Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Özet

PBIBAC-GW ikili vektör oluşturma transgenik bitkiler sağlam tek kopya eklemeler, kolay bir süreç ile kolaylaştırır. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik Arabidopsis bitkiler üretme ve bitkiler intactness için sınama işlemi boyunca rehberlik ve ekleme sayısı kopyalamak sunulur.

Özet

Transgenik bitkiler oluştururken, genellikle nesnel bir transgene istikrarlı ifade sahip olmaktır. Çoklu kopya entegrasyonlar kez gen susturmak için tabi olan gibi bu transgene tek, bozulmamış entegrasyonunu gerektirir. Bakteriyel yapay kromozomu (pBIBAC-GW), diğer pBIBAC türevleri gibi temel ağ geçidi uyumlu ikili vektör tek kopya transgenes ekleme ile yüksek verim sağlar. Faiz dizisi şimdi kolayca vektör transfer içine DNA (T-DNA) ağ geçidi klonlama tarafından eklenebilir böylece orijinal pBIBAC bir gelişme, bir ağ geçidi kaset pBIBAC-GW kopyalamış. Yaygın olarak, dönüşüm pBIBAC-GW ile sonuç 0,2-0,5 bir verimlilik %, mademki transgenics yarısı taşımak T-DNA'ın sağlam tek kopya tümleştirme. PBIBAC-GW vektörel çizimler Glufosinate-amonyum direnç veya DsRed floresan seçilmek üzere bitkiler tohum kat olarak ve sefaloridin direnç bakteri içinde bir seçim olarak kullanılabilir. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik bitkiler pBIBAC-GW kullanarak oluşturma işlemi boyunca rehberlik sunulur: faiz dizileri tercih bir dönüşüm tesisi için pBIBAC-GW vektör içine yeniden birleştirme başlatma Agrobacterium, seçim transgenics ve bitkiler DNA kurutma kullanarak ekleme intactness ve kopya sayısı için sınama. Dikkat bir DNA blotting stratejisi tasarlama için tek ve çok kopyayı entegrasyonlar, tekli ve çoklu loci tanımak için verilir.

Giriş

Transgenik bitkiler oluştururken, genellikle nesnel stabil ifade entegre transgene(s) sahip olmaktır. Bu bir transgene sağlam tek kopya entegrasyonlar tarafından sağlanabilir. Birden çok entegrasyonlar bir transgene artan ifade, aynı zamanda gen susturmak için yol açabilir. Eklenen dizileri tandem veya ters tekrarlar^1,2,3,4düzenlenmiştir Eğer transgenes susturmak daha yüksektir. İkili vektörel çizimler mekikler Agrobacteriumiçinde sınırlayıcı olarak kullanılır-faiz dizileri bitki genleri içine sunmak için dönüştürme deneyler aracılı. Tümleştirmeleri bitki genom içine sayısı Agrobacterium tumefaciens^5,6. ikili vektör kopya sayısına bağlıdır Birçok sık kullanılan ikili vektörel çizimler vektör yüksek Kopyala vardır ve bu nedenle yüksek ortalama transgene kopya numarası verim: 3.3-4,9 kopya Arabidopsis⁵.

T-DNA entegrasyonlar sayısı BIBAC⁷gibi veya bir T-DNA A. tumefaciens kromozom⁵başlatarak A. tumefaciensiçinde düşük-kopya numarası olan ikili vektörel çizimler kullanarak indirdi. Ortalama transgene entegrasyonlar bu gibi durumlarda 2^5,8,9,10aşağıda sayısıdır. Olması sebebiyle tek-kopya A. tumefaciens ve aynı zamanda Escherichia coli, BIBAC türevleri korumak ve yapıları 150 kb¹¹büyüklüğünde teslim.

GW-uyumlu BIBAC vektörler^10,12 genler ilgi kolay başlangıç ağ geçidi klonlama kullanarak vektör içine izin verir. Ağ Geçidi teknoloji kullanımı büyük ölçüde kolaylaştırır klonlama yordamı, ama aynı zamanda büyük düşük-kopya-sayı vektörel çizimler^13,14, düşük bir DNA verim ve benzersiz kısıtlama sınırlı bir seçim gibi ile ilgili ortak sorunları üstesinden gelir ^7,11klonlama için kullanılabilir bir bölge. PBIBAC-GW türevleri Glufosinate-amonyum (pBIBAC-BAR-GW) her iki direnç veya DsRed floresan tohum kat (pBIBAC-RFP-GW) seçilmek üzere bitkiler (şekil 1)^10,12olarak mevcuttur. Her iki Vektörler, sefaloridin direnç gen bakteri seçim işaretçisi olarak kullanılır.

PBIBAC-GW vektörel çizimler birleştirmek: (1) kolay tasarım ve E. colive (2) sağlam tek kopya entegrasyonlar planta içinde yüksek verimlilikle genetik manipülasyon. PBIBAC-GW vektörel çizimler verim ortalama 1.7 entegrasyonlar Arabidopsis içinde tek bir taşıyan transgenik bitkiler yaklaşık yarısı üzerinde T-DNA¹⁰entegre.

Kararlı transgenes çoğu transgenics oluşturulan için zorunlu bir ifadesidir. İstikrarlı transgene ifade olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar tarafından elde edilebilir. Transgenik bitkiler olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar taşıyan ile çalışıyor, ancak, örneğin, amaç süreçlerinin verimliliği Kromatin tabanlı, mutagenesis, Rekombinasyon, veya onarım ve bu bağımlılık gibi çalışma için ise daha da önemli süreçleri genomik konumu ve Kromatin yapısı ekleme sitesi. Bizim ilgi için yönetmen Oligonükleotid mutagenesis (ODM) bağımlılığı yerel genomik içeriğine, eğitim için oluşturulan (Şekil 2)¹⁰bir muhabir çizgi kümesi mutagenesis muhabir gen olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar ile oldu. Bu çizgiler kümesi kullanarak, ODM verimliliği transgenik loci rağmen oldukça benzer olarak transgene ifade düzeyleri farklı genomik yerlerde entegre arasında değişir gösterildi.

Protokol

1. ilgi dizisi ikili vektör ekleme

1. Ağ geçidi giriş ve ikili vektörel çizimler hazır olun.
   1. Bir DNA parçası veya tedarikçi öneriler göre Mini hazırlık seti kullanarak ilgi gen içeren ağ geçidi giriş vektör yalıtmak.
      Not: BIBAC-GW vektörel çizimler sefaloridin (Km) seçilmek üzere bakteri, bu nedenle kullanılmasını sağlayın, sefaloridin yerine başka bir direnç marker ile bir giriş vektör kullanın. Örneğin, gentamisin direnci gen taşıyan pENTR-gm vektör iyi seçim¹²' dir.
   2. Yaymak ve ilgi BIBAC-GW vektör yalıtır. Ağ Geçidi kaset içinde mevcut ccdB gen toksisite dayanıklıdır bir E. coli zorlanma kullanın. Kullanarak ayrı tut moduyla BIBAC vektörler protokolleri veya tedarikçi öneriler göre büyük plazmid için özel olarak tasarlanmış kitleri.
2. Bir ağ geçidi tepki taşımak.
   1. LR Rekombinasyon tepkimesi tedarikçi öneriler göre hazırlayın. Aşağıdaki bileşenler, oda sıcaklığında (RT) 1.5 mL microcentrifuge tüp, mix: 100 – 300 ng giriş klon (supercoiled), 300 ng BIBAC-GW vektörünün, LR Clonase reaksiyon arabellek (son konsantrasyonu: 1 x). TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) ile 16 µL karışıma seviyesini ayarlamak. Son olarak, LR Clonase enzim karışımı ve mix 4 µL tarafından vortexing ekleyin. 25 ° C için 1 h karisimin kuluçkaya.
   2. LR tepki İndinavir K çözüm (2 µg/µL) 2 µL ekleyerek 1.2.1 adımda hazırlanan karışıma sonlandırın. Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
3. E. coli elektroporasyon tarafından ağ geçidi tepki karışımı ile dönüşümü.
   1. LR tepki karışımı elektroporasyon önce desalt.
      Not: Bu başarılı elektroporasyon için kritik bir adımdır. Diyaliz açıklanan, ama diğer yöntemler gibi yağış sodyum asetat ile yöntemidir ve etanol de kullanılabilir.
      1. Belgili tanımlık tertibat LR tepki filtre diyaliz için hazırlayın. Ultrasaf deiyonize su 20 mL steril Petri kabına dökün. Bir membran filtre disk yerleştirin (gözenek boyutu 0.025 µm =) su yüzeyinde.
      2. Tüm LR tepki dikkatle membran üstüne pipette ve RT 1 h için diyaliz karışım izin verin.
   2. Elektro-yetkili DH10B hücrelerde bir elektroporasyon küvet (0.1 cm) 5 µL desalted LR karışımı ekleyin. Electroporate hücreler (1,5 V/cm, direnç 200 Ω, kapasite 25 µF) ve hemen 1 mL Önceden ısıtılmış Super Optimal Catabolite baskı (SOC) orta kuluçka 45 dk, 180 rpm için 37 ° C'de ve ardından hücreleri ekleyin. (SOC orta, Bacto tryptone, Maya 5 g 1 l: 20 g özü, NaCl, 0,5 gr 1 m KCl 2.5 mL, 1 m 20 mL filtre sterilize-glikoz).
      Not: DH10B hücreleri stabil büyük plazmid korumak diğer E. coli hücreler için yedek olabilir.
      Not: Optimum elektroporasyon koşulları elektroporasyon ayg bağlıdır.
   3. Cips bakteri 30 için maksimum hızda s bir microcentrifuge kullanarak aşırı SOC kaldırmak ve Pelet yaklaşık 50-100 µL Luria-Bertani (LB) orta içinde resuspend. Sefaloridin-LB (Km-LB) plakaları (Km konsantrasyon, 40 µg/mL) bakteri yaymak ve 37 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya. (LB orta, Bacto tryptone, Maya 5 g 1 l: 10 g özü NaCl 10 g. Katı orta için ekleyin agar, 15 g/L).
4. Recombined BIBAC-GW türevleri tanımlanmasını ve yalıtılmasını plazmid DNA.
   1. Km-LB Tabaklarda büyümek için E. coli hücreleri ccdB sıra ile istenen Ekle yerine recombined BIBAC-GW plazmid içermelidir. Koloni Polimeraz zincir tepkimesi (PCR)¹⁵ bakteri kolonileri tabak BIBAC-GW omurga ve faiz ekleme sahip doğru plazmid içerip içermediklerini denetlemek için kullanın.
      1. PBIBAC-BAR-GW omurga tanımlamak için astar DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 ile PCR¹⁵ reaksiyonu gerçekleştirmek 've DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Bu astar set bar gen 563 bp parçası güçlendirir.
      2. BIBAC-RFP-GW omurga varlığını denetlemek için astar M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 kullanarak bir PCR¹⁵ tepki gerçekleştirmek 've M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Bu astar kombinasyon cruciferin promotor ve rfp sırası örtüşen bir 791 bp parçası güçlendirir.
      3. PCR¹⁵ reaksiyonlar ilgi Ekle varlığı için kontrol etmek için gene özgü primerler kullanılarak gerçekleştirin.
   2. 2-5 ml sefaloridin (40 µg/mL) DNA izolasyon¹⁶içeren LB orta pozitif bir koloni aşılamak. Orbital Çalkalayıcı 180 RPM, 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
   3. Plazmid DNA izole (bkz. Adım 1.1.2).

2. çiçek daldırma, Arabidopsis için A. tumefaciens hazırlanması

1. BIBAC-GW türevleri için A. tumefaciensdönüşümü.
   1. A. tumefaciens zorlanma C58C1 pCH32 taşıyan yardımcı elektro-yetkili hücreleri plazmid⁷hazırlayın. Bakteri varlığında tetrasiklin (5 µg/mL) ve pCH32 için seçin ve yalnızca Agrobacterium hücrelerinin büyümesini sağlamak için Rifampisin (100 µg/mL) büyümek.
   2. Eklemek 0,25-0,5 µg DNA pBIBAC-GW türev önceden çözünmüş 10-20 µL steril ultrasaf deiyonize su, 20 µL yetkili Agrobacterium hücre çoğalmasıyla cuvettes (0.1 cm). Hücreler buz üzerinde tutmak.
   3. Electroporate hücreleri (1,5 V/cm, direnç 400 Ω, kapasite 25 µF). Hemen sonra çoğalmasıyla, 1 mL Önceden ısıtılmış (28 ° C) SOC orta için bakteri ekleyin ve 60-90 dakika 28 ° C'de hücreler kuluçkaya.
   4. 100 µL ve bakteri Rifampisin (100 µg/mL), tetrasiklin (5 µg/mL) ve sefaloridin (40 µg/mL) içeren ayrı LB Tabaklarda kalan yaymak ve karanlıkta 28 ° c için 1-2 gün kuluçkaya.
2. Agrobacterium süspansiyon hazırlamak.
   1. PCR tarafından birkaç adım 2.1.4, doğru vektör varlığı için hazırlanan plaka A. tumefaciens kolonileri kontrol edin (bkz. Adım 1.4.1).
   2. Çizgi (bkz. Adım 2.1.4) antibiyotik içeren bir LB plaka üzerinde uygun eklemek ile ikili vektör içerecek bir koloni doğruladı. 28 ° C'de gecede büyümek.
   3. 2.2.2. adımda elde bir koloni ile çizgiler tekrarlayın.
   4. Bir koloni preculture için antibiyotik (bkz. Adım 2.1.4) ile takıma LC orta 2.5 ml aşılamak. En az 8 h 28 ° C'de veya gecede, 180 RPM kuluçkaya. (LC orta, Bacto tryptone, Maya 5 g 1 l: 10 g özü, 0,5 gram NaCl, 2.5 g MgSO₄ · 7 H₂O, maltoz, 2 g).
   5. Preculture--dan adım 2.2.4 ekleyin. 250 ml LC (bkz. Adım 2.1.4) antibiyotik ile desteklenmiş ve 28 ° c, 180 RPM, gecede büyümek.
   6. Pelet iplik 5.500 x g 12 dakika süreyle de kültüründen yeniden askıya Pelet 100 mL solüsyon içeren % 5 sukroz, %0,05 Silwet L-77, MS. Pour süspansiyon çiçek daldırma için steril bir kap içine x 0.5 bitkiler.

3. Arabidopsis dönüştürme

1. Arabidopsis bitkiler dönüşüm için hazır olun.
   1. Onlar (daldırma başına 9 bitkiler ile her 12 tencere) çiçeklenme kadar sera veya iklim kontrollü büyüme odasında Arabidopsis bitkiler büyümek.
   2. İlk cıvata ortaya daha fazla ikincil cıvata izin vermek için küçük. Bitki bitkiler pek çok olgunlaşmamış çiçek başları ve çok değil varken 4-6 gün sonra kırpma, daldırma için hazır siliques döllenmiş.
2. Çiçek daldırma
   1. 5 – 10 s 2.2.6 adımda hazırlanan Agrobacterium süspansiyon için çiçek daldırma. Nazik ajitasyon kullanın.
   2. Yüksek nem tutmak için sarılmak film bitkilerde birbiri bölümlerini sarın ve bitkiler karanlıkta tutmak için bir kutu ile bitki kapları kapsar. Bitkiler sera/büyüme odasında 2 gün kuluçkaya.
   3. Kutu ve sarılmak film kaldırın ve bitkiler olgunluk bir sera/büyüme odası büyümek.
      Not: dönüşüm verimliliğini artırmak için aynı bitkiler ilk daldırma sonra yeniden daldırma galvaniz 7 gün olabilir.
   4. Tohumlar hasat. Havuz ve tek bir set olarak aynı yapı ile dönüştürülmüş bitkilerin tohum (T1) analiz.
3. Transgenik bitkiler için ekran.
   1. Transgenik bitkiler pBIBAC-RFP-GW türev ile dönüştürülmüş için ekran için Floresans mikroskobu kullanılarak tohum analiz. DsRed ifade tohum kat algılamak için tohumlar bir uyarma 560 nm ve emisyon 600-650 nm görüntü. Floresan tohum floresan sigara karşıtları forseps kullanarak ayırın.
   2. PBIBAC-BAR-GW türev ile dönüştürülmüş transgenik bitkiler için ekran için toprak (~ 2500 tohum/0,1 m²) ile dolu kasetlerine tohumları ekmek. Hatta tohumları tepsileri yayılmasını sağlamak için tohumlar Murashige Skoog orta (MS) x %0.5 0,1 agar askıya ve 1 mL pipet kullanarak Tohum yaymak.
      Not: zaman uyumlu bir şekilde çimlenme için tohum harekete geçirmek için tohumlar 4 ° C'de en az 2 gün kuluçkaya Bu önce veya sonra tohum Ekim yapılabilir.
      1. Fidan % 0.5 Glufosinate-amonyum çözüm 2 hafta ve 3 hafta sonra tepsilerde Ekim ile sprey. 500 mL Glufosinate-amonyak çözeltisi 1 m²başına kullanın.
      2. Hayatta kalan Fideler için bireysel tencere aktarın. Fidan (ikinci) Glufosinate-amonyum işlemden önce ve sonra bir tepsiye tipik bir görüntüsünü şekil 3' te gösterilmektedir.
      3. PCR tarafından Glufosinate amonyum dayanıklı bitkiler faiz yapı varlığı için analiz (bkz. Adım 1.4.1. Astar için).
         1. Genomik bitki DNA PCR Edwards ve ark. tarafından açıklanan yöntemi kullanarak ayrı tut ¹⁷

4. sayı ve güvenilirlik-in T-DNA tümleştirmeleri için Transgenics karakterize

1. Kısıtlama sindirim stratejisi
   Not: enzimleri kullanılarak DNA Blot tarafından T-DNA entegrasyonlar ve kendi bütünlüğünü sayısını belirler. Bu yöntem tek tanıtılmasına olanak sağlar, ancak aynı zamanda entegrasyonlar genom içinde aynı veya farklı loci, tekrarlanan.
   1. Kısıtlama kesimi bir dizi olası farklı entegrasyon biçimlerini belirlemek için kullanın:
      1. Bir kez T-bağımsız olarak dizileri akış yukarı ve aşağı akım sınırlama sitenin (şekil 4A ve Şekil 7A-C) prob edebilmek için DNA ortasında, keser bir enzim seçin. Bkz: şekil 4Ave şekil efsane beklenen sonuçları ve yorumu için.
      2. Bir enzim veya faiz hemen (şekil 4B ve şekil 7A-D) tüm dizi kesme enzimleri birleşimini seçin. Bilinen uzunluğu herhangi bir sapma entegre kaset kesilmesi gösterir.
         Not: yalnızca sitozin metilasyonu için hassas olmayan enzimleri kullanmak için dikkat ediniz.
2. Genomik DNA örnekleri hazırlayın.
   1. Faiz yapı taşıyan bitkilerden genomik DNA izole et. CTAB DNA miniprep yöntem DNA izolasyon¹⁸için kullanılabilir. DNA örneği almak için Arabidopsis DNA analizini leke, 2-2,5 µg genomik DNA'ın gereklidir. DNA'te 50 µL geçiyoruz.
   2. Jel Elektroforez¹⁶tarafından DNA bütünlük denetimi. Sağlam genomik DNA jel üstündeki bir ayrı grup olarak geçirir. DNA bozulma bir smear varlığı kabul edilebilir. Tekrarlanan donma-çözülme nedeniyle DNA hasarı önlemek için genomik DNA örnekleri 4 ° C'de tutulur
   3. Enzim tedarikçi tarafından önerilen arabellek koşul kullanma genomik DNA (2 – 2,5 µg Arabidopsis genomik DNA durumunda) 50 µL, gecede, toplam hacmine sindirmek.
      1. Bir test tüpünde 2-2,5 µg Arabidopsis genomik DNA, 5 µL 10 x kısıtlama arabellek ve 5 U restriksiyon enzimi toplam 50 µL ultrasaf deiyonize suyla karıştırın.
   4. Kısıtlama örnekleri üzerinde bir jel yüklemeden önce yükleme boya (1 son konsantrasyonu x) ekleyin. İyi görsel izleme için aşağıdakilerden birini kullanın: küçük parçaları (Bromophenol mavi, 350-400 bp) ile comigrating veya daha büyük parçaları (Cylene cyanol, 3-4 kbp) ile comigrating.
3. DNA jel çalıştırın.
   1. Bir uzun (20 cm) 0.5 x TBE özel jel¹⁹hazırlayın. Özel jel içinde yüzde beklenen parça boyutlarına bağlıdır. 0,8-%1 en iyi şekilde ayıran parçaları > 1 kb içinde büyüklük. 1-%1,5 özel parçaları için kullanın < 1 kb. Etidyum bromür jöleye eklemeyin. (5 x TBE, Trizma 1 l: 54 g taban, Borik asit, EDTA 3.75 g 27,5 g).
      Not: DNA kirlenmesini önlemek için DNA Plazmid ve PCR fractionate için kullanılmayan kullanım jel tepsileri güçlendirilmiş.
   2. Jel¹⁹örnekleri yükleyin.
   3. Beklenen parçaları boyut aralığında olan jel DNA işaretlerine ekleyin. Yaklaşık 1 µg işaretleyici (50-250 ng farklı ölçekli parçasının) görselleştirme UV ışık tarafından izin jel üzerinde yük.
   4. Alçak gerilim (40-50 V/500 mA), DNA gecede boyutu fractionate.
4. Transfer özel jel DNA'ın naylon membran için hazırlayın.
   1. Jel ayrı bir tepsiye aktarın ve 20-25 dakika içinde 0,5 leke etidyum bromür içeren x TBE (5 µg/mL) tarafından bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de döner.
   2. UV transilluminator üzerinde jel görselleştirin. Genomik DNA görünürlüğünü ayrı uydu bantları (şekil 5A) dahil olmak üzere, boyut ayrılması doğrulayın. Düşük molekül ağırlıklı boyutları doğru bir smear DNA Bozulması gösterir.
   3. UV transilluminator bir şeffaflık jel üzerinde yatıyordu ve bir işaretleyici kalem (şekil 5B) Yuvaları ve marker grup konumunu işaretlemek. Bu işaret dizileri özellikle sonda DNA ile melez değil diye melezleşmiştir parçaları daha sonra boyutunu belirleme kolaylaştıracaktır. Bu adımda marker parçaları belirterek, hybridizing parçaları boyutunu izlemek mümkündür.
   4. Jel tepsisine geri koyun, ultrasaf deiyonize suyla durulayın ve jel içinde DNA fragmentize için 0.25 M HCl 15 dakika içinde daldırın. Ultrasaf deiyonize su ile yıkayın. Yeterince HCl ve su içinde belgili tanımlık tepsi jel kapsayacak şekilde kullanın ve orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de batık jel tepsiye döndürün.
   5. Ultrasaf deiyonize su ile yıkama 30 dakika süreyle denatürasyon arabellekte jel kuluçkaya. İçinde belgili tanımlık tepsi jel karşılamak için yeterli arabellek ve su kullanın ve orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de batık jel tepsiye döndürün. (Denatürasyon arabellek: 0,5 M NaOH, 1.5 M NaCl).
   6. Nötralizasyon arabelleği ultrasaf deiyonize su ile 30 dk. yıkama jeli kuluçkaya. Yeterli arabellek ve su içinde belgili tanımlık tepsi jel kapağı, orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de batık jel tepsiye döndürmek için kullanır. (Nötralizasyon arabellek: 0,5 M Tris, 1.5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
5. DNA bir naylon membran aktarın.
   1. Kapiller genomik DNA transferini Kurulum hazırlığı. Plastik tabak (yaklaşık boyutu jel veya daha büyük) 20 serum sodyum sitrat (SSC) x dolu bir tepsi üzerine getirin. Böylece her ikisi de uçlarından SSC içinde asılı olan kalın filtre kağıt tepsisi katlayın. Pozitif yüklü naylon membran Hybond N + jel ölçekli bir parçası ve 2 adet kalın filtre kağıdı kesti. (20 x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat).
   2. Blotting kurulum (şekil 6) jel, plastik plaka üzerinde filtre kağıdı üstünde aşağı yuvaları yerleştirerek hazırlayın. Hybond n membran üst üzerinde yer filtre kağıdı 2 kat tarafından takip. 20 her katmanda önceden ıslak onları derlemeye eklemeden önce x SSC. Bunlar DNA aktarımı engel olarak katmanlar arasında herhangi bir hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun.
   3. Kağıt mendil kalın bir tabaka ile montaj kapak. Üstüne küçük bir şişe gibi bir ağırlık ile bir plastik tabak koyun. Basınç jel üzerinde eşit olarak bölünür emin olun. Bu DNA'ın uygun transfer sağlayacaktır.
      Not: Ağırlığı yaklaşık 200-300 g olmalıdır; ağır ağırlık DNA aktarımı engel.
   4. 20 x SSC tampon ve naylon membran doğru kılcal kuvvetler hedef buharlaşma önlemek için sarılmak film (şekil 6) ile maruz kalan filtre kağıdı dahil derleme çevreleyen alanı kapsamaktadır. Gecede leke.
   5. Yuvaları, adı ve/veya tarihi membran üstüne konumunu kalemle işaretlemek ve membran montaj kaldırın. Not jel ile temas oldu alt yüzünde DNA taşır.
   6. UV Crosslinker kullanarak DNA UV ışınlama (2400 µJ/m²) tarafından membran için sorunu hemen.
      Not: Crosslinking koşulları kullanılan membran türüne göre değişir.
      Not: Bu noktada membran-20 ° C'de depolanan ve olması için hibridizasyon bir sonda ile daha sonra kullanılan. 2 x SSC ve buna ön-20 ° C'de yerleştirerek önce ısı polietilen boru katlanmış mühür çapraz membran durulama
6. Hibridizasyon için sonda hazırlayın.
   1. DNA PCR²⁰tarafından kurutma için sonda kullanılmak üzere sıra yükseltmek. 50-100 ng 250 bp-2 kbp PCR parçanın bir sonda kullanılır. İki ayrı problar, bir sağ kenarlık proksimal bölge ve diğer T-DNA'ın sol kenarlık proksimal bölgesine hybridizing varlığı tüm T-DNA'ın (şekil 4A ve Şekil 7) değerlendirmek için kullanılabilir.
   2. 50-100 ng tüp bebek ultrasaf deiyonize su 24 µL PCR ürününün sulandırmak.
   3. Su ve ısı bloğunun bir ölçek için 5 dk kaynatılarak seyreltilmiş PCR ürünü tabiatını, sonra doğrudan buz üzerinde serin.
   4. Hazır GCT-mix buz çözme. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (tüm 0,5 mM), rastgele hexamers 43,2 ng/µL, Acetylated BSA 1.33 mg/mL, β-mercaptoethanol, 0.67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6.8, 17 mM MgCl 33 mM).
   5. 21 µL GCT karıştırın ve 2 Klenow U parçası PCR ürünü ekleyin.
   6. [³²P] ATP 2 µL karışıma ekleyin ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
      Dikkat: tüm adımları [³²P] ATP içeren uygun koruma kullanırken radyoaktif çalışma için belirlenmiş bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekir.
      Not: [³²P] ATP taze olduğundan emin olun (fazla 1 yarı zamanlı geçti).
   7. Sephadex G-50 (kaba veya orta) sütun²¹ etiketli sonda gelen adi (radyoaktif) nükleotit arıtma için hazır olun. 2 mL şırınga al ve kalın filtre kağıdı küçük bir daire ile çıkış kapağı. Sephadex G-50 2 mL şırınga TE içinde çözünmüş eklemek ve tüm sıvı iplik tarafından sütundan kaldırın.
   8. Sütun bir 15 mL plastik tüpün içine yerleştirin, sütun etiketli sonda yük ve spin oda sıcaklığında (750 x g santrifüj ayarla, 750 x g ulaşılana kadar artırmak devir/dakika izin ver, sonra santrifüj durdurmak ve 0 x g azalmaya dönüş) elute için sonda. TE 200 µL sütun ve spin kalan sonda elute ekleyin; bir kez yinelenir. Bu koşullarda etiketli DNA parçalarının Sephadex matris hariç tutulur ve ücretsiz nükleotit sütunda kalırken elute.
   9. Etiketli inceleyebilirsek hibridizasyon tüp başına 300 µL kullanın. -20 ° c daha sonra kullanım için kalan etiketli sonda tutun. Ancak, yarı [³²P] ATP göz önünde bulundurun.
7. DNA leke melezlemek.
   1. Isı 2 x SSC ve hibridizasyon tampon (hibridizasyon tüp, tüp başına 2 lekesi, maksimum başına 15 mL) ile 65 ° c (Hibridizasyon arabellek: % 10 dextran sülfat, % 1 SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 65 ° C'de geçiyoruz, aliquots-20 ° C'de tutmak).
   2. Ön ısı hibridizasyon fırın 65 ° C.
   3. Yer naylon mesh içinde biraz ısıtmalı (65 ° C) 2 ile bir tepsi tepsi kapsayacak şekilde x SSC. DNA leke DNA tarafı ile mesh üstüne yerleştirin. Leke mesh ile birlikte rulo ve rulo hibridizasyon tüp içine yerleştirin. Fazla 2 dökmek x SSC.
   4. Microcentrifuge tüp içinde somon Sperm DNA'ın 150 µL kaynatın (konsantrasyonu 10 mg/mL) 5 min için hibridizasyon tüp başına (Ayrıca bkz: adım 4.6.3). Hemen buz üzerinde serin ve Önceden ısıtılmış hibridizasyon arabelleğe eklemek.
   5. Hibridizasyon arabellek-somon Sperm çözüm leke ile tüp ekleyin. 65 ° c en az 1 h 12 rpm'de dönen bir tekerlek için önceden melezlemek.
   6. Ne zaman adım 4.7.5 ön kuluçka. Neredeyse bitti kaynatın 300 µL 5 min için etiketli inceleyebilirsek (Ayrıca bkz: adım 4.6.3) ve hemen sonra kuluçka leke için ekleyin.
   7. Gecede 63 ° c, 12 rpm dönen tekerlek melezlemek. Sondayı doğrudan üzerinde leke ama hibridizasyon arabellek-somon Sperm çözüm içine pipette değil.
8. Leke yıkayın.
   1. Yıkama çözümler Onceden (1 x SSPE, SDS % 0,1 ve 0,1 x SSPE, % 0,1 SDS) ile 65 ° c (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH₂PO₄, 20 mM EDTA, pH 7,0).
   2. Hibridizasyon çözüm atın ve yaklaşık 100-150 mL 1 eklemek x SSPE, % 0,1 SDS çözüm hibridizasyon tüp, tüp kapatın ve el ile döndürün. Hibridizasyon ve uygun sıvı radyoaktif atık çözümde yıkama dökün.
   3. Yaklaşık 100-150 mL 1 eklemek x SSPE, tüp, % 0,1 SDS çözüm kapatın ve tüp dönen tekerlek, 12 rpm 63 ° C'de 15 dakika kuluçkaya. Yıkama çözüm uygun şekilde atın.
   4. Yaklaşık 100-150 mL 0.1 eklemek x SSPE, % 0,1 SDS çözüm hibridizasyon tüp kapatın ve 63 ° c, 12 devir/dakika 5 min için tüp döndürün. Yıkama çözüm uygun şekilde atın.
   5. Tüp dışarı leke alıp yeterli Önceden ısıtılmış 0.1 x SSPE, % 0,1 SDS ve sallamak 3 dk. 65 ° C'de titreyen bir su banyosunda için içeren bir tepsi içinde yerleştirin Bu arada, kafes içinde su ile dolu bir tepsi durulayın.
   6. Leke çıkar, önceden katlanmış plastik (polietilen boru) arasında yer, dikkatle aşırı sıvı temizle ve kısa bir süre kuru blot izin. Sıvı phosphorimager ekran berbat olacak unutmayın.
   7. Leke plastik üç tarafı kapatın. Leke çevreleyen tüm aşırı sıvı kaldırmak ve dördüncü yan mühürleme tarafından plastik tüp kapatın. Plastik fazla kesti. Mühürlü leke değil sızdırıyor ve plastik dışarıdan kuru olduğundan emin olun.
9. Phosphorimager ekran maruz.
   1. Mühürlü leke leke DNA tarafında karşı karşıya phosphorimager ekran ile bir phosphorimager kaset yerleştirin. Kaseti kapatmak ve radyoaktif etiketleme mukavemet ve duyarlılığını phosphorimager bağlı olarak 2-4 gün için ± bırakmak.
   2. Bir phosphorimager kullanarak phosphorimager ekran tarama. Taramadan önce ekran ışık için mümkün olduğu kadar az maruz için dikkat ediniz. Resmi kaydedin. Sinyal ekrandan parlak ışığa açarak silmek.
10. Leke analiz.
    1. 4.1. adımda kullanılan kısıtlama strateji analiz bağlıdır. 4.1.1.1 (şekil 4A) adımda gösterilen strateji göre hazırlanan leke analiz ederken tespit parçaları sayar. Bu strateji, melezleşmiştir parça sayısı T-DNA entegrasyonlar sayısını ifade eder.
       1. Bir sonda soldaki (şekil 7B) ve T-DNA doğru (şekil 7C) parçası ile tespit parça sayısı karşılaştırın.
          Not: Eğer farklı bir hybridizing parça sayısı tespit, sonra her iki i) birden çok T-DNA kopya (ya doğrudan ya da ters yönde) veya II) eksik olarak entegre T-DNA'lar mevcut.
       2. Leke melezleşmiştir parçaları boyutlarda marker bantları boyutuna göre ve melezleşmiştir parçaları ile tandem eklemeleri (şekil 4A) kısıtlama stratejisinin temel boyutları hesaplanmasına beklenen parçası boyutunu karşılaştırmak tahmin T-DNA'lar düzenlenmesi mümkün tandem tanımlayın. Şekil 4A beklenen parçaları boyutunu hesaplamak için bir kılavuz olarak kullanın.
          Not: melezleşmiştir parçaları boyutunu hesaplanan olanlarla kabul sonra mevcut entegrasyonlar olasılıkla biri tamamlanmış değil.
    2. 4.1.1.2 (şekil 4B) adımda gösterilen strateji göre hazırlanan leke analiz ederken, işaretleyici bantları boyutuna göre leke üzerinde hybridizing parçası boyutunu tahmin etmek ve beklenen boyutu ile karşılaştırın. Sağlam bir ekleme ile tanımlanmış bir uzunluğu tek bir parça verir. Herhangi bir sapma beklenen uzunlukta eksik Tümleştirme (Şekil 7 d) gösterir.
11. Şerit leke için yeniden hibridizasyon (isteğe bağlı).
    Not: Aynı leke arka arkaya farklı probları ile melezleşmiştir. Yeni bir sonda ile devam etmeden önce bir önceki melezleşmiştir sonda gelen leke şerit.
    1. Sonda leke kaldırmak için leke bir tepsi içinde onun DNA-yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. % 0.5 SDS bir fazlalık tepsiye dökün. Membran 2-5 dakika kaynatın. Tedavi süresi boyutu ve GC-kullanılan sonda içeriğine bağlıdır. Daha uzun ve daha zengin GC probları daha uzun bir tedavi gerekir.
    2. Sıyırma sonra başka bir sonda ile leke melezlemek veya mühür ve -20 ° C'de depolayın

Sonuçlar

BIBAC-GW sistemiyle, muhabir yapıları ODM bitkilerde eğitim için oluşturulan¹⁰vardı. Yapıları içinde ağ geçidi giriş vektör pENTR-gm¹² tasarlanmış ve pBIBAC-BAR-ağ geçidi LR Rekombinasyon tepkimesi kullanarak GW (şekil 1) eklenir.

Arabidopsis pDM19, BIBAC-BAR-GW plazmid translasyonel kodonu pozisyonda 120 eYFP okuma çerçevesi içind...

Tartışmalar

Üreten transgenics bir transgene tek, bozulmamış entegrasyonlar ile kullanılan ikili vektör seçimi çok önemlidir. BIBAC aile vektörel çizimler dizileri çıkarlarının birçok bitki türü²³için^{,24,25,26,27,28}teslim etmek için kullanılmaktadır. BIBAC Vektörler, BIBAC-GW, dahil olmak üzere verim tek kopya ente...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kanamycin sulphate monohydrate	Duchefa	K0126
Gentamycin sulphate	Duchefa	G0124
Rifampicin	Duchefa	R0146
Tetracycline hydrochloride	Sigma	T-3383
DB3.1 competent cells	Thermo Scientific - Invitrogen	11782-018	One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead
DH10B competent cells	Thermo Scientific - Invitrogen	18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix	Thermo Scientific - Invitrogen	11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate	Merck	106432
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
EDTA disodium dihydrate	Duchefa	E0511
Proteinase K	Thermo Scientific	EO0491
Bacto tryptone	BD	211705
Yeast extract	BD	212750
Sodium chloride	Honeywell Fluka	13423
Potassium chloride	Merck	104936
D(+)-Glucose monohydrate	Merck	108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap	Biorad	1652089
Electroporator Gene Pulser	BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate	Calbiochem	442613
D(+)-Maltose monohydrate 90%	Acros Organics	32991
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Silwet L-77	Fisher Scientific	NC0138454
Murashige Skoog medium	Duchefa	M0221
Agar	BD	214010
Glufosinate-ammonium (Basta)	Bayer	79391781
Restriction enzymes	NEB
Ethidium Bromide	Bio-Rad	1610433
Electrophoresis system	Bio-Rad
Sodium hydroxide	Merck	106498
Hydrochloric acid	Merck	100316
Blotting nylon membrane Hybond N+	Sigma Aldrich	15358	or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper	GE Healthcare Life Sciences	3030-931
dNTP	Thermo Fisher	R0181
Acetylated BSA	Sigma-Aldrich	B2518
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
2-Mercaptoethanol	Merck	805740
Sephadex G-50 Coarse	GE Healthcare Life Sciences	17004401	or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Sodium Dodecyl Sulfate	US Biological	S5010
Salmon Sperm DNA	Sigma-Aldrich	D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Storage Phosphor screen and casette	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-74
Phosphor imager	GE Healthcare Life Sciences	Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker	Stratagene	Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap)	Omnilabo	1090681
Agarose	Thermo Scientific - Invitrogen	16500
Boric acid	Merck	100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder.	MRC Holland	MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder	MRC Holland	MCT8080
Hexanucleotide Mix	Roche	11277081001
Large-Construct Kit	Qiagen	12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear	various providers		the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk	Merck	VSWP02500
Magnesium chloride	Merck	105833
Hybridization mesh	GE Healthcare Life Sciences	RPN2519