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요약

PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

초록

유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목표는 transgene의 안정적인 식 것입니다. 이 transgene의 단일, 그대로 통합 다중 복사 통합 유전자 입을 대상이 종종 필요 합니다. 다른 pBIBAC 파생 상품 같은 세균성 인공적인 염색체 (pBIBAC-GW)에 따라 게이트웨이 호환 이진 벡터 고효율 단일 카피 transgenes의 삽입을 수 있습니다. 원래 pBIBAC에 개선으로 게이트웨이 카세트는 되었습니다 복제 pBIBAC GW에 관심의 시퀀스 지금 통합 될 수 있다 쉽게 벡터 전송 DNA (T-DNA)에 게이트웨이 복제 하 여 그렇게. 일반적으로, pBIBAC GW와 변환 결과 0.2-0.5 효율 %, 그것에 의하여는 제 닉의 T-DNA의 본래 단일 복사 통합 수행. PBIBAC-GW 벡터 Glufosinate 염화에 저항 또는 선택 식물, 씨 외 투에서 DsRed 형광와 저항 대에 박테리아에서 선택 항목으로 사용할 수 있습니다. 여기, 프로토콜의 시리즈 pBIBAC GW를 사용 하 여 유전자 변형 식물 생성의 과정을 통해 독자를 안내 하는 표시 됩니다: 진상을 공장 로 변환 하는 선택의 pBIBAC GW 벡터에 관심의 시퀀스에서 시작 Agrobacterium, 제 닉, 그리고 테스트 DNA 럽을 사용 하 여 삽입의 intactness 및 복사 번호에 대 한 식물의 선택. 주의는 DNA 더 럽 히 전략을 인식 하는 단일 및 다중 loci에서 단일 및 다중 복사 통합 주어 집니다.

서문

유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목적은 안정적으로 표현 하는 통합된 transgene(s) 것입니다. 이 transgene의 그대로 단일 복사본 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 여러 통합은 transgene의 증가 표현 뿐만 아니라 유전자 입을 발생할 수 있습니다. Transgenes의 입을 경우 삽입된 시퀀스 협동 또는 거꾸로 반복1,2,,34에서 배열 된다 확률이 높다. 이진 벡터 Agrobacterium에 셔틀으로 이용 된다-식물 게놈으로 관심의 시퀀스를 제공 하는 변환 실험을 중재. 식물 게놈으로 통합의 수 Agrobacterium tumefaciens5,6. 이진 벡터의 복사본 수에 따라 달라 집니다. 많은 일반적으로 사용 되 이진 벡터는 높은 복사 벡터 및 따라서 높은 평균 transgene 복사본 수를 산출: 애기53.3 4.9 복사본.

BIBAC7또는 T-DNA A. tumefaciens 염색체5에서 시작 하 여 낮은 복사 번호 A. tumefaciens에 있는 이진 벡터를 사용 하 여 T-DNA 통합의 수를 낮출 수 있습니다. 이러한 경우 transgene 통합의 평균 수는 25,8,,910아래입니다. 따른 단일-복사 A. tumefaciens 에 대장균에서 BIBAC 파생 상품 수 유지 및 구문 150 kb11로 제공.

GW 호환 BIBAC 벡터10,12 게이트웨이 복제를 사용 하 여 벡터에 관심사의 유전자의 도입에 쉽게 수 있습니다. 게이트웨이 기술 사용 하 여 복제 프로시저를 단순화 하지만 또한 큰 낮은 복사 번호 벡터13,14, 낮은 DNA 수율 등 독특한 제한의 제한 된 선택과 관련 된 일반적인 문제를 극복 7,11복제에 사용할 수 있는 사이트. PBIBAC-GW 파생 상품 Glufosinate 염화 (pBIBAC-바-GW) 어느 저항 또는 DsRed 형광 씨 외 투 (pBIBAC-RFP-GW) 식물 (그림 1)10,12선택에 사용할 수 있습니다. 두 벡터에 대 한 대 저항 유전자는 박테리아에서 선택 마커로 사용 됩니다.

PBIBAC-GW 벡터 결합: (1) 쉬운 디자인 및 유전자 조작 대장균및 (2) 그대로 단일 복사 통합에서 planta에 높은 효율에. 들고 단일 유전자 변형 식물의 약 절반으로 애기 에 평균 1.7 통합에 pBIBAC GW 벡터 수확량은 통합 T DNA10.

안정적인 표현의 transgenes 대부분 제 닉 생성에 대 한 요구 사항입니다. 안정적인 transgene 식 그대로, 단일 복사 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 그러나 유전자 변형 식물 그대로, 단일 복사 통합 운반 작업은,, 훨씬 더 중요 한 경우 예를 들어 목표 mutagenesis, 재결합, 또는 복구, 등 이러한 의존 chromatin 기반 프로세스의 효율성을 연구 하는 것입니다 genomic 위치 및 삽입 사이트에서 chromatin 구조에 처리 합니다. 우리의 관심 지역의 게놈 문맥에 의존 oligonucleotide 감독 mutagenesis (ODM)의 공부 mutagenesis 취재 원 유전자의 손상, 단일 복사 통합 기자 라인의 집합 생성된 (그림 2)10이었다. 이 일련의 줄을 사용 하 여, 보였다 ODM 효율 되 고 오히려 유사한 transgene 식 수준에도 불구 하 고 다른 genomic 위치의 통합 유전자 변형 loci 사이 변화 한다.

프로토콜

1. 이진 벡터에 관심의 시퀀스를 삽입

  1. 게이트웨이 항목 및 이진 벡터를 준비 합니다.
    1. DNA 파편 또는 공급 업체의 제안에 따라 소형 예비 키트를 사용 하 여 관심사의 유전자를 포함 하는 게이트웨이 항목 벡터를 격리 합니다.
      참고: BIBAC GW 벡터, 따라서 박테리아, 선택에 대 한 대 (Km)의 사용을 필요로 입력 벡터를 사용 하 여 대 대신 다른 저항 표시와 함께. 예를 들어, Gentamicin 저항 유전자를 운반 하는 pENTR-gm 벡터12좋은 선택 이다.
    2. 전파 하 고 관심의 BIBAC GW 벡터를 분리. 사용 하 여 게이트웨이 카세트 내의 ccdB 유전자의 독성에 저항 하는 E. 콜라이 긴장. 사용 하 여 격리 BIBAC-벡터 프로토콜 또는 공급 업체의 제안에 따라 큰 플라스 미드를 위해 특별히 설계 된 키트.
  2. 게이트웨이 반응을 수행 합니다.
    1. 공급 업체의 제안에 따라 LR 재결합 반응 준비. 실 온 (RT)에서 1.5 mL microcentrifuge 관에서 다음 구성 요소를 혼합: 100-300 ng 항목 복제 (supercoiled), 300 BIBAC GW 벡터, LR Clonase 반응 버퍼의 ng (최종 농도: 1 x). 테 (10 mM Tris, EDTA, pH 8.0의 1 m m)와 16 µ L 혼합의 볼륨을 조정 합니다. 마지막으로, vortexing에 의해 LR Clonase 효소 믹스, 그리고 혼합의 4 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 25 ° C에 혼합물을 품 어.
    2. 1.2.1 단계에서 준비 하는 혼합물에 LR 반응 성분을 K 솔루션 (2 µ g / µ L)의 2 µ L을 추가 하 여 종료 합니다. 혼합 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  3. Electroporation에 의해 대장균 게이트웨이 반응 혼합물으로 변환.
    1. Electroporation 이전 LR 반응 혼합물 desalt
      참고:이 단계는 성공적인 electroporation에 대 한 중요 한. 아래는 투 석 방법 강수량 나트륨 아세테이트와 같은 설명, 하지만 다른 방법 이며 에탄올을 사용할 수 있습니다.
      1. LR 반응의 투 석 필터에 대 한 설치를 준비 합니다. 멸 균 페 트리 접시에 초순 이온된 물 20 mL를 붓으십시오. 멤브레인 필터 디스크 배치 (기 공 크기 = 0.025 µ m) 물 표면에.
      2. 플라스틱 막 위에 신중 하 게 전체 LR 반응 하 고 1 시간에 대 한 실시간에 dialyze 혼합물을 허용.
    2. 전기 유능한 DH10B 셀 electroporation 베트 (0.1 c m)에 desalted LR 믹스의 5 µ L를 추가 합니다. Electroporate 셀 (1.5 V/cm, 저항 200 Ω, 커패시턴스 25 µ F), 45 분, 180 rpm에 대 한 37 ° C에 외피 다음 셀에 1 mL 미리 데워 진된 슈퍼 최적의 Catabolite 억압 (SOC) 매체를 즉시 추가 하 고. (, SOC 매체 Bacto tryptone, 효 모 5 g의 1 l: 20 g 추출, 0.5 g의 NaCl, 1 M KCl의 2.5 mL 20 mL의 1 M 필터 살 균 포도 당).
      참고: DH10B 셀 큰 플라스 미드를 안정적으로 유지 하는 다른 대장균 세포에 대 한 대체 될 수 있습니다.
      참고: 최적의 electroporation 조건 사용 electroporation 장치에 의존 하고있다.
    3. 30에 대 한 최대 속도에서 박테리아를 작은 s는 microcentrifuge를 사용 하 여 과잉 SOC, 제거 하 고 펠 릿 Luria Bertani (파운드) 매체의 약 50-100 µ L에서 resuspend. 대-파운드 (Km-파운드) 접시 (Km 농도, 40 µ g/mL)에 박테리아를 확산 하 고 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. (파운드 매체 Bacto tryptone, 효 모 5 g의 1 l: 10 g 추출, NaCl의 10 g. 단단한 매체에 대 한 추가 한 천 15 g/L).
  4. Recombined BIBAC GW 파생 상품을 식별 하 고 플라스 미드 DNA를 분리.
    1. Km-파운드 접시에 성장 수, 대장균 세포는 ccdB 시퀀스 원하는 삽입 바뀌는 recombined BIBAC GW 플라스 미드를 포함 해야 합니다. 식민지 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)15 를 사용 하 여 접시에 박테리아 식민지 BIBAC GW 백본 및 관심의 삽입 하는 데 올바른 플라스 미드 포함 확인.
      1. PBIBAC-바-GW 등뼈를 식별 하려면 뇌관 DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-315 PCR 반응을 수행 '와 DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. 이 뇌관 세트 바 유전자의 563 bp 파편을 증폭 한다.
      2. 확인 하려면 BIBAC-RFP-GW 중추의 존재에 대 한 수행 하십시오 뇌관 M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3를 사용 하 여 PCR15 반응 '와 M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. 이 뇌관 조합 cruciferin promotor 및 rfp 시퀀스를 중복 791 bp 파편을 증폭 한다.
      3. PCR15 반응 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 관심의 삽입의 존재에 대 한 확인을 수행 합니다.
    2. 하나의 긍정적인 식민지 DNA 격리16대 (40 µ g/mL)를 포함 하는 파운드 매체의 2-5 mL에 접종 밤새 180 rpm, 궤도 셰이 커에 37 ° C에서 품 어.
    3. 플라스 미드 DNA 분리 (1.1.2 단계 참조).

2. A. tumefaciens 애기 꽃 찍기 위한 준비

  1. A. tumefaciens를 파생 상품 BIBAC GW를 변환.
    1. A. tumefaciens 스트레인 C58C1는 pCH32 운반 도우미의 전기 유능한 세포 준비 플라스 미드7. 박테리아가 항생물질 (5 µ g/mL) 및 pCH32에 대 한 선택만 Agrobacterium 세포의 성장을 보장 하 리 팜 피신 (100 µ g/mL)의 존재를 성장 합니다.
    2. 추가 0.25-0.5 µ g pBIBAC GW 파생의 DNA 중 10-20 µ L 살 균 이온된 초순, electroporation 큐 벳 (0.1 c m)에서 20 µ L 유능한 Agrobacterium 셀에 녹아. 얼음에 셀을 계속.
    3. Electroporate 셀 (1.5 V/cm, 저항 400 Ω, 커패시턴스 25 µ F). 직후 electroporation, 박테리아를 1 mL 미리 따뜻하게 (28 ° C) SOC 매체를 추가 하 고 60-90 분 동안 28 ° C에 세포를 품 어.
    4. 100 µ L와 리 팜 피신 (100 µ g/mL), 항생물질 (5 µ g/mL), 고 대 (40 µ g/mL)를 포함 하는 별도 파운드 격판덮개에 박테리아의 나머지 부분을 확산 하 고 1-2 일에 28 ° C에서 어둠 속에서 품 어.
  2. Agrobacterium 정지를 준비 합니다.
    1. 2.1.4, 정확한 벡터의 존재에 대 한 단계에서 준비 된 접시에서 A. tumefaciens 식민지의 몇 PCR에 의해 확인 (단계 1.4.1 참조).
    2. 항생제 (단계 2.1.4 참조)를 포함 하는 파운드 플레이트에 적절 한 삽입과 이진 벡터를 포함 하는 단일 식민지 확인 연속. 28 ° C에 밤새 껏 성장 한다.
    3. 2.2.2 단계에서 얻은 단일 식민지와 질주를 반복 합니다.
    4. 항생제 (단계 2.1.4 참조) preculture로 보충 하는 LC 매체의 2.5 ml에서 단일 식민지 접종 적어도 8 h 28 ° C에 또는 하룻밤, 180 rpm에서 품 어. (LC 매체 Bacto tryptone, 효 모 5 g의 1 l: 10 g 추출, 0.5 g의 NaCl, MgSO4 · 7h2O, 2.5 g 糖의 2 세대).
    5. 2.2.4 단계에서는 preculture를 추가 합니다. 250 ml LC 항생제 (단계 2.1.4 참조)로 보충 하 고 하룻밤 180 rpm, 28 ° C에서 성장 한다.
    6. 펠 릿 12 분에 대 한 5500 x g에서 회전 하 여 문화 5% 자당, 0.05를 포함 하는 100 mL 해결책에 펠 릿을 일시 중단 다시 식물의 Silwet L-77, 양 부 어 꽃 찍기 위해 무 균 용기에 정지 x 0.5%.

3. 애기 변환

  1. 변환에 대 한 애기 식물을 준비 합니다.
    1. 때까지 그들은 (각 찍기 당 9 식물 12 화분) 꽃이 피는 온실 또는 기후 제어 성장 챔버에 애기 식물을 성장.
    2. 클립 등장 하 더 많은 보조 볼트 수 있도록 첫 번째 볼트. 식물 식물가지고 많은 미 숙 꽃 머리 및 많은 클리핑, 후 4-6 일을 찍기 위한 준비가 siliques를 수정.
  2. 꽃을 찍기
    1. 준비 단계 2.2.6에서에서 Agrobacterium 에 5-10 s inflorescences 찍어. 부드러운 동요를 사용 합니다.
    2. 집착 영화, 높은 습도 유지 하는 식물의 지상 부분을 랩 하 고 어둠 속에서 식물을 유지 하는 상자 화분 커버. 온실/성장 챔버에 2 일 동안 식물을 품 어.
    3. 상자와 집착 필름을 제거 하 고 온실/성장 챔버에 성숙 하는 식물을 성장.
      참고: 변환의 효율성을 높이고, 동일한 식물 수 있습니다 첫 번째 찍기 후 다시 감소 7 일.
    4. 씨앗을 수확. 수영장 및 단일 집합으로 동일한 구조와 변형, 식물의 씨앗 (T1)을 분석.
  3. 유전자 변형 식물에 대 한 화면입니다.
    1. PBIBAC-RFP-GW 파생 된 변형 유전자 변형 식물에 대 한 화면, 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 씨앗을 분석. 씨 외 투에서 DsRed 식을 탐지 하기 위해 560 nm의 여기 및 600-650 nm의 방출에서 씨앗을 이미지. 집게를 사용 하 여 비 형광에서에서 형광 씨앗을 분리 합니다.
    2. PBIBAC-바-GW 파생 된 변형 유전자 변형 식물에 대 한 검열, 토양 (~ 2500 씨앗/0.1 m2)으로 채워진 쟁반에 씨앗을 뿌린. 쟁반에 씨앗의에 확산 되도록 重 Skoog 매체 (MS), x 0.5에서 0.1 %agar 씨앗을 일시 중단 하 고 1 mL 피 펫을 사용 하 여 씨앗을 확산.
      참고: 동기 방식으로 발 아 씨앗을 자극, 하 품 어 씨앗 4 ° c.에 적어도 2 일 동안 이것은 씨앗을 파 종 전후 행 해질 수 있다.
      1. 0.5 %Glufosinate 염화 솔루션 2 주와 3 주 쟁반에 파 종 후 묘를 스프레이. 500 mL 1 m2당 Glufosinate 염화 솔루션을 사용 합니다.
      2. 개별 냄비에 살아남은 묘를 전송. 묘 목 (2) Glufosinate 염화 치료 전후와 쟁반의 전형적인 이미지는 그림 3에 나와 있습니다.
      3. 관심의 구조물의 존재에 대 한 PCR에 의해 Glufosinate 염화 방지 식물 분석 (단계 1.4.1 참조. 뇌관에 대 한).
        1. 에드워즈 외 에 설명 된 방법을 사용 하 여 PCR를 위한 식물 게놈 DNA를 분리 17

4. 수와 T DNA 통합의 무결성에 대 한 제 닉 특성화

  1. 제한 소화의 전략
    참고: DNA는 제한 효소를 사용 하 여 blotting에 의해 T DNA 통합 및 그들의 수를 결정 합니다. 이 방법은 단일, 식별을 허용 하지만 또한 게놈에서 동일 하거나 다른 loci에 통합을 반복.
    1. 제한 소화의 일련을 사용 하 여 식별 가능한 다른 통합 패턴:
      1. T-DNA 시퀀스 업스트림과 다운스트림 (그림 4A 와 그림 7A-C) 제한 사이트를 독립적으로 프로브 수 가운데 한 번 인하 하는 효소를 선택 합니다. 그림 4A및 예상된 결과 해석에 대 한 그림 범례 참조.
      2. 효소 또는 관심 한 번에 (그림 4B 와 그림 7A-D)의 전체 시퀀스 밖으로 절단 하는 효소의 조합을 선택 합니다. 알려진된 길이에서 어떤 편차 통합된 카세트의 잘림을 나타냅니다.
        참고: 사용 하는 시 토 신 메 틸 화 과민 한 금지 효소를만 주의 하십시오.
  2. 게놈 DNA 샘플을 준비 합니다.
    1. 관심의 구조를 운반 하는 식물에서 게놈 DNA를 분리. DNA 분리18CTAB DNA miniprep 메서드를 사용할 수 있습니다. DNA에 대 한 오 점 애기 DNA의 분석, 게놈 DNA의 2-2.5 µ g이 필요 하다. 테의 50 µ L에서 DNA를 분해.
    2. 젤 전기 이동 법16여 DNA 무결성을 확인 하십시오. 본래 genomic DNA 젤 상단에 하나의 개별 밴드로 마이그레이션합니다. DNA 저하 얼룩의 존재로 인식 될 수 있다. 반복적인 동결 해빙으로 인해 DNA 손상을 방지 하려면 genomic DNA 샘플 4 ° c.에 유지 됩니다.
    3. 게놈 DNA ( 애기 genomic DNA의 경우 2-2.5 µ g) 50 µ L, 하룻밤의 전체 볼륨에 버퍼 조건 제안한 효소 공급 업체를 사용 하 여 다이제스트.
      1. 테스트 튜브에 2-2.5 µ g 애기 genomic DNA, 5 µ L 10 x 제한 버퍼, 그리고 50 µ L의 초순 이온 물 총에서 5 U 제한 효소의 혼합.
    4. 젤에 적재 하기 전에 제한 샘플을 로딩 염료 (최종 농도 x 1)를 추가 합니다. 다음 중 하나를 사용 하 여 좋은 시각적 추적에 대 한: 작은 조각 (Bromophenol 블루, 350-400 bp), comigrating 또는 더 큰 파편 (Cylene cyanol, 3-4 kbp) comigrating.
  3. DNA 젤을 실행 합니다.
    1. TBE agarose 젤19x 긴 (20 cm) 0.5 준비 합니다. Agarose 젤에서의 % 예상 조각 크기에 따라 달라 집니다. 0.8-1% 최적 분리 조각 > 크기가 1 kb. 조각 1-1.5 %agarose 사용 하 여 < 1 kb. Ethidium 평범한 사람을 젤을 추가 하지 마십시오. (5 x TBE, Trizma의 1 l: 54 g 기지, 붕 산, EDTA의 3.75 g의 27.5 g).
      참고: 오염을 방지 하기 위해 DNA, 플라스 미드 및 PCR 충분치에 사용 되지 않는 사용 젤 쟁반 DNA 증폭.
    2. 젤19에 샘플을 로드 합니다.
    3. 예상된 파편의 크기 범위에 있는 젤에 DNA 마커를 추가 합니다. 자외선에 의해 시각화 수 있도록 젤에 마커 (다른 크기의 조각의 50-250 ng)의 약 1 µ g를 로드 합니다.
    4. 크기-는 낮은 전압 (40-50 V/500 mA)에서 DNA가 충분치 하룻밤.
  4. 나일론 막 agarose 젤에서 DNA의 전송을 위해 준비 합니다.
    1. 별도 용지함에 젤을 전송 하 고 0.5에서 20-25 분 얼룩 Ethidium 평범한 사람을 포함 하는 x TBE (5 µ g/mL) 궤도 통에 40 rpm에 회전 하 여.
    2. UV transilluminator에 젤을 시각화. 개별 위성 밴드 (그림 5A)의 표시를 포함 하 여 게놈 DNA의 크기 분리를 확인 합니다. 낮은 분자량 크기 향해 얼룩 DNA 저하를 나타냅니다.
    3. UV transilluminator에 젤, 투명도 놓고 고 마커 펜 (그림 5B) 슬롯과 마커 밴드의 위치를 표시 합니다. 이 마커 시퀀스 DNA 프로브로 교배 하지 않습니다 경우 나중 교배 조각의 크기를 결정을 촉진 한다. 이 단계에서 마커 파편을 나타내어, 교배 시킨 파편의 크기를 추적 가능 하다.
    4. 용지함에 다시 젤, 초순 이온된 수로 씻어 놓고 젤 내 DNA fragmentize에 15 분 동안 0.25 M HCl에 잠수함. 초순 이온된 물으로 씻으십시오. 트레이, 젤 커버 충분 한 HCl와 물을 사용 하 고 회전 궤도 통에 40 rpm에서 잠수 젤 트레이.
    5. 젤 초순 이온된 물으로 30 분 세척에 대 한 변성 버퍼에서 품 어. 트레이, 젤 커버에 충분 한 버퍼와 물을 사용 하 고 회전 궤도 통에 40 rpm에서 잠수 젤 트레이. (변성 버퍼: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl).
    6. 젤 초순 이온된 물으로 30 분 세척에 대 한 중립화 버퍼에서 품 어. 충분 한 버퍼와 물을 사용 하 여 용지함에 젤 커버, 회전 궤도 통에 40 rpm에서 잠수 젤 트레이. (중화 버퍼: 0.5 M Tris, 1.5 M NaCl, 220 m m HCl, pH 7.6).
  5. 나일론 막에 DNA를 전송 합니다.
    1. 게놈 DNA의 모 세관 전송에 대 한 설치를 준비 합니다. 쟁반 가득 염-나트륨 시트르산 (SSC) x 20 (대략 크기는 젤의 또는 더 큰) 플라스틱 접시를 놓습니다. 둘 다 그것의 끝의 SSC에 거는 있도록 트레이, 위에 두꺼운 필터 종이 접어. 젤 크기의 충전 된 나일론 막 Hybond N +, 조각의 두꺼운 필터 종이의 2 개를 잘라. (20x SSC: 3 M NaCl, 0.3 M 나트륨 구 연산 염).
    2. 젤, 플라스틱 접시에 필터 종이 위에 아래로 슬롯을 배치 하 여 더 럽 히 설치 (그림 6)를 준비 합니다. 위에, Hybond n + 막 배치 필터 종이의 2 층에 의해 따라. 미리 20에 각 계층을 젖은 x SSC 어셈블리에 그들을 추가 하기 전에. 이러한 DNA 이동 방해로 레이어 사이 모든 기포를 제거 되었는지 확인 합니다.
    3. 휴지의 두꺼운 층으로 어셈블리를 커버. 위에 작은 병 같은 무게로, 플라스틱 접시를 놓습니다. 압력은 동등 하 게 젤 위에 분할 된다 다는 것을 확인 하십시오. 이렇게 하면 DNA의 적절 한 전송.
      참고: 무게 약 200-300 g; 되어야 합니다. 무거운 무게 DNA 이동 방해.
    4. 집착 영화 (그림 6)와 함께 노출된 필터 종이 포함 하 여 20 x SSC 버퍼 및 모 세관 나일론 막 쪽으로 강제로 대상의 증발을 피하기 위해 어셈블리 주변 지역을 커버. 밤새 오 점.
    5. 연필, 슬롯, 이름, 막 위에 날짜의 위치를 표시 하 고 어셈블리에서 멤브레인을 제거 합니다. 참고 아래쪽 젤, 접촉 된 DNA를 운반 합니다.
    6. 바로 UV Crosslinker를 사용 하 여 UV 방사선 (2400 µ / m2)에 의해 막에 DNA 수정.
      참고: 가교 조건 사용 하는 막의 종류에 따라 달라 집니다.
      참고:이 시점에서 막 수-20 ° C에 저장 되며 프로브와 나중에 교 잡에 대 한 사용. 가교 된 막 SSC 및 그것에 미리 접혀-20 ° c.에 그것을 배치 하기 전에 열 접착 폴 리 에틸렌 튜브 x 2 린스
  6. 교 잡에 대 한 조사를 준비 합니다.
    1. 증폭 DNA PCR20blotting에 대 한 조사로 사용 될 순서. 250 bp 2 kbp PCR 파편의 50-100 ng는 프로브로 사용 됩니다. 두 개의 별도 프로브, 오른쪽 테두리 인접 지역 및 T-DNA의 왼쪽된 국경 인접 지역에 다른 교배 시키기 하나 전체 T-DNA (그림 4A , 그림 7)의 존재를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
    2. 테스트 튜브에 초순 이온된의 24 µ L에 PCR 제품의 50-100 ng을 희석.
    3. 물 또는 열 블록의 비 커에 5 분 동안 끓는 희석된 PCR 제품을 변성 후 얼음에 직접 냉각.
    4. 얼음에 premade GCT 믹스 녹여 (GCT 믹스: dGTP, dCTP, dTTP (모든 0.5 m m), 임의의 hexamers 43.2 ng / µ L, Acetylated BSA 1.33 mg/mL, β-mercaptoethanol, 0.67 M Hepes, 0.17 m m Tris pH 6.8, 17 m MgCl m의 33 m m).
    5. 21 µ L의 GCT 믹스와 2 U의 Klenow 파편 PCR 제품을 추가 합니다.
    6. [32P] ATP의 2 µ L 믹스에 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
      주의: 모든 단계 [32P] ATP 관련 된 방사성 일 적절 한 보호를 사용 하 여 지정 된 환경에서 실행 될 필요가 있다.
      주: [32P] ATP는 신선한 확인 (하프 타임 1 이상의 통과 했다).
    7. 준비는 Sephadex G-50 (낮음 또는 중간) 열21 (방사성) 합병 되지 않는 뉴클레오티드에서 레이블이 프로브를 정화. 2 mL 주사기 하 고 두꺼운 필터 종이의 작은 동그라미와 콘센트 커버. 주사기에 테에 녹아 있는 Sephadex G-50의 2 개 mL를 추가 하 고 회전 하 여 열에서 모든 액체를 제거.
    8. 열 15 mL 플라스틱 튜브로, 열에 레이블이 프로브 로드 놓고 실내 온도 (750 x g에는 원심 분리기를 설정, 750 x g에이 때까지 증가 rpm를 허용, 중지는 원심 분리기 그리고 0xg 감소 회전 수)에서 스핀을 elute 프로브입니다. 테의 200 µ L 열과 나머지 프로브; elute 스핀에 추가 한 번 반복 합니다. 이러한 조건에서 레이블이 DNA 파편 Sephadex 매트릭스에서 제외 되 고 elute, 자유로운 뉴클레오티드 열에서 남아 있는 동안.
    9. 교 잡 튜브 당 레이블이 프로브의 300 µ L을 사용 합니다. 나머지 레이블된 프로브 나중 사용을 위해-20 ° C에서 유지. 그러나, 명심 [32P] ATP의 30 시간.
  7. DNA 오를 교배합니다
    1. 열 2 x SSC 및 65 ° c.를 교 잡 버퍼 (교 잡 튜브, 튜브 당 2도 말의 최대 당 15 mL) (교 잡 버퍼: dextran 10% 황산, 1 %SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 65 ° C에서 분해,-20 ° C에서 aliquots을 유지).
    2. 전 열 교 잡 오븐 65 ° c
    3. 온수 (65 ° C) 2의 약간 트레이에 나일론 메쉬를 배치 트레이 커버를 x SSC. DNA 면 메쉬 위에 DNA 오를 놓습니다. 오 점 메쉬 함께 롤 하 고 교 잡 튜브에 넣으세요. 부 어 초과 2 x SSC.
    4. Microcentrifuge 튜브에 끓여 연어 정자 DNA의 150 µ L (농도 10 mg/mL) 5 분에 대 한 교 잡 튜브 당 (단계 4.6.3 참조). 얼음에 즉시 냉각 하 고 미리가 열된 교 잡 버퍼에 추가.
    5. 오 점 함께 튜브를 교 잡 버퍼 연어 정자 솔루션을 추가 합니다. 전 12 rpm에 회전 바퀴에 적어도 1 시간에 대 한 65 ° C에서 교배.
    6. 때 사전 인큐베이션 단계 4.7.5에서에서. 거의 완료 되 면, 5 분에 대 한 레이블이 조사의 종 300 µ L (단계 4.6.3 참조)는 부 화 후 오 점에 즉시 추가 하 고.
    7. 63 ° C, 12 rpm에 회전 바퀴에서 하룻밤 교배. 오, 하지만 교 잡 버퍼 연어 정자 솔루션에 직접 프로브를 플라스틱 하지 않습니다.
  8. 워시 오 점.
    1. 세척 솔루션 예 열 (SSPE, 0.1 %SDS 0.1 x 1 x SSPE, 0.1 %SDS) 65 ° c (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 m m NaH2포4, 20 m m EDTA, pH 7.0).
    2. 하이브리드 솔루션을 처분 하 고 1의 약 100-150 mL를 추가 x SSPE, 0.1 %SDS 솔루션 교 잡 튜브, 튜브, 닫고 손으로 회전. 교 잡 및 세척 적절 한 액체 방사성 폐기물에 솔루션을 붓는 다.
    3. 1의 100-150 mL에 대 한 추가 x SSPE, 튜브, 0.1 %SDS 솔루션을 닫고, 회전 바퀴, 12 rpm에에서 63 ° C에서 15 분 동안 튜브를 품 어. 세척 솔루션을 적절 하 게 삭제 합니다.
    4. 0.1의 약 100-150 mL를 추가 x SSPE, 0.1 %SDS 솔루션 교 잡 튜브, 닫고 63 ° C, 12 rpm에서 5 분 동안 튜브를 회전. 세척 솔루션을 적절 하 게 삭제 합니다.
    5. 튜브에서 오 하 고 충분 한 preheated 0.1 x SSPE, 0.1 %SDS, 65 ° c.에 떨고 물 욕조에 3 분에 대 한 동요를 포함 하는 쟁반에 배치 한편, 물으로 채워진 쟁반에 메쉬를 헹 구 십시오.
    6. 오 점을 꺼내, 그것 전 접힌된 플라스틱 (폴 리 에틸렌 튜브) 사이, 신중 하 게 초과 액체를 닦아 놓고 오 점 짧게 건조 하 게 합니다. 참고 액체 phosphorimager 화면을 망칠 것입니다.
    7. 3 개의 측에 플라스틱에서 오 인감. 오 점을 둘러싼 모든 초과 액체를 제거 하 고 4 면 씰링 하 여 플라스틱 튜브를 닫습니다. 플라스틱의 잉여를 잘라. 플라스틱은 외부에 건조 봉인된 오 유출 되지 않습니다 있는지 확인 합니다.
  9. Phosphorimager 화면을 표시 합니다.
    1. Phosphorimager 스크린의 오 점 DNA 측을 직면 하 고 봉인된 오 phosphorimager 카세트에 넣습니다. 카세트를 닫고 ± 2-4 일, 방사성 라벨의 강도와 phosphorimager의 감도 따라 떠나.
    2. 검사는 phosphorimager를 사용 하 여 phosphorimager 화면. 스캔 하기 전에 빛을 가능한 한 작은 화면을 노출 하는 것을 주의. 이미지를 저장 합니다. 밝은 빛에 노출에 의해 신호에서 화면을 지웁니다.
  10. 오 점 분석.
    1. 분석 단계 4.1에서에서 사용 되는 제한 전략에 따라 달라 집니다. 4.1.1.1 (그림 4A) 단계에서 표시 된 전략에 따라 준비 하는 오 점 분석, 감지 하는 조각 수 계산. 이 전략에서 교배 조각 수 T DNA 통합의 수를 나타냅니다.
      1. 왼쪽 (그림 7B)와 T-DNA의 오른쪽 (그림 ℃) 부분에 대 한 조사와 발견 조각 수를 비교 합니다.
        참고: 다른 교배 시킨 조각 수 감지, 다음 (거꾸로 또는 직접 방향 중) 어느 i) 여러 T DNA 복사본 또는 ii) 불완전 하 게 통합 하는 경우 T DNAs은 존재 한다.
      2. 예상 오 점에 교배 조각의 크기 마커 밴드의 크기에 따라 크기가 계산 탠덤 삽입 (그림 4A)의 제한 전략에 따라 예상된 조각으로 교배 파편의 크기를 비교 하 T-DNAs의 가능한 직렬 식 배열을 식별 합니다. 가이드로 그림 4A 를 사용 하 여 예상된 파편의 크기를 계산.
        참고: 교배 파편의 크기 계산 된 것 들과 동의 하지 않을 경우 다음 현재 통합의 가장 가능성이 하나 완전 하지 않습니다.
    2. 4.1.1.2 (그림 4B) 단계에서 표시 된 전략에 따라 준비 하는 오 점 분석, 마커 밴드의 크기에 따라 오 점에 교배 시킨 파편의 크기를 추정 하 고 예상된 크기와 비교. 그대로 삽입 길이가 정의 된 단일 조각을 생성합니다. 예상된 길이의 모든 편차는 불완전 한 통합 (그림 7D)을 나타냅니다.
  11. 다시 교 잡 (옵션)에 대 한 오 점을 제거 합니다.
    참고: 동일한 오 점 수 될 때 교배 연속적으로 다른 프로브. 새로운 조사를 계속 하기 전에 이전 교배 프로브는 오 점에서 스트립.
    1. 프로브는 오 점 제거, DNA-쪽 아래로 오 점 트레이에 놓습니다. 용지함에 0.5 %SDS 잉여를 부 어. 막 2-5 분 끓인 다. 치료 기간은 크기 및 프로브 사용의 GC 내용에 따라 다릅니다. 길고 풍부한 GC 프로브 더 이상 치료를 해야합니다.
    2. 스트립, 후 오 점 다른 프로브, 교배 또는 밀봉 저장 하-20 ° c.에

결과

BIBAC-GW 시스템을 사용 하 여, 식물에서 ODM을 공부 기자 구문이 생성된10했다. 구문을은 게이트웨이 항목 벡터 pENTR gm12 설계 되었고에 pBIBAC-바-GW (그림 1) 게이트웨이 LR 재결합 반응을 사용 하 여 삽입.

애기는 pDM19, BIBAC-바-GW 플라스 변환 정지 codon 위치 120 eYFP 독서 프레임...

토론

생성에 중요 한 제 닉은 transgene의 단일, 그대로 통합으로 사용 되는 이진 벡터의 선택입니다. BIBAC 가족 벡터 많은 식물 종23,,2425,26,,2728관심사의 순서를 전달 하기 위해 사용 되었습니다. BIBAC 벡터, BIBAC-GW를 포함 하 여 높은 효율으로 단일 복사 통합...

공개

저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 네덜란드 기술 재단 STW (12385), 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO)의 부분 이다 고는 부분적으로 경제 통상 부 (OTP 부여 12385 ms)에 의해 자금이 지원 됩니다.  우리는 pCH20, BIBAC-GW 벡터의 등뼈를 제공 하기 위한 캐롤 M. 해밀턴 (코넬 대학, 미국) 감사 합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Kanamycin sulphate monohydrateDuchefaK0126
Gentamycin sulphateDuchefaG0124
RifampicinDuchefaR0146
Tetracycline hydrochlorideSigmaT-3383
DB3.1 competent cellsThermo Scientific - Invitrogen11782-018One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cellsThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
tri-Sodium citrate dihydrateMerck106432
Trizma baseSigma-AldrichT1503
EDTA disodium dihydrateDuchefaE0511
Proteinase KThermo Scientific EO0491
Bacto tryptoneBD211705
Yeast extractBD212750
Sodium chlorideHoneywell Fluka13423
Potassium chlorideMerck104936
D(+)-Glucose monohydrateMerck108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gapBiorad1652089
Electroporator Gene PulserBioRad
Magnesium sulfate heptahydrateCalbiochem442613
D(+)-Maltose monohydrate 90%Acros Organics32991
SucroseSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Skoog mediumDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosinate-ammonium (Basta)Bayer79391781
Restriction enzymesNEB
Ethidium BromideBio-Rad1610433
Electrophoresis systemBio-Rad
Sodium hydroxideMerck106498
Hydrochloric acidMerck100316
Blotting nylon membrane Hybond N+Sigma Aldrich15358or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paperGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acetylated BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-MercaptoethanolMerck805740
Sephadex G-50 CoarseGE Healthcare Life Sciences17004401or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium saltSigma-AldrichD8906
Sodium Dodecyl Sulfate US BiologicalS5010
Salmon Sperm DNASigma-AldrichD7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateMerck106346
Storage Phosphor screen and casetteGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Phosphor imagerGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrosslinkerStratageneStratalinker 1800
cling film (Saran wrap)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Boric acidMerck100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder.MRC HollandMCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladderMRC HollandMCT8080
Hexanucleotide MixRoche11277081001
Large-Construct KitQiagen12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clearvarious providersthe width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter diskMerckVSWP02500
Magnesium chlorideMerck105833
Hybridization meshGE Healthcare Life SciencesRPN2519

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