的な病気の中で、します。半分以上の人口の流行地における生活し、貧しい^1,2,3,4の過度に負担。問題の大部分は無症候性キャリアと初期段階患者蚊ベクトル⁵のための貯蔵所として機能するぬれた季節の間に感染症のスパイクを引き起こすとのコミュニティを保持することができます。マラリアは、最も致命的なうちはマラリア病²の最も深刻な形を引き起こす 5 つの原虫が原因です。

現在、マラリアの診断技術は完璧未満です。光学顕微鏡法の現在のゴールド スタンダードのみ 62 88 寄生虫/μ L 使用方法⁶によってを検出できます。集約と高スキルが必要、多くの地域の顕微鏡検査の誤診のためさらに、> 50% 例, 低 parasitaemia との特にそれらレベル²地域で資源との結果の欠如に直接帰することができます。抗マラリア薬の誤用。主な診断の他の 2 つの方法は、検出、およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) アッセイの識別し、DNA から寄生虫を定量化するための抗体を利用した迅速診断テスト (RDTs) です。現在、RDTs は放置されている疾患のより稀な形態の結果として血の少なくとも 100 の寄生虫/μ L のp. の vivax マラリアを検出することができるのみ。^7,8対照的に、PCR の試金の識別し、定量化 0.0004 5 の感度でマラリア原虫の異なる種の血液の寄生虫/μ L。しかし、それは高価な試薬、機器、技術的なスキルを必要としては現場への適用のために適していなかった。

機密性の高い、信頼性と手頃な価格の技術は診断時間従って患者の転帰の改善と病気の除去を可能を改善するために不可欠です。減衰全反射フーリエ変換 (ATR FTIR) 分光法では、この問題の潜在的なソリューションを提供しています。前作は検出し、メタノールの検出限界を達成する血膜を固定でマラリアを定量化することが可能だったことを示している < 1 寄生虫/μ L の血液 (< 0.0002% 寄生)⁹PCR 法と対等であります。最近の研究では、検出および水溶液試料中の寄生虫を定量化し、従って固定ステップを排除することが可能であるを示しています。ただし、水蒸気、スペクトルのノイズやデータ処理などの要因は、最適な結果¹⁰の考慮する必要があります。

このプロトコルは、ATR FTIR スペクトルを取得および水溶液赤い血球 (RBC) サンプル¹⁰からマラリアの検出のための回帰モデルを準備する方法を示しています新しいユーザーを目指しています。

プロトコル

適切な製品安全性データ シート (MSDS) に相談し、適切なバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 訓練を求めてください。BSL 2 キャビネットの無菌技術を使用して、除染の手順、針棒の傷害、および潜在的な生物学的ばく露と感染から有害な紫外線放射への露出の危険がある場合の意味で養殖のすべての手順を行う必要があります寄生虫文化任意の傷害に入ります。さらに、血液銀行から株式の血がのみ特定の疾患や血液疾患の広がりのための潜在的な危険であります。危害の発生で緊急医療援助を求めます。

1. 調製及び測定 3 7 の熱帯熱マラリア原虫寄生希釈系列

注:マラリア原虫の sp文化は非常に敏感です。新鮮な/有効期限内の試薬を使用して、メディアを変更して、寄生虫を定期的にフィードします。フィードの寄生率 5% 以下文化すべての 2 日目。6-10% 寄生一度か二度日の間文化をフィードします。文化の間に 1 日 4 回まで 11-20% をフィードします。餓死し始めている寄生虫がその形状を失うし、契約を開始します。このような場合は、フィードし、メディアを変更する抗凝固剤と最初の 6 時間以内の測定としてヘパリンを含む採血管の在庫赤血球。 収集ドナー血液を追加することによってすぐに希釈します。

1. 文化 3 7 の 30 mL の合計株標準プロトコルによると熱帯熱マラリア原虫の寄生虫は、寄生率 10% リングに達するまでします。
2. 寄生虫の同期
   1. 寄生虫のライフ サイクルに shizogeny 後 11 h では、文化や自動ピペットを使用して 50 mL の円錐管に転送を再懸濁します。
   2. 300-400 x g と標準的な実験条件 (25 ° C と 100 kPa) 5 分で文化を遠心します。
   3. ピペットで策定またはペレットを邪魔せずに真空に取り付けるパスツール ピペットを使用して上清を削除します。廃棄メディアを破棄すると、10% の漂白剤の解決策に。
   4. ゆっくりと自動ピペットを使用してペレットに 4% ソルビトール溶液 12-15 mL を加え、キャッピング、文化が均質になるまでチューブを反転して文化を混ぜます。
   5. 15 分の 37 ° C で文化を孵化させなさい。
   6. 300-400 x g と 5 分の標準的な実験室の条件で文化を遠心します。
   7. 1.2.3 のステップで説明されているように上清を削除します。
   8. ペレットに 0.9% 生理食塩水 10-15 mL を加え、キャッピング、文化が均質になるまでチューブを反転してソリューションを混ぜます。
   9. 手順 1.2.6–1.2.8 ソルビトールのすべての残党を洗ってさらに 2 回を繰り返します。
3. 寄生率希釈系列の作製
   1. 手順 1.2.6–1.2.9 のように株式の赤血球を洗浄します。
   2. 標準的な実験室の条件、5 分の 300-400 x g でストック赤血球で文化を遠心し、ステップ 1.2.3 のように上澄みを廃棄します。
   3. 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750%、1.000% としてマイクロ遠心チューブ用のラベル、0 μ、1 μ L、2.5 μ L、7.5 μ、10 μ、25 μ L、75 μ L、それぞれ 0.2 20 μ L ピペットを使用するカルチャの 100 μ L を追加します。
   4. それぞれ 100 μ L、99 μ L、97.5 μ L、92.5 μ L、80 μ L、75 μ L、株式赤血球の 25、0 μ L をチューブ ラベル 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750%、1.000% に追加します。
   5. 1,200 x g と 10 分標準実験室の条件で凝固管で集められた新鮮なドナー血を遠心分離機します。
   6. ピペットの策定と 1.2.3 のステップで説明したようの破棄によってプラズマを削除します。
   7. 各微量遠心チューブに孤立した赤血球の 900 μ L を加え、10 x の反転によって徹底的に混ぜます。
4. スペクトル取得
   1. 付随するスペクトル取得プログラムを使用して、「楽器セットアップ」をクリックして、データ コレクションのパラメーターを次のように設定: 128 スキャン背景;サンプルの 32 スキャン楽器の最大サンプル範囲にわたって 8/cm 解像度。
   2. 製造元の推奨あたり ATR FTIR 分光計の温度を設定または一晩します。
   3. 無料おしりふきは超純水水で湿らせた lint を使用して円動きで優しくスクラブして結晶をクリーニングします。別の糸くず無料ワイプを使用して徹底的に乾燥します。
   4. 「バック グラウンド測定」をクリックして空気のバック グラウンド測定を行います。20 分毎ステップ 1.4.3 のように結晶をきれいにしこの測定を繰り返します。
   5. ライブ ビューを開くには、「プレビュー」をクリックします。結晶がクリーンであることを示すフラット、水平方向のベースラインを確認します。
   6. 結晶の中に直接脱イオン水の 10 μ L をピペットし、「測定サンプル」をクリックして。すべての 5 番目のサンプル後この水の測定を繰り返します。
   7. 糸くず無料ワイプと穏やかな円動きを使用して結晶を乾燥させます。
   8. サンプルの 10 μ L をピペットし、「測定サンプル」をクリックして。
   9. 1.4.3 の手順とサンプル間結晶をきれいに。
   10. サンプルと複製の両方の順序をランダムに確かめる 3 複製が取得されるまで、手順を繰り返します。

2. 多変量解析 (MVDA)

注: データ処理は、データセット全体をノイズと非生物起源の峰の追加を避けるために行う必要があります。対照的に、生物学的関連性の高い地域にわたって分析: 2980-2800/cm と 1750-850/cm。

1. データの処理
   注: 2 つのソフトウェア、例えばMatlab (今後ソフトウェア 1 と呼ばれる) と修復装置 X (今後ソフトウェア 2 と呼ばれる) は、MVDA の例として使用されます。ソフトウェア 1 は、グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の添加せず MVDA を実行する能力を持っています。ただし、GUI (資材表) を購入することをお勧めします。ソフトウェア 1 を参照すると仮定するとき次の手順市販の GUI ツールボックスと共に、データの治療例を掲載いたしました。
   1. 適切な多変量データ解析ソフトウェアを開く、「データのインポート」をクリックし、分析用にファイルの種類を選択します。
      1. 1、ソフトウェアの GUI を開くコマンド ウィンドウに「分析」を入力します。「データのインポート」を見つけるために X ボックスを右クリックします。
      2. 2、ソフトウェアの「インポート」を検索する「ファイル」タブをクリックします。
   2. 個別に各セットですべてのスペクトルを選択し「開く」をクリックすると、ワークスペース データ セットとしてサンプル、水およびベースラインのスペクトルにインポートし、短い名前、例えば、 'ワット' 水のスペクトルのデータセットの各セットを与えます。
   3. 「新しい行列/ベクトル」をクリックしてして新しいテーブル/マトリックスを選択し、、n はサンプル数 n × 1 ベクターを生成します。各サンプルの寄生率を入力、名前 '寄生' ベクトルを与えます。
      1. ソフトウェア 1、「新しい変数」コマンド ウィンドウでをクリックします。
      2. 2、ソフトウェアの「新しい表」アイコンをクリックします。
   4. 「プロット データ アイコン」をクリックしてデータをプロットします。1800-1400/cm; 上でズームを「ズーム」をクリックして水蒸気の影響のスペクトルを調べる最も明確に観察されるアミドの斜面に沿って短い、鋭い、狭いピークとして私とアミド II バンド。
   5. 極端な水蒸気の場合、データ編集/前プロセス タブを開き、「スムージング」を選択します。平滑化の最大 25 ポイントを使用してサンプルと水のスペクトルの平滑化による騒音や強い水蒸気の貢献を軽減または水蒸気訂正メソッドを使用します。
   6. 2.1.4 の手順で同じデータ編集/前プロセス タブの下で、適切な場合、ベースライン補正アルゴリズムを使用して適切な非水平ベースライン。
   7. 水のスペクトルの平均サンプル データセットと同じ n × m マトリックスに行をコピーして 70% の濃度に 0.7 を乗じてそれを減らします。
      1. ソフトウェア 1、コマンド ウィンドウで"AverageWater=mean(WaterDataset)"の次のスクリプトを入力することで行います。サンプル データ セットに一致する行をコピー-貼り付けし。入力強度を減らすためには、「AverageWater70 = AverageWater * 0.70」.
   8. 各サンプル スペクトルから平均水のスペクトルを減算します。
      1. ソフトウェア 1 のようにコマンド ウィンドウで次のスクリプトを入力することで"WaterCorrectedData = SampleDataset AverageWater70」。
   9. 2 番目の派生関数を適用と単一正規変量 (SNV) 関数を選択することによって、データを正規化し、センターのデータを意味データ編集/前プロセス タブを開きます。
      1. 1、ソフトウェアの 1 つの移動で行います。「誘導体」と平滑化、3 多項式の次数とスムージングの 25 得点、サビツキー ・ ゴーレイ関数を使用して設定サンプルにデリバティブ順序の入力 25 ポイントを選択最初します。「SNV」と「センター平均」選択します。「大丈夫/適用」をクリックします。
   10. 編集/前プロセス データ] タブを開き、「列変数」のボックスのみがチェックされていることを確認することによって 2,980-2,800/cm と 1,750-850/cm を選択します。
2. データ分析
   1. 主成分分析 (PCA)
      1. クリックして"分析 |分解"と選択 PCA。
         1. ソフトウェア 1、「モデルの作成」をクリックします。
         2. ソフトウェア 2、PCA メソッドを入力します。-のこの仕事は、7 - 主成分 (Pc) の最適な数を入力し、最大で 100 回反復と、検証メソッドの [クロス検証。「実行」をクリックします。
      2. 95% 信頼限界、PC1 と PC2 間スコア プロット上の破線リングを観察します。
      3. 制限外スペクトル「選択ツール」を使用して潜在的な外れ値として発生するスコアを持つサンプル スペクトルをマークします。
      4. マークのスペクトルがある高 Hotellings T²値と残差 Q 高除外するそれらさらに分析から。
   2. 偏最小 2乗回帰 (PLS-R)
      1. クリックして"分析 |回帰"と選択"PLS R"。
         1. ソフトウェア 1、Y ブロックを右クリックし、ベクトルを選択"寄生率 |モデルの構築」。
         2. ソフトウェア 2、PLS R メソッドを入力します。「Y 基準」、サンプル データセットとして「X データ セット」と検証方法として [クロス検証としてベクトル「寄生」を選択します。「実行」をクリックします。
      2. 回帰モデルを分析します。R²値 0.80 と寄生率 0.1% 未満クロス検証 (RMSECV) 値の二乗平均平方根誤差は、許容可能なモデルです。
      3. 回帰ベクトルの分析し、生物学的バンドを特定します。

結果

部分的な最小二乗 (PLS-R) プロットし、その関連付けられた回帰ベクトル、図 1aと1b , 表示寄生虫からの信号とは異なること十分な線形回帰モデルを使用するフォームを使用することができます赤血球、将来のデータ セットで寄生虫の予測。

R 二乗値 0.87 の堅牢な線形の PLS-R モデルが生成...

ディスカッション

PLS モデルは線形関係、Y チャイルド多変量法 = bX + E、予測変数 X の (ここでは、各波数で吸光度) および連続変数 Y (ここで寄生率レベル)。一言で言えば、モデル x の X が Y と相関の差異をキャプチャ潜在変数 (LVs) の新しいセットを作成する変数を結合し、回帰ベクトル (b) を計算する y 値の推定における新しいスペクトルの結果を乗算します。2 つの値からモデルの強さを取ることができる: ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Donor blood	-	-	Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood	Australian Red Cross`	-
3D7 Plasmodium falciparum	The Burnet Institute	-	Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
Sorbitol	Sigma Aldrich	S1876	Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
Immersion Oil	Thermofisher	M3004
50 mL culture dishes	Falcon	353025
25mL pipette tips	Falcon	357515
10mL pipette tips	Falcon	357530
Microscope Slides	Sigma Aldrich	S8902
Centrifuge tubes 50 mL	Sigma Aldrich	T2318
Automated pipette controller	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab	Mathworks Inc		Multivariate data analysis software
The Unscrambler X	CAMO		Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		GUI for Matlab