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Resumen

Usando un vector binario pBIBAC-GW hace generar plantas transgénicas con inserciones intactas de solo-copia, un proceso fácil. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector a través del proceso de generación de plantas transgénicas de Arabidopsis y prueba de las plantas para la integridad y copiar el número de los insertos.

Resumen

Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que la expresión estable de un transgen. Esto requiere una integración del transgén, sola, intacta como integraciones de copia múltiple a menudo son objeto de silenciamiento génico. El vector binario compatible con Gateway basado en cromosomas artificiales bacterianos (pBIBAC-GW), como otros derivados de pBIBAC, permite la inserción de los transgenes de la solo-copia con eficacia alta. Como una mejora a la original pBIBAC, un cassette de Gateway ha sido clonado en pBIBAC-GW, para que las secuencias de interés pueden ahora ser fácilmente incorporadas en la transferencia vector DNA (T-DNA) Gateway clonando. Comúnmente, la transformación con pBIBAC-GW resulta en un rendimiento de 0.2 – 0.5%, por el que la mitad de los transgénicos llevan una integración solo copia intacta del T-ADN. Los vectores pBIBAC-GW están disponibles con resistencia a glufosinato-amonio o DsRed fluorescencia en las capas de semilla para la selección de las plantas y con resistencia a la kanamicina como una selección de las bacterias. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector por el proceso de generación de plantas transgénicas mediante pBIBAC-GW: a partir de la recombinación de las secuencias de interés en el vector de pBIBAC-GW de elección, a la planta de transformación con Agrobacterium, selección de los transgénicos y las pruebas de las plantas para la integridad y número de copia de los partes movibles utilizando ADN borrar. Se presta atención al diseño de una estrategia de Blot de DNA a reconocer solo y multi copy integraciones en loci únicos y múltiples.

Introducción

Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que el integrado transgene(s) estable expresado. Esto puede lograrse por integraciones copia intacta de un transgen. Integraciones múltiples pueden conducir a aumento de la expresión de un transgen, sino también al silenciamiento génico. Silenciamiento de transgenes es más probable si las secuencias insertadas están dispuestas en tándem o repeticiones invertidas1,2,3,4. Vectores binarios se utilizan como lanzaderas en Agrobacterium-mediada por experimentos de transformación a entregar las secuencias de interés en genomas de plantas. El número de integraciones en el genoma de una planta es dependiente en el número de copias del vector binario en Agrobacterium tumefaciens5,6. Muchos vectores binarios utilizados son vectores de alta copia y por lo tanto producir un número de copia del transgen promedio alto: 3.3 a 4.9 copias en Arabidopsis5.

El número de integraciones de T-DNA puede reducirse mediante el uso de vectores binarios que tienen un número de copia baja en a. tumefaciens, como BIBAC7o lanzando un T-DNA de a. tumefaciens cromosoma5. El número medio de integración del transgén en tales casos es inferior a 25,8,9,10. Debido a que solo copia en a. tumefaciens y también en Escherichia coli, derivados de la BIBAC pueden mantener y ofrecer construcciones tan grandes como 150 kb11.

GW-compatible BIBAC vectores10,12 permiten fácil introducción de los genes de interés en el vector mediante clonación de Gateway. El uso de la tecnología Gateway simplifica enormemente el procedimiento de clonación, pero también supera problemas comunes asociados con gran número de copias bajo vectores13,14, tales como un bajo rendimiento de ADN y una selección limitada de restricción única sitios disponibles para la clonación7,11. Los derivados pBIBAC-GW están disponibles con cualquier resistencia al glufosinato-amonio (pBIBAC-BAR-GW) o fluorescencia DsRed en las capas de semilla (pBIBAC-RFP-GW) para la selección de las plantas (figura 1)10,12. Para ambos vectores, se utiliza un gen de resistencia a kanamicina como el marcador de selección en las bacterias.

Se combinan los vectores pBIBAC-GW: diseño (1) fácil y manipulación genética en e. coliy (2) intacto solo copia integraciones en planta con alta eficiencia. La producción de vectores pBIBAC-GW en integraciones promedio 1.7 en Arabidopsis con aproximadamente la mitad de las plantas transgénicas con un solo había integrado T-ADN10.

La expresión estable de transgenes es un requisito para la mayoría transgénicos generados. Expresión del transgén estable puede lograrse mediante integraciones intactos, solo copia. Sin embargo, trabajar con plantas transgénicas portadoras de integraciones intactos, solo copia es aún más importante si por ejemplo, el objetivo es estudiar la eficiencia de los procesos basados en la cromatina, como la mutagénesis, recombinación, o reparación y la dependencia de estos procesos en la localización genómica y la estructura de la cromatina en el sitio de inserción. Para nuestro interés, para estudiar la dependencia de mutagénesis de oligonucleótidos dirigidos (ODM) en el contexto genómico local, un conjunto de líneas de reportero con integraciones intactos, solo copia de un gen reportero de mutagénesis fue generado (figura 2)10. Mediante este conjunto de líneas, fue demostrado que la eficacia ODM varía entre loci transgénicos integrados en diversas localizaciones genómicas, a pesar de los niveles de expresión de transgenes siendo algo similar.

Protocolo

1. inserción de secuencias de interés en el Vector binario

  1. Preparar la entrada de la puerta de enlace y vectores binarios.
    1. Aislar el vector de entrada de la puerta de entrada que contiene un fragmento de ADN o un gen de interés mediante un kit de preparación mini-para el según las sugerencias de los proveedores.
      Nota: GW BIBAC vectores requieren el uso de kanamicina (Km) para la selección de bacterias, por lo tanto, utilizar un vector de entrada con otro marcador de resistencia en lugar de kanamicina. Por ejemplo, el vector pENTR-gm, lleva un gen de resistencia a gentamicina, es una buena opción12.
    2. Propagar y aislar el vector de la BIBAC GW de interés. Utilizar una cepa de e. coli que es resistente a la toxicidad del gen ccdB presente dentro de la cinta de entrada. Aislamiento BIBAC-vectores usando protocolos o kits específicamente diseñados para grandes plásmidos según las sugerencias de los proveedores.
  2. Llevar a cabo una reacción de Gateway.
    1. Preparar la reacción de recombinación LR según las sugerencias de los proveedores. Mezclar los siguientes componentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a temperatura ambiente (RT): 100 – 300 ng clon de entrada (superenrollado), 300 ng del vector de la BIBAC-GW, LR Clonase buffer de reacción (concentración final: 1 x). Ajustar el volumen de la mezcla a 16 μl con TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0). Por último, añadir 4 μL de mezcla de enzima Clonase LR y mezclar con un vórtex. Incubar la mezcla a 25 ° C durante 1 hora.
    2. Terminar la reacción de LR por añadir 2 μl de solución de proteinasa K (2 μg/μl) a la mezcla preparada en el paso 1.2.1. Mezcla e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
  3. Transformar e. coli con la mezcla de reacción de la puerta de entrada por electroporación.
    1. Desalar la mezcla de reacción de LR antes de la electroporación.
      Nota: Este paso es vital para la exitosa electroporación. A continuación una diálisis método es descritos, pero otros métodos como la precipitación con acetato de sodio y etanol también puede ser utilizado.
      1. Preparar la instalación para la diálisis de filtro de la reacción de LR. Vierta 20 mL de agua desionizada ultrapura en una placa Petri estéril. Coloque un disco de filtro de membrana (tamaño de poro = 0.025 μm) en la superficie del agua.
      2. Pipetear la reacción entera de LR con cuidado encima de la membrana y deje que la mezcla se dializan a temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Añadir 5 μl de la mezcla LR desalada a células DH10B electro-competentes en una cubeta de electroporación (0,1 cm). Electroporate las células (1,5 V/cm, resistencia 200 Ω, capacitancia de 25 μF) y añada inmediatamente 1 mL precalentado catabolito óptimo Super represión (SOC) medio a las células, seguidas de incubación a 37 ° C por 45 min, 180 rpm. (Medio SOC, extracto de 1 L: 20 g de Bacto triptona, 5 g de levadura, 0.5 g de NaCl, 2,5 mL de 1M de KCl, 20 mL de 1 M filtro esterilizado glucosa).
      Nota: Las células DH10B pueden sustituirse por otras células de e. coli que mantiene estable plásmidos grandes.
      Nota: Las condiciones óptimas de electroporación son dependientes en el aparato de electroporación utilizado.
    3. Pellet de bacterias a la máxima velocidad durante 30 s utilizando una microcentrífuga, quitar exceso SOC y resuspender el pellet en aproximadamente 50-100 μl de medio Luria-Bertani (LB). Trasmitir las bacterias en placas de LB de kanamicina (Km-LB) (concentración Km, 40 μg/mL) e Incube las placas a 37 ° C durante la noche. (Medio LB, extracto de 1 L: 10 g de Bacto triptona, 5 g de levadura, 10 g de NaCl. Para medio sólido añadir agar, 15 g/L).
  4. Identificar los derivados BIBAC GW recombinados y aislar ADN de plásmido.
    1. Para ser capaces de crecer en placas de LB Km, las células de e. coli deben contener el plásmido recombinado de BIBAC GW en el que se sustituye la secuencia ccdB con el relleno deseado. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Colonia15 para comprobar si las colonias de bacterias de la placa contienen la plásmidos correcto, teniendo la columna vertebral de la BIBAC-GW y el inserto de interés.
      1. Para identificar la columna vertebral de pBIBAC-BAR-GW, realizar una reacción de15 PCR con los primers DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'y DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Este primer conjunto amplifica un fragmento 563 de bp del gen bar .
      2. Para comprobar la presencia de la columna vertebral de la BIBAC-RFP-GW, realizar una reacción de15 PCR, utilizando primers M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'y M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Esta combinación de cartilla amplifica un fragmento de bp 791 superpuestas la cruciferin promotor y rfp secuencia.
      3. Realizar reacciones de15 PCR usando las cartillas gene-específico para verificar la presencia del inserto de interés.
    2. Inocular una colonia positiva solo en 2 – 5 mL de medio LB con kanamicina (40 μg/mL) para aislamiento de DNA16. Incubar a 37 ° C en un agitador orbital a 180 rpm, durante la noche.
    3. Aislar el ADN del plásmido (ver paso 1.1.2).

2. preparación de a. tumefaciens para mojar flores de Arabidopsis

  1. Transformación derivados de la BIBAC-GW para a. tumefaciens.
    1. Preparar células electro-competentes de ayudante de cepa C58C1 llevan el pCH32 de a. tumefaciens plásmido7. Crecen las bacterias en presencia de tetraciclina (5 μg/mL) y rifampicina (100 μg/mL) para seleccionar para pCH32 y lograr un crecimiento de sólo células de Agrobacterium .
    2. Añadir 0,25 – 0,5 μg de ADN de un derivado pBIBAC-GW, previamente disueltos en 10-20 μl ultrapura desionizada agua estéril, a células de Agrobacterium competentes de 20 μl en cubetas de electroporación (0,1 cm). Mantener las células en hielo.
    3. Electroporate las células (1,5 V/cm, resistencia 400 Ω, capacitancia de 25 μF). Inmediatamente después de la electroporación, añada 1 mL precalentado (28 ° C) SOC medio a las bacterias e incubar las células a 28 ° C durante 60-90 minutos.
    4. Extensión 100 μl y el resto de las bacterias en placas LB separadas que contiene rifampicina (100 μg/mL), tetraciclina (5 μg/mL) y kanamicina (40 μg/mL) e incubar en la oscuridad a 28 ° C durante 1-2 días.
  2. Preparar la suspensión de Agrobacterium .
    1. PCR para comprobar un par de las colonias de a. tumefaciens de la placa preparada en el paso 2.1.4, la presencia del vector correcto (ver paso 1.4.1).
    2. Racha de una sola Colonia confirmada para contener el vector binario con el inserto apropiado en una placa LB que contengan antibióticos (ver paso 2.1.4). Crecimiento a 28 ° C durante la noche.
    3. Repetir las rayas con una sola Colonia obtenida en el paso 2.2.2.
    4. Inocular una colonia solo en 2,5 mL de LC medio suplementado con antibióticos (ver paso 2.1.4) para planas. Incubar a 28 ° C durante al menos 8 horas o durante la noche, a 180 rpm. (Medio de LC, 1 L: 10 g de Bacto triptona, 5 g de levadura extracto, 0.5 g de NaCl, 2.5 g de MgSO4 · 7 H2O, 2 g de maltosa).
    5. Añadir las planas de paso 2.2.4. a 250 mL LC suplementado con antibióticos (ver paso 2.1.4) y crecer a 28 ° C, a 180 rpm, durante la noche.
    6. Pellets la cultura por giro a 5.500 x g durante 12 minutos vuelva a suspender el sedimento en 100 mL de solución contiene 5% de sacarosa, 0.05% Silwet L-77, 0.5 x MS. Vierta la suspensión en un recipiente estéril para la inmersión floral de las plantas.

3. transformación de Arabidopsis

  1. Preparar las plantas Arabidopsis para la transformación.
    1. Crecen plantas de Arabidopsis en una cámara de crecimiento controlado invernadero o clima hasta que florecen (macetas de 12 con 9 plantas por inmersión).
    2. Clip los pernos primeros para permitir más pernos secundarios a emerger. Las plantas están listas para sumergir 4 – 6 días después del recorte, cuando las plantas tienen muchas cabezas de flores inmaduras y no muchos fecundados silicuas.
  2. Inmersión floral
    1. Inflorescencias de 5-10 s en Agrobacterium suspensión preparada en el paso 2.2.6 de la inmersión. Uso de agitación suave.
    2. Envuelva las partes de las plantas en film transparente para mantener la humedad alta y cubrir las macetas con una caja para mantener las plantas en la oscuridad. Incube las plantas por 2 días en una cámara de crecimiento efecto invernadero.
    3. Quite la caja y la película se aferran y crecen las plantas a la madurez en una cámara de crecimiento efecto invernadero.
      Nota: Para aumentar la eficiencia de transformación, las mismas plantas pueden volver a sumergido 7 días después de la primera inmersión.
    4. Las semillas de la cosecha. Piscina y analizar las semillas (T1) de las plantas, transformadas con la construcción misma, como un conjunto único.
  3. Pantalla para plantas transgénicas.
    1. Para pantalla para plantas transgénicas transformadas con un derivado de pBIBAC-RFP-GW, analizar las semillas utilizando microscopía de fluorescencia. Para detectar expresión DsRed en Testa, imagen de las semillas en una excitación de 560 nm y la emisión de 600-650 nm. Separar las semillas fluorescentes fluorescentes no homólogos con unas pinzas.
    2. Para pantalla para plantas transgénicas transformadas con un derivado de pBIBAC-BAR-GW, sembrar las semillas en bandejas con suelo (~ 2.500 semillas/0.1 m2). Para asegurar una dispersión incluso de semillas en bandejas, suspender las semillas en agar al 0,1% en 0.5 x medio de Murashige Skoog (MS) y extender las semillas utilizando una pipeta de 1 mL.
      Nota: Para estimular las semillas a germinar de manera sincrónica, Incube las semillas durante al menos 2 días a 4 ° C. Esto puede hacerse antes o después de la siembra de las semillas.
      1. Rocíe las plantas de semillero con 0.5% al glufosinato-amonio solución 2 semanas y 3 semanas después de la siembra en bandejas. Utilice 500 mL de solución de glufosinato-amonio por 1 m2.
      2. Transferencia sobreviven plantas de semillero a macetas individuales. Una imagen típica de una bandeja con plántulas antes y después del tratamiento de glufosinato-amonio (segundo) se muestran en la figura 3.
      3. Analizar las plantas resistentes al glufosinato-amonio por PCR la presencia del constructo de interés (consulte el paso 1.4.1. para imprimaciones).
        1. Aislar la DNA de genomic de la planta de polimerización en cadena usando el método descrito por Edwards et al. 17

4. Caracterización de transgénicos para el número y la integridad del T-ADN integraciones

  1. Estrategia de digestiones de restricción
    Nota: Determinar el número de integraciones de T-DNA y su integridad frotando ADN mediante enzimas de restricción. Este método permite para identificar solo, pero también repite integraciones en el mismos o diferentes loci en el genoma.
    1. Utilizar una serie de digestiones de restricción para identificar los patrones de integración diferentes posibles:
      1. Seleccione una enzima que corta una vez en el medio del T-ADN, poder sonda independientemente secuencias aguas arriba y aguas abajo del sitio de restricción (Figura 4A y Figura 7A-C). Ver Figura 4Ay la leyenda de la figura para los resultados esperados y la interpretación.
      2. Seleccione una enzima o una combinación de enzimas cortando toda la secuencia de interés a la vez (Figura 4B y Figura 7A-D). Cualquier desviación de la longitud conocida indica truncamiento del cassette integrado.
        Nota: tenga cuidado de utilizar sólo las enzimas de restricción que no son sensibles a la metilación de la citosina.
  2. Preparar las muestras de ADN genómicas.
    1. Aislar el ADN genómico de plantas portadoras del constructo de interés. Un método de CTAB DNA miniprep puede utilizarse para aislamiento de DNA18. Para ADN blot análisis de la DNA de Arabidopsis , se necesita 2 – 2,5 μg de ADN genómico. Disolver el ADN en 50 μl de TE.
    2. Comprobar la integridad del ADN por electroforesis de gel de16. ADN genómico intacto migra como una banda discreta en la parte superior del gel. Degradación del ADN puede ser reconocida como la presencia de un frotis. Para evitar daños en el ADN debido a la congelación-descongelación repetido, muestras de ADN genómicas se mantienen a 4 ° C.
    3. Digestión del ADN genómico (2 – 2,5 μg en el caso de ADN genómico de Arabidopsis ) en un volumen total de 50 μL, durante la noche, usando condiciones de búfer sugeridas por el proveedor de enzima.
      1. En un tubo de ensayo, mezcla de 2 – 2,5 μg de ADN genómico de Arabidopsis y 5 μl de tampón de restricción 10 x enzima de restricción U 5 en un total de 50 μl de agua desionizada ultrapura.
    4. Agregar colorante de carga (1 x concentración final) a las muestras de la restricción antes de cargar en un gel. Para el buen seguimiento visual, utilice uno de los siguientes: comigrating con pequeños fragmentos (azul de bromofenol, 350 – 400 bp), o comigrating con grandes fragmentos (Cylene cyanol, kbp de 3 – 4).
  3. Correr el gel de DNA.
    1. Preparar un largo (20 cm) 0,5 x TBE agarose gel19. El porcentaje de agarosa en el gel depende de los tamaños del fragmento esperados. 0,8 – 1% óptimo separa fragmentos > 1 kb de tamaño. Uso de 1 – 1,5% agarosa para fragmentos < 1 kb. No añadir bromuro de etidio el gel. (5 x TBE, 1 L: 54 g de Trizma base, 27,5 g de ácido bórico, 3.75 g de EDTA).
      Nota: Para evitar la contaminación del ADN, bandejas de gel de uso que no se utilizan para fraccionar plásmido y PCR amplifican la DNA.
    2. Cargar las muestras en gel19.
    3. Añadir marcadores de ADN para el gel que se encuentran en el rango de tamaño de los fragmentos esperados. Carga de aproximadamente 1 μg de marcador (50-250 ng de fragmento de tamaño diferente) sobre el gel para permitir una visualización por la luz UV.
    4. Tamaño-fraccionar el ADN a una tensión baja (40-50 V/500 mA) durante la noche.
  4. Preparar para la transferencia del ADN desde el gel de agarosa a la membrana de nylon.
    1. Transferir el gel a una bandeja aparte y mancha para 20 – 25 min en 0,5 x TBE que contienen bromuro de etidio (5 μg/mL) girando a 40 rpm en un agitador orbital.
    2. Visualizar el gel en un transiluminador UV. Verificar la separación del tamaño de la DNA genomic, incluyendo visibilidad de bandas discretas satélite (figura 5A). Un borrón de transferencia hacia tamaños de peso molecular inferiores indica degradación del ADN.
    3. En el transiluminador UV, pone una transparencia sobre el gel y marque la posición de las ranuras y las bandas del marcador con un rotulador (figura 5B). Esto facilitará la determinación del tamaño de los fragmentos hibridizados más adelante en el caso de las secuencias de marcador no hibridan específicamente con la sonda de ADN. Indicando los fragmentos del marcador en este paso, es posible que el tamaño de los fragmentos de cruzamiento por hibridación de la pista.
    4. Coloque el gel en la bandeja, enjuague con agua desionizada ultrapura y sumérjalo en 0.25 M en HCl durante 15 min a fragmentan el ADN en el gel. Lavar con agua desionizada ultrapura. Utilice suficiente ácido clorhídrico y agua para cubrir el gel en la bandeja y gire la charola con el gel sumergido a 40 rpm en un agitador orbital.
    5. Incubar el gel en tampón de desnaturalización durante 30 minutos lavar con agua desionizada ultrapura. Use suficiente buffer y agua para cubrir el gel en la bandeja y gire la charola con el gel sumergido a 40 rpm en un agitador orbital. (Tampón de desnaturalización: 0.5 M NaOH, 1,5 M de NaCl).
    6. Incubar el gel en tampón de neutralización de 30 minutos lavar con agua desionizada ultrapura. Utilice suficiente agua y tampón para el gel en la bandeja de la cubierta, gire la charola con el gel sumergido a 40 rpm en un agitador orbital. (Tampón de neutralización: 0.5 M Tris, 1,5 M de NaCl, HCl, de 220 mM, pH 7.6).
  5. Transferir el ADN a una membrana de nylon.
    1. Preparar la configuración para la transferencia capilar de la DNA genomic. Coloque una placa de plástico (aproximadamente del tamaño del gel o más grande) sobre una bandeja llenada con 20 x citrato salino-sódico (SSC). Doble un pedazo de papel de filtro grueso sobre la bandeja, para que ambos de sus extremos se cuelgan en el SSC. Cortar un trozo de gel de tamaño de la membrana de nylon cargada positivamente Hybond N + y 2 piezas de papel filtro grueso. (20 x SSC: NaCl de 3 M, citrato de sodio de 0.3 M).
    2. Prepare la instalación Blot (figura 6) colocando el gel, las ranuras hacia abajo en la parte superior el papel de filtro en la placa de plástico. Colocar una membrana Hybond N+ en la parte superior, seguido de 2 capas de papel de filtro. Humedezca previamente cada capa de 20 x SSC antes de añadirlos a la Asamblea. Asegúrese de eliminar cualquier burbuja de aire entre capas como estas impiden a la transferencia de ADN.
    3. Cubrir el conjunto con una capa gruesa de papel de seda. Coloque una placa de plástico con un peso, como una botella pequeña, en la parte superior. Asegúrese de que la presión se divide igualmente en el gel. Esto asegurará a la transferencia correcta de la DNA.
      Nota: El peso debe ser aproximadamente 200 – 300 g; pesos pesados dificultan a la transferencia de ADN.
    4. Cubra el área que rodea el conjunto, incluyendo el papel filtro expuesto, con film transparente (figura 6) para evitar la evaporación de la 20 x SSC buffer y objetivo que las fuerzas de los capilares hacia la membrana de nylon. Secar durante la noche.
    5. Marque la posición de las ranuras, el nombre o la fecha encima de la membrana con lápiz y quitar la membrana de la Asamblea. Tenga en cuenta que la parte que ha estado en contacto con el gel, lleva el ADN.
    6. Inmediatamente fijar el ADN a la membrana por la irradiación UV (2.400 μj/m2) usando un Crosslinker UV.
      Nota: Condiciones de reticulación dependen del tipo de membrana utilizado.
      Nota: en este punto la membrana puede ser almacenada a-20 ° C y utilizada por hibridación con una sonda más adelante. Enjuagar la membrana reticular en 2 x SSC y un sello en la dobló la tubería del polietileno termosoldables antes de colocar a-20 ° C.
  6. Preparar la sonda de hibridación.
    1. Amplificar la secuencia como sonda para la transferencia de ADN por PCR20. 50-100 ng de un fragmento PCR 250 kbp de bp-2 se utiliza como sonda. Dos sondas separadas, uno cruza por hibridación a la región proximal del borde derecho y el otro a la región proximal del borde izquierdo del T-DNA, pueden utilizarse para evaluar la presencia de todo T-DNA (Figura 4A y figura 7).
    2. Diluir 50-100 ng del producto de PCR en 24 μl de agua desionizada ultrapura en un tubo de ensayo.
    3. Desnaturalizar el producto PCR diluido hirviendo durante 5 minutos en un vaso de agua o el calor, luego enfríe en hielo.
    4. Descongele la premade GCT-mix en el hielo. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (todos 0,5 mM), random hexamers 43.2 ng/μl, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM de β-mercaptoetanol, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6.8, 17 mM MgCl).
    5. Añadir 21 μl de la mezcla de GCT y 2 U de Klenow fragmento del producto de PCR.
    6. Añadir 2 μl de [32P] ATP a la mezcla e incubar a 37 ° C durante 1 h.
      PRECAUCIÓN: Todos los pasos que involucra ATP [32P] deban llevarse a cabo en un ambiente designado para trabajo radiactivo durante el uso de la protección adecuada.
      Nota: Asegúrese de que el ATP [32P] es fresco (no más de 1 tiempo transcurrido).
    7. Preparar un Sephadex G-50 (grueso o medio) de la columna21 para purificar la sonda marcada de unincorporated nucleótidos (radiactivos). Tomar una jeringa de 2 mL y tapa la salida con un pequeño círculo de papel filtro grueso. Añadir 2 mL de Sephadex G-50 disuelta en TE en la jeringa y extraer todo el líquido de la columna spinning.
    8. Coloque la columna en un tubo de plástico de 15 mL, carga la sonda marcada en la columna y centrifugado a temperatura ambiente (establece la centrifugadora a x 750 g, permiten el rpm aumentar hasta llega a 750 g x, entonces parar la centrífuga y permitir la rotación bajando a 0 x g) a fin de eluir la sonda. Añadir 200 μL de TE a la columna y vuelta a fin de eluir la sonda restantes; repetir una vez. En estas condiciones, fragmentos de ADN marcados quedan excluidos de la matriz de Sephadex y procederá a la elución, mientras que nucleotides libres permanecen en la columna.
    9. Utilizar 300 μL de la sonda marcada por el tubo de hibridación. Mantenga la sonda marcada restantes a-20 ° C para uso posterior. Sin embargo, tener presente el tiempo medio de ATP [32P].
  7. Hibridar lo blot de DNA.
    1. Calor 2 x SSC y tampón de hibridación (15 mL por tubo de hibridación, máximo de 2 manchas blancas por el tubo) a 65 ° C. (Tampón de hibridación: sulfato de dextran 10%, 1% SDS, 1 M NaCl, 50 mM de Tris pH 7,5, disolver a 65 ° C, mantener alícuotas a-20 ° C).
    2. Precalentar el horno de hibridación a 65 ° C.
    3. Colocar malla de nylon en una bandeja con un poco de caliente (65 ° C) 2 x SSC para cubrir la bandeja. Coloque el blot de DNA sobre la malla con el lado de ADN hacia arriba. Rollo de la mancha junto con la malla y coloque el rollo en un tubo de hibridación. Retirar el exceso 2 x SSC.
    4. En un tubo de microcentrífuga, hervir 150 μL de ADN de esperma de salmón (concentración 10 mg/mL) por el tubo de hibridación durante 5 minutos (véase también paso 4.6.3). Enfriar inmediatamente en hielo y añadir el tampón de hibridación precalentado.
    5. Añadir la solución de esperma salmón tampón de hibridación al tubo con el blot. Pre-hibridar a 65 ° C durante al menos 1 h en un disco giratorio, a 12 rpm.
    6. Cuando la previa incubación en el paso 4.7.5. está casi terminado, hervir 300 μL de la sonda marcada por 5 min (véase también paso 4.6.3) y añadir inmediatamente a la mancha después de la incubación.
    7. Hibridar durante la noche en la rueda giratoria a 63 ° C, 12 rpm. No pipetear la sonda directamente sobre la mancha, pero en la solución de esperma salmón tampón de hibridación.
  8. Lave la mancha.
    1. Precalentar las soluciones de lavado (1 x SSPE, SDS 0.1% y 0.1 x SSPE, 0.1% SDS) a 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7.0).
    2. Deseche la solución de hibridación y añadir unos 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solución al 0.1% SDS al tubo de hibridación, cierre el tubo y girar a mano. Vierta la hibridación y lavado solución en los residuos radiactivos líquidos apropiados.
    3. Añadir unos 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solución al 0.1% SDS al tubo, cierre e incubar los tubos durante 15 minutos a 63 ° C en la rueda giratoria, 12 rpm. Deseche la solución de lavado adecuadamente.
    4. Añadir unos 100 – 150 mL de 0.1 x SSPE, solución al 0.1% SDS al tubo de hibridación, cierre y girar el tubo durante 5 minutos a 63 ° C, 12 rpm. Deseche la solución de lavado adecuadamente.
    5. Tome la mancha blanca /negra del tubo y colóquelo en una bandeja que contiene suficiente precalentado 0.1 x SSPE, 0.1% SDS y agitar durante 3 minutos en un baño a 65 ° C. Mientras tanto, lavar la malla en una bandeja llenada de agua.
    6. Sacar la mancha, coloque entre plástico previamente doblado (tubería de polietileno), cuidadosamente Limpie el exceso de líquido y dejar que la mancha se seque brevemente. Tenga en cuenta que el líquido se arruinará la pantalla phosphorimager.
    7. Sello de la mancha de plástico en los tres lados. Retire todo exceso de líquido que rodea lo blot y cerrar el tubo de plástico de sellado el cuarto lado. Corte el exceso de plástico. Asegúrese de que la mancha sellado no tiene fugas y que el plástico es seco en el exterior.
  9. Exponer la pantalla phosphorimager.
    1. Lugar el blot sellada en un cassette phosphorimager, con la pantalla phosphorimager hacia el lado de ADN de la mancha. Cerrar el cassette y dejar ± 2 a 4 días, dependiendo de la fuerza del etiquetado radiactivo y la sensibilidad de la phosphorimager.
    2. Escanear la pantalla phosphorimager usando un phosphorimager. Tenga cuidado al exponer la pantalla lo menos posible a la luz antes de la exploración. Guarda la imagen. Borrar la pantalla de la señal, exponiéndolo a la luz.
  10. Analizar el blot.
    1. El análisis depende de la estrategia de restricción utilizada en el paso 4.1. Al analizar la mancha preparado según la estrategia que se muestra en el paso 4.1.1.1 (Figura 4A), contar el número de los fragmentos detectados. En esta estrategia, el número de fragmentos hibridadas se refiere al número de integraciones de T-DNA.
      1. Comparar el número de los fragmentos detectados con una sonda para la izquierda (figura 7B) y la parte derecha (figura 7) del T-ADN.
        Nota: Si un número diferente de cruzamiento por hibridación de fragmentos es detectado, entonces cualquiera de los dos i) T-DNA copias múltiples (ya sea en orientación directa o invertida) o ii) incompleto integrado T-DNAs están presentes.
      2. Estimar los tamaños de fragmentos hibridadas en el blot basan en el tamaño de las bandas del marcador y comparar los tamaños de los fragmentos hibridadas con el fragmento esperado tamaños calculan basados en la estrategia de restricción de las inserciones de tándem (Figura 4A) a identificar el arreglo posible tándem de las T-DNAs. Guíese por la Figura 4A para calcular el tamaño de los fragmentos esperados.
        Nota: Si el tamaño de fragmentos hibridizadas no está de acuerdo con los calculados, entonces muy probablemente uno de las integraciones de presente no es completa.
    2. Al analizar la mancha preparado según la estrategia que se muestra en el paso 4.1.1.2 (Figura 4B), estimar el tamaño del fragmento del cruzamiento por hibridación en blot basándose en el tamaño de las bandas del marcador y compararlo con el tamaño esperado. Una inserción intacta produce un solo fragmento con una longitud definida. Cualquier desviación de la longitud esperada indica integración incompleta (figura 7).
  11. Tira de la mancha blanca /negra de la hibridación (opcional).
    Nota: La misma mancha puede ser cruzado por hibridación consecutivamente con diversas puntas de prueba. Antes de continuar con una nueva sonda, tira una sonda hibridada anterior del blot.
    1. Para quitar la punta de prueba de la mancha, lugar de la mancha en una bandeja con su ADN hacia abajo. Vierta un superávit de 0,5% de SDS en la bandeja. Hervir la membrana 2 – 5 minutos. La duración del tratamiento depende del tamaño y contenido de GC de la sonda utilizada. Las sondas más largas y ricas en GC necesitan un tratamiento más largo.
    2. Después de decapar, hibridar el blot con otra sonda, sellar y almacenar a-20 ° C.

Resultados

Usando el sistema de la BIBAC-GW, construcciones de reportero para el estudio de ODM en las plantas fueron generado10. Construcciones fueron diseñadas en la entrada de la puerta de entrada vector pENTR gm12 y se inserta en pBIBAC-BAR-GW (figura 1) mediante la reacción de recombinación Gateway LR.

Arabidopsis se transformaron con pDM19, un plásmido ...

Discusión

Crítica a la generación de transgénicos con integraciones individuales, intactos de un transgen es la elección del vector binario utilizado. Vectores familia BIBAC se han utilizado para proporcionar secuencias de intereses a muchos planta especie23,24,25,26,27,28. Vectores de la BIBAC, incluyendo BIBAC-GW, rendimiento sol...

Divulgaciones

Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación es apoyada por el holandés tecnología Fundación STW (12385), que forma parte de la organización de países bajos para la investigación científica (NWO), y que en parte es financiado por el Ministerio de economía (OTP Grant 12385 a MS).  Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidad de Cornell, Estados Unidos) para proporcionar la pCH20, la columna vertebral de los vectores de la BIBAC GW.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Kanamycin sulphate monohydrateDuchefaK0126
Gentamycin sulphateDuchefaG0124
RifampicinDuchefaR0146
Tetracycline hydrochlorideSigmaT-3383
DB3.1 competent cellsThermo Scientific - Invitrogen11782-018One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cellsThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
tri-Sodium citrate dihydrateMerck106432
Trizma baseSigma-AldrichT1503
EDTA disodium dihydrateDuchefaE0511
Proteinase KThermo Scientific EO0491
Bacto tryptoneBD211705
Yeast extractBD212750
Sodium chlorideHoneywell Fluka13423
Potassium chlorideMerck104936
D(+)-Glucose monohydrateMerck108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gapBiorad1652089
Electroporator Gene PulserBioRad
Magnesium sulfate heptahydrateCalbiochem442613
D(+)-Maltose monohydrate 90%Acros Organics32991
SucroseSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Skoog mediumDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosinate-ammonium (Basta)Bayer79391781
Restriction enzymesNEB
Ethidium BromideBio-Rad1610433
Electrophoresis systemBio-Rad
Sodium hydroxideMerck106498
Hydrochloric acidMerck100316
Blotting nylon membrane Hybond N+Sigma Aldrich15358or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paperGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acetylated BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-MercaptoethanolMerck805740
Sephadex G-50 CoarseGE Healthcare Life Sciences17004401or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium saltSigma-AldrichD8906
Sodium Dodecyl Sulfate US BiologicalS5010
Salmon Sperm DNASigma-AldrichD7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateMerck106346
Storage Phosphor screen and casetteGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Phosphor imagerGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrosslinkerStratageneStratalinker 1800
cling film (Saran wrap)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Boric acidMerck100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder.MRC HollandMCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladderMRC HollandMCT8080
Hexanucleotide MixRoche11277081001
Large-Construct KitQiagen12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clearvarious providersthe width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter diskMerckVSWP02500
Magnesium chlorideMerck105833
Hybridization meshGE Healthcare Life SciencesRPN2519

Referencias

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