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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Utilizzando un vettore binario pBIBAC-GW rende generando piante transgeniche con inserimenti di singola copia intatti, un processo facile. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche di Arabidopsis e prova le piante per integrità e copiare il numero degli inserti.

Abstract

Durante la generazione di piante transgeniche, generalmente l'obiettivo è di avere espressione stabile di un transgene. Questo richiede una singola, intatta l'integrazione del transgene, come multi-copia integrazioni sono spesso sottoposti al silenziamento genico. Il vettore binario compatibile con Gateway basato su cromosomi artificiali batterici (pBIBAC-GW), come altri derivati pBIBAC, permette l'inserimento di transgeni copia singola con alta efficienza. Come un miglioramento per il pBIBAC originale, una cassetta di Gateway è stata clonata in pBIBAC-GW, così che le sequenze di interesse possono ora essere facilmente incorporate nel transfer vettoriale DNA (T-DNA) mediante la clonazione di Gateway. Comunemente, la trasformazione con pBIBAC-GW si traduce in un'efficienza pari a 0,2 – 0,5%, per cui la metà della transgenetica trasportare un'integrazione di singola copia intatta del T-DNA. I vettori di pBIBAC-GW sono disponibili con resistenza al glufosinato-ammonio o DsRed fluorescenza in cappotti di seme per la selezione di piante e con resistenza alla kanamicina come una selezione nei batteri. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche utilizzando pBIBAC-GW: a partire da ricombinando le sequenze di interesse nel vettore pBIBAC-GW di scelta, di piantare trasformazione con Agrobacterium, selezione della transgenetica e prova le piante per integrità e copia il numero degli inserti utilizzando DNA macchiare. Attenzione viene data alla progettazione di una strategia di blotting di DNA riconoscere single - e multi - copia integrazioni ai loci singoli e multipli.

Introduzione

Durante la generazione di piante transgeniche, solitamente l'obiettivo è di avere il transgene(s) integrato stabilmente espressa. Questo può essere ottenuto integrazioni intatto copia singola di un transgene. Più integrazioni possono portare all'espressione aumentata di un transgene, ma anche al silenziamento genico. Silenziamento dei transgeni è più probabile se sequenze inserite sono disposti in tandem o ripetizioni invertito1,2,3,4. Vettori binari vengono utilizzati come navette in Agrobacterium-mediata esperimenti di trasformazione per consegnare le sequenze di interesse in genomi delle piante. Il numero di integrazioni in un genoma della pianta è dipenda dal numero di copia del vettore binario in Agrobacterium tumefaciens5,6. Molti vettori binari comunemente utilizzati sono vettori di alta copia e pertanto generare un numero di copie del transgene medio alta: 3.3-4.9 copie in Arabidopsis5.

Il numero delle integrazioni T-DNA può essere abbassato utilizzando vettori binari che hanno un numero di basso-copia di a. tumefaciens, ad esempio BIBAC7, o con il lancio di un T-DNA a. tumefaciens del cromosoma5. Il numero medio di integrazioni del transgene in tali casi è inferiore a 25,8,9,10. A causa di essere copia singola in a. tumefaciens e anche in Escherichia coli, BIBAC-derivati possono mantenere e consegnare costrutti grande come 150 kb11.

GW-compatibile BIBAC vettori10,12 permetterne la facile introduzione di geni di interesse nel vettore utilizzando Gateway clonazione. L'uso della tecnologia Gateway semplifica notevolmente la procedura di clonazione, ma supera anche i problemi più comuni associati con grandi vettori low-copy-number13,14, come un basso rendimento del DNA e una selezione limitata di unica restrizione siti disponibili per la clonazione7,11. I derivati di pBIBAC-GW sono disponibili con una resistenza al glufosinato-ammonio (pBIBAC-BAR-GW) o DsRed fluorescenza in tegumenti (pBIBAC-RFP-GW) per la selezione di piante (Figura 1)10,12. Per entrambi i vettori, un gene di resistenza alla kanamicina viene utilizzato come indicatore di selezione nei batteri.

Combinano i vettori pBIBAC-GW: (1) facile progettazione e manipolazione genetica in e. colie (2) intatto copia singola integrazioni in planta ad alta efficienza. Il rendimento dei vettori pBIBAC-GW integrazioni media 1.7 in Arabidopsis con circa la metà delle piante transgeniche che trasportano un singolo integrato T-DNA10.

Stabile espressione dei transgeni è un requisito per la maggior parte transgenetica generato. L'espressione del transgene stabile può essere ottenuta integrazioni intatti, singola copia. Lavorare con piante transgeniche che trasportano integrazioni intatti, copia singola è, tuttavia, ancora più importante se, ad esempio, lo scopo è lo studio dell'efficienza dei processi basati su cromatina, come mutagenesi, ricombinazione, o la riparazione e la dipendenza di questi processi sulla posizione genomica e struttura della cromatina, al sito di inserimento. Per il nostro interesse, per studiare la dipendenza di mutagenesi oligonucleotide diretto (ODM) sul contesto locale di genomico, un insieme di linee di reporter con integrazioni intatti, singola copia di un gene del reporter di mutagenesi era generato (Figura 2)10. Utilizzando questo set di righe, è stato dimostrato che l'efficienza ODM varia tra i loci transgenici integrati in differenti luoghi genomic, nonostante i livelli di espressione del transgene essendo piuttosto simile.

Protocollo

1. inserimento di sequenze di interesse in vettore binario

  1. Preparare i vettori binari e voce Gateway.
    1. Isolare il vettore di voce Gateway che contiene un frammento di DNA o il gene di interesse utilizzando un kit di mini-preparazione secondo i suggerimenti del fornitore.
      Nota: BIBAC-GW vettori richiedono l'uso di kanamicina (Km) per la selezione nei batteri, quindi, utilizza un vettore di ingresso con un altro indicatore di resistenza invece di kanamicina. Per esempio, il vettore pENTR-gm, portatrice di un gene di resistenza della gentamicina, è una buona scelta di12.
    2. Propagare e isolare il vettore BIBAC-GW di interesse. Utilizzare un ceppo di e. coli che è resistente alla tossicità del gene ccdB presente all'interno della cassetta di Gateway. BIBAC-vettori isolare utilizzando protocolli o kit specificamente progettato per grandi plasmidi secondo i suggerimenti del fornitore.
  2. Eseguire una reazione di Gateway.
    1. Preparare la reazione di ricombinazione LR secondo i suggerimenti del fornitore. Miscelare i componenti seguenti in una microcentrifuga da 1,5 mL a temperatura ambiente (TA): 100 – 300 ng clone di voce (supercoiled), 300 ng di BIBAC-GW vector, LR Clonase tampone di reazione (concentrazione finale: 1x). Regolare il volume della miscela a 16 µ l con TE (10 mM Tris, 1 mM di EDTA, pH 8.0). Infine, aggiungere 4 µ l di mix di enzima LR Clonase e mescolare nel Vortex. Incubare la miscela a 25 ° C per 1 h.
    2. Terminare la reazione di LR aggiungendo 2 µ l di soluzione di proteinasi K (2 µ g / µ l) per la miscela preparata al punto 1.2.1. Mescolare e incubare a 37 ° C per 10 min.
  3. Trasformare e. coli con la miscela di reazione di Gateway mediante elettroporazione.
    1. Dissalare la miscela di reazione LR prima di elettroporazione.
      Nota: Questo passaggio è fondamentale per il successo elettroporazione. Sotto una dialisi metodo è descritti, ma altri metodi come precipitazione con l'acetato del sodio e dell'etanolo può essere utilizzato anche.
      1. Preparare l'installazione per dialisi filtro della reazione LR. Versare 20 mL di acqua deionizzata ultrapura in una capsula di Petri sterile. Inserire un disco di filtro di membrana (dimensione dei pori = 0,025 µm) sulla superficie dell'acqua.
      2. Pipettare l'intera reazione LR attentamente sopra la membrana e lasciare che la miscela di Dializzare a temperatura ambiente per 1 h.
    2. Aggiungere 5 µ l di mix LR dissalate a cellule DH10B electro-competenti in una cuvetta di elettroporazione (0,1 cm). Electroporate le cellule (1.5 V/cm, resistenza 200 Ω, capacità 25 µF) e immediatamente aggiungere 1 mL di terreno di repressione (SOC) preriscaldata Super ottimale dei cataboliti alle celle, seguite da incubazione a 37 ° C per 45 min, 180 giri/min. (Mezzo di SOC, 1 l: 20 g di Bacto triptone, 5 g di lievito estratto, 0,5 g di NaCl, 2,5 mL di KCl 1M, 20 mL di 1 M filtro-sterilizzato del glucosio).
      Nota: Le cellule DH10B possono essere sostituite per altre cellule di Escherichia coli che mantengono stabile grandi plasmidi.
      Nota: Le condizioni ottimali di elettroporazione sono dipendente l'elettroporazione dispositivo utilizzato.
    3. A pellet batteri alla massima velocità per 30 s utilizzando una microcentrifuga, rimuovere l'eccesso SOC e risospendere il pellet in circa 50-100 µ l di terreno di Luria-Bertani (LB). Diffondere i batteri sui piatti di kanamicina-LB (Km-LB) (concentrazione Km, 40 µ g/mL) e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. (Mezzo LB, 1 l: 10 g di Bacto triptone, 5 g di lievito estratto, 10 g di NaCl. Per mezzo solido aggiungere agar, 15 g/L).
  4. Identificare i derivati BIBAC-GW ricombinati e isolare il DNA del plasmide.
    1. Per essere in grado di crescere su piastre Km-LB, le cellule di e. coli dovrebbero contenere il plasmide BIBAC-GW ricombinato in cui la sequenza di ccdB viene sostituita con l'inserto desiderato. Utilizzare Colonia Polymerase Chain Reaction (PCR)15 per verificare se le colonie di batteri sulla piastra contengono i plasmidi corretti, avendo la spina dorsale BIBAC-GW e l'inserto di interesse.
      1. Per identificare la spina dorsale pBIBAC-BAR-GW, eseguire una reazione di15 PCR con primer DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'e DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Questo set di primer amplifica un frammento di bp 563 del gene bar .
      2. Per verificare la presenza della dorsale BIBAC-RFP-GW, eseguire una reazione di15 PCR, utilizzando primer M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'e M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Questa combinazione di primer amplifica un frammento di bp 791 sovrapposizione la sequenza del promotore e rfp cruciferin.
      3. Eseguire reazioni di15 PCR utilizzando primers gene-specifico per verificare la presenza dell'inserto di interesse.
    2. Inoculare una singola Colonia positiva in 2 – 5 mL di terreno LB contenente kanamicina (40 µ g/mL) per isolamento di DNA16. Incubare a 37 ° C su agitatore orbitale a 180 giri/min, per una notte.
    3. Isolare il DNA del plasmide (Vedi punto 1.1.2).

2. preparazione di a. tumefaciens per immersione floreale di Arabidopsis

  1. Trasformare BIBAC-GW derivati di a. tumefaciens.
    1. Preparare cellule electro-competente di a. tumefaciens helper di ceppo C58C1 che trasportano il pCH32 plasmide7. Crescere i batteri in presenza di tetraciclina (5 µ g/mL) e rifampicina (100 µ g/mL) per selezionare per pCH32 e garantire la crescita delle cellule di Agrobacterium solo.
    2. Aggiungere 0,25-0,5 µ g di DNA di un derivato di pBIBAC-GW, pre-disciolto in 10-20 µ l sterile deionizzata acqua ultrapura, a 20 µ l competente Agrobacterium celle in cuvette di elettroporazione (0,1 cm). Mantenere le cellule sul ghiaccio.
    3. Electroporate le cellule (1.5 V/cm, resistenza 400 Ω, capacità 25 µF). Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere 1 mL di terreno di SOC pre-riscaldata (28 ° C) per i batteri e incubare le cellule a 28 ° C per 60-90 min.
    4. Diffusione di 100 µ l e il resto dei batteri su piastre LB separate contenenti rifampicina (100 µ g/mL), tetraciclina (5 µ g/mL) e kanamicina (40 µ g/mL) e incubare al buio a 28 ° C per 1-2 giorni.
  2. Preparare la sospensione di Agrobacterium .
    1. Verifica mediante PCR un paio delle colonie a. tumefaciens dalla piastra preparata al punto 2.1.4, per la presenza del vettore corretta (Vedi punto 1.4.1).
    2. Striscia una singola Colonia confermata per contenere il vettore binario con l'inserto appropriato su una piastra di LB contenenti antibiotici (Vedi punto 2.1.4). Crescere a 28 ° C durante la notte.
    3. Ripetere le meches con una singola Colonia ottenuta al punto 2.2.2.
    4. Inoculare una singola Colonia in 2,5 mL di medium di LC completate con gli antibiotici (Vedi punto 2.1.4) per coltura. Mantenere in incubazione a 28 ° C per almeno 8 h o durante la notte, a 180 giri/min. (Mezzo di LC, 1 l: 10 g di Bacto triptone, 5 g di lievito estratto, 0,5 g di NaCl, 2,5 g di MgSO4 · 7 H2O, 2 g di maltosio).
    5. Aggiungere la coltura dal punto 2.2.4. a 250 mL LC completati con antibiotici (Vedi punto 2.1.4) e crescere a 28 ° C, a 180 giri/min, durante la notte.
    6. Pellet la cultura di filatura a 5.500 x g per 12 min. Risospendere il pellet in 100 mL di soluzione contenente il 5% di saccarosio, 0.05% del Silwet L-77, 0,5 x ms Pour la sospensione in un contenitore sterile per immersione floreale delle piante.

3. Arabidopsis trasformazione

  1. Preparare le piante di Arabidopsis per trasformazione.
    1. Coltivare le piante di Arabidopsis in una camera di crescita controllata di serra o clima fino a quando essi stanno fiorendo (12 pentole con 9 piante ogni per immersione).
    2. Agganciare i primi spit per consentire più bulloni secondarie ad emergere. Piante sono pronte per immersione 4 – 6 giorni dopo il taglio, quando le piante hanno molti capolini immaturi e non molti fertilizzato silique.
  2. Floreale di immersione
    1. Immergere le infiorescenze per 5 – 10 s in Agrobacterium sospensione preparata al punto 2.2.6. Utilizzare movimentazione delicata.
    2. Avvolgere le parti fuori terra delle piante nella pellicola trasparente per mantenere alta l'umidità e coprire i vasi della pianta con una scatola per mantenere le piante al buio. Incubare le piante per 2 giorni in una camera di crescita/serra.
    3. Smontare il box e la pellicola trasparente e coltivare le piante alla maturità in una camera di serra/crescita.
      Nota: Per aumentare l'efficienza di trasformazione, le stesse piante possono essere ri-tuffati 7 giorni dopo la prima immersione.
    4. Raccogliere i semi. Piscina e analizzare i semi (T1) di piante, trasformati con lo stesso costrutto, come un unico insieme.
  3. Schermo per piante transgeniche.
    1. Per schermare per piante transgeniche, trasformati con un derivato di pBIBAC-RFP-GW, analizzare i semi utilizzando la microscopia a fluorescenza. Al fine di rilevare DsRed espressione nei tegumenti, immagine i semi a un'eccitazione di 560 nm e l'emissione di 600-650 nm. Separare i semi fluorescenti dalle controparti non fluorescente usando il forcipe.
    2. Per schermare per piante transgeniche, trasformati con un derivato di pBIBAC-BAR-GW, seminare i semi in vassoi riempiti con terreno (~ 2.500 semi/0,1 m2). Per garantire una diffusione anche di semi sopra vassoi, sospendere semi in 0,1% agar in 0,5 x Murashige Skoog medio (MS) e spargere i semi utilizzando una pipetta da 1 mL.
      Nota: Per stimolare i semi di germinare in modo sincrono, incubare i semi per almeno 2 giorni a 4 ° C. Questo può essere fatto prima o dopo la semina i semi.
      1. Spruzzare i semenzali con soluzione di glufosinato-ammonio 0,5% 2 settimane e 3 settimane dopo la semina in vassoi. Uso 500 mL di soluzione di glufosinato-ammonio per 1 m2.
      2. Trasferimento superstite piantine in singoli vasi. Una tipica immagine di un vassoio con piantine prima e dopo trattamento di glufosinato-ammonio (seconda) sono mostrati nella Figura 3.
      3. Analizzare le piante glufosinato-ammonio-resistente di PCR per la presenza del costrutto di interesse (vedere il punto 1.4.1. per primer).
        1. Isolare il DNA genomico vegetale per PCR usando il metodo descritto da Edwards et al. 17

4. caratterizzazione transgenetica per il numero e l'integrità delle integrazioni T-DNA

  1. Strategia di digestioni di restrizione
    Nota: Determinare il numero di integrazioni T-DNA e della loro integrità dal DNA macchiare usando gli enzimi di restrizione. Questo metodo permette di identificare singoli, ma anche ripetute integrazioni ai loci uguali o diversi nel genoma.
    1. Utilizzare una serie di digestioni di restrizione per identificare i modelli di integrazione di diversi possibili:
      1. Selezionare un enzima che taglia una volta in mezzo il T-DNA, per essere in grado di sondare in modo indipendente sequenze a Monte e a valle del sito di restrizione (Figura 4A e Figura 7A-C). Vedi Figura 4Ae la leggenda di figura per i risultati attesi e l'interpretazione.
      2. Selezionare un enzima o una combinazione di enzimi tagliando fuori l'intera sequenza di interesse in una sola volta (Figura 4B e figura 7A-D). Ogni deviazione dalla lunghezza della nota indica troncamento della cassetta integrata.
        Nota: fare attenzione a utilizzare solo gli enzimi di restrizione che non sono sensibili alla metilazione della citosina.
  2. Preparare i campioni di DNA genomici.
    1. Isolare il DNA genomico da piante che trasportano il costrutto di interesse. Un metodo di miniprep CTAB DNA può essere utilizzato per isolamento di DNA18. Per DNA analisi di Arabidopsis DNA della macchia, 2 – 2,5 µ g di DNA genomic è necessaria. Sciogliere il DNA in 50 µ l di TE.
    2. Verificare l'integrità del DNA da gel di elettroforesi16. DNA genomico intatto migra come una discreta banda nella parte superiore del gel. Degradazione del DNA può essere riconosciuta come la presenza di una sbavatura. Per evitare il danno del DNA a causa di ripetuti di congelamento-scongelamento, campioni di DNA genomico sono conservati a 4 ° C.
    3. Digerire il DNA genomico (2 – 2,5 µ g nel caso di DNA genomic Arabidopsis ) in un volume totale di 50 µ l, durante la notte, utilizzando condizioni di buffer suggerite dal fornitore degli enzimi.
      1. In una provetta, mescolare 2 – 2,5 µ g di DNA genomico di Arabidopsis , buffer di restrizione di 5 µ l x 10 e 5 U enzima di restrizione in un totale di acqua deionizzata ultrapura di 50 µ l.
    4. Aggiungere colorante di caricamento (1 x concentrazione finale) ai campioni prima di caricarle su un gel di restrizione. Per una buona visibilità, utilizzare uno dei seguenti: comigrating con piccoli frammenti (blu di bromofenolo, 350 – 400 bp), o comigrating con frammenti più grandi (Cylene cianolo, kbp 3 – 4).
  3. Esegua il gel del DNA.
    1. Preparare una lunga (20 cm) 0.5 x TBE gel dell'agarosi,19. La percentuale di agarosio nel gel varia a seconda le dimensioni del frammento prevede. 0,8 – 1% in modo ottimale separa frammenti > 1 kb in dimensione. Utilizzare 1 – 1,5% di agarosio per frammenti < 1 kb. Non aggiungere il bromuro di etidio al gel. (5x TBE, 1 l: 54 g di Trizma base, 27,5 g di acido borico, 3,75 g di EDTA).
      Nota: Per evitare la contaminazione del DNA, uso gel vassoi che non sono abituati a frazionare plasmide e PCR amplificato il DNA.
    2. Caricare i campioni su gel19.
    3. Aggiungere marcatori del DNA per il gel che sono nella gamma di dimensioni dei frammenti previsti. Caricare circa 1 µ g di marcatore (50-250 ng del frammento di dimensione diverse) sul gel per permettere la visualizzazione da luce UV.
    4. Dimensioni-frazionare il DNA a bassa tensione (40 – 50 V/500 mA) durante la notte.
  4. Preparare per il trasferimento del DNA dal gel dell'agarosi per la membrana di nylon.
    1. Trasferire il gel su un vassoio separato e macchiarlo per 20 – 25 min in 0,5 x TBE contenente etidio bromuro (5 µ g/mL) ruotando a 40 giri su agitatore orbitale.
    2. Visualizzare il gel su un transilluminatore UV. Verificare la separazione di dimensione del DNA genomic, inclusa la visibilità delle bande satellitare discreti (Figura 5A). Uno striscio verso dimensioni di peso molecolare inferiore indica la degradazione del DNA.
    3. Sul transilluminatore UV, ponga una trasparenza sopra il gel e segnare la posizione delle fessure e le bande dell'indicatore con un pennarello (figura 5B). Questo faciliterà nel caso in cui le sequenze di marcatore non ibridato specificamente con la sonda del DNA per determinare le dimensioni dei frammenti ibridizzati più tardi. Indicando i frammenti di marcatore a questo punto, è possibile monitorare la dimensione dei frammenti ibridazione.
    4. Inserire il gel nel vassoio, risciacquare con acqua deionizzata ultrapura e immergerlo in 0,25 M HCl per 15 min a frammentano il DNA all'interno del gel. Lavare con acqua deionizzata ultrapura. Utilizzare HCl e acqua sufficiente a coprire il gel nel vassoio e ruotare il vassoio con il gel sommerso a 40 giri su agitatore orbitale.
    5. Incubare il gel in tampone di denaturazione per 30 min. lavare con acqua deionizzata ultrapura. Utilizzare buffer e acqua sufficiente a coprire il gel nel vassoio e ruotare il vassoio con il gel sommerso a 40 giri su agitatore orbitale. (Tampone di denaturazione: 0,5 M NaOH, 1.5 M NaCl).
    6. Incubare il gel in tampone di neutralizzazione per 30 min. lavare con acqua deionizzata ultrapura. Utilizzare buffer e acqua sufficiente a coprire il gel nel vassoio, ruotare il vassoio con gel sommerso a 40 giri su agitatore orbitale. (Tampone di neutralizzazione: 0.5 M Tris, 1.5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Trasferire il DNA di una membrana di nylon.
    1. Preparare l'installazione per trasferimento capillare del DNA genomic. Posizionare un piatto di plastica (circa la dimensione del gel o più grande) sopra un vassoio riempito con soluzione fisiologica-sodio citrato (SSC): 20x. Piegare un pezzo di carta spessa di filtro sopra il vassoio, in modo che entrambe le estremità sono appesi in SSC. Tagliare un pezzo di membrana di nylon caricato positivamente Hybond N + gel di dimensioni medie e 2 pezzi di spessa carta da filtro. (20x SSC: 3 M NaCl, citrato di sodio 0,3 M).
    2. Preparare l'installazione macchiante (Figura 6) inserendo il gel, slot giù sulla parte superiore della carta da filtro sulla piastra di plastica. Adagiarvi una membrana Hybond n +, seguito da 2 strati di carta filtrante. Pre-bagnato ogni strato in 20 x SSC prima di aggiungerli all'Assemblea. Assicurarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria tra strati come questi ostacolano il trasferimento di DNA.
    3. Coprire l'assembly con uno spesso strato di carta velina. Posto una piastra di plastica con un peso, come una piccola bottiglia, sulla parte superiore. Assicurarsi che la pressione è equamente diviso sopra il gel. Questo assicurerà il corretto trasferimento del DNA.
      Nota: Il peso dovrebbe essere circa 200 – 300 g; i pesi pesanti ostacolano il trasferimento di DNA.
    4. Coprire l'area che circonda l'Assemblea, tra cui esposta carta da filtro, con la pellicola trasparente (Figura 6) per evitare l'evaporazione del 20 x SSC buffer e destinazione che capillare forze verso la membrana di nylon. Asciugare durante la notte.
    5. Segnare la posizione delle slot, il nome e/o la data in cima la membrana con la matita e rimuovere la membrana dall'assembly. Si noti che il lato di fondo che è stato a contatto con il gel, trasporta il DNA.
    6. Risolvere immediatamente il DNA alla membrana di irradiazione UV (2.400 µ j/m2) utilizzando un reticolante UV.
      Nota: Condizioni di reticolazione dipendono dal tipo di membrana utilizzata.
      Nota: A questo punto la membrana può essere conservata a-20 ° C e utilizzata per l'ibridazione con una sonda più tardi. Risciacquare la membrana reticolata in 2X SSC e guarnizione in esso pre-piegato la tubazione del polietilene saldabili prima di posizionarlo a-20 ° C.
  6. Preparare la sonda per l'ibridazione.
    1. Amplificare la sequenza da utilizzare come la sonda per DNA macchiarsi di PCR20. 50-100 ng di un frammento PCR 250 bp-2 kbp è usata come una sonda. Due sonde separate, una ibridazione della regione prossimale del bordo destro e l'altro nella regione prossimale del bordo sinistro del T-DNA, possono essere utilizzati per valutare la presenza del T-DNA intero (Figura 4A e Figura 7).
    2. Diluire 50-100 ng di prodotto di PCR a 24 µ l di acqua deionizzata ultrapura in una provetta.
    3. Denaturare il prodotto PCR diluito facendo bollire per 5 min in un bicchiere di acqua o termoblocco, poi raffreddare direttamente sul ghiaccio.
    4. Scongelare i premade GCT-mix sul ghiaccio. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (tutti 0,5 mM), random esameri 43,2 ng / µ l, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM di β-mercaptoetanolo, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris-HCl pH 6.8, 17 mM MgCl).
    5. Aggiungere 21 µ l del GCT-mix e 2 U di Klenow frammento il prodotto PCR.
    6. Aggiungere 2 µ l di [32P] ATP per il mix e incubare a 37 ° C per 1 h.
      Attenzione: Tutti i passaggi che coinvolgono [32P] ATP devono essere svolte in un ambiente designato per lavoro radioattivo durante l'utilizzo di una protezione adeguata.
      Nota: Assicurarsi che l'ATP [32P] è fresco (non più di 1 intervallo ha superato).
    7. Preparare un G-50 di Sephadex (grossolana o media) colonna21 per purificare il probe marcato da nucleotidi (radioattivi) prive di personalità giuridica. Prendere una siringa da 2 mL e coprire l'uscita con un piccolo cerchio di spessa carta da filtro. Aggiungere 2 mL di Sephadex G-50 disciolto in TE nella siringa e rimuovere tutto il liquido dalla colonna di filatura.
    8. Posizionare la colonna in un tubo di plastica da 15 mL, caricare il probe marcato sulla colonna e girare a temperatura ambiente (impostare la centrifuga a 750 x g, consentire il numero di giri aumentare fino a raggiungere 750 x g, quindi interrompere la centrifuga e permettere la rotazione a declinare a 0 x g) per eluire la sonda. Aggiungere 200 µ l di TE alla colonna e spin per eluire la sonda rimanente; Ripetere una volta. In queste condizioni, con etichettati frammenti di DNA sono esclusi dalla matrice Sephadex ed eluire, mentre nucleotidi liberi rimangono nella colonna.
    9. Utilizzare 300 µ l di sonda marcata per tubo di ibridazione. Tenere il restante probe marcato a-20 ° C per un successivo utilizzo. Tuttavia, tenere presente il tempo dell'ATP [32P].
  7. Ibridare la macchia di DNA.
    1. Calore 2 x SSC e tampone di ibridazione (15 mL per tubo di ibridazione, massimo di 2 macchie per tubo) a 65 ° C. (Tampone di ibridazione: solfato di destrano 10%, 1% SDS, NaCl di 1m, Tris 50 mM a pH 7.5, sciogliere a 65 ° C, mantenere le aliquote a-20 ° C).
    2. Pre-riscaldare il forno di ibridazione a 65 ° C.
    3. Posizionare la maglia di nylon in un vassoio con un po ' di riscaldata (65 ° C) 2 x SSC per coprire il vassoio. Mettere la macchia di DNA in cima la mesh, con il lato di DNA. Rotolare la macchia insieme la mesh e inserire il rotolo in un tubo di ibridazione. Versare il 2 in eccesso x SSC.
    4. In un tubo del microcentrifuge, bollire 150 µ l di DNA di sperma di salmone (concentrazione di 10 mg/mL) per tubo di ibridazione per 5 min (Vedi anche punto 4.6.3). Raffreddare immediatamente sul ghiaccio e aggiungere il tampone di ibridazione pre-riscaldata.
    5. Aggiungere la soluzione di ibridazione buffer-salmone sperma al tubo con la macchia. Pre-ibridare a 65 ° C per almeno 1 h in una ruota in movimento, a 12 giri/min.
    6. Quando il pre-incubazione nel passaggio 4.7.5. è quasi finito, bollire 300 µ l di sonda marcata per 5 min (Vedi anche punto 4.6.3) e aggiungere immediatamente la macchia dopo l'incubazione.
    7. Ibridare una notte nella ruota a 63 ° C, 12 giri/min. Non pipettare la sonda direttamente sulla macchia, ma nella soluzione di ibridazione buffer-salmone dello sperma.
  8. Lavare la macchia.
    1. Preriscaldare le soluzioni di lavaggio (1x SSPE, 0,1% SDS e 0.1 x SSPE, 0.1% SDS) a 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M di NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7.0).
    2. Eliminare la soluzione di ibridazione e aggiungere circa 100 – 150 mL di 1 x SSPE, soluzione di SDS 0,1% al tubo di ibridazione, tappare la provetta e ruotare a mano. Versare l'ibridazione e la soluzione nell'appropriato rifiuti radioattivi liquidi di lavaggio.
    3. Aggiungere circa 100 – 150 mL di 1 x SSPE, soluzione di SDS 0,1% al tubo, chiudere e incubare la provetta per 15 min a 63 ° C nella ruota, 12 giri/min. Scartare la soluzione di lavaggio in modo appropriato.
    4. Aggiungere circa 100 – 150 mL di 0.1 x SSPE, soluzione di SDS 0,1% al tubo di ibridazione, chiudere e ruotare il tubo per 5 min a 63 ° C, 12 giri/min. Scartare la soluzione di lavaggio in modo appropriato.
    5. Prendere la macchia fuori dal tubo e metterlo in un vassoio contenente 0,1 sufficiente preriscaldato x SSPE, 0,1% SDS e agitare per 3 minuti in un bagnomaria con agitazione a 65 ° C. Nel frattempo, risciacquare la mesh in un vassoio riempito con acqua.
    6. Togliere la macchia, posizionarlo tra pre-piegati in plastica (tubi in polietilene), accuratamente asciugare il liquido in eccesso e lasciare la macchia asciugare brevemente. Nota che il liquido si rovina phosphorimager schermo.
    7. Sigillare il blot in plastica sui tre lati. Rimuovere tutto il liquido in eccesso che circonda la macchia e chiudere il tubo di plastica sigillando il quarto lato. Tagliare l'eccedenza di plastica. Assicurarsi che la macchia sigillata non presenta perdite e che la plastica è asciutta all'esterno.
  9. Esporre lo schermo phosphorimager.
    1. Posto il blot sigillato in una cassetta phosphorimager, con lo schermo di phosphorimager rivolto verso il lato di DNA del blot. Chiudere la cassetta e lasciare per ± 2 – 4 giorni, a seconda della forza dell'etichettatura radioattivo e sensibilità del phosphorimager.
    2. Scansione sullo schermo di phosphorimager mediante un phosphorimager. Prendersi cura di esporre lo schermo il meno possibile alla luce prima della scansione. Salvare l'immagine. Annullare lo schermo dal segnale esponendolo alla luce.
  10. Analizzare la macchia.
    1. L'analisi dipende dalla strategia restrizione utilizzata nel passaggio 4.1. Quando si analizza il blot preparato secondo la strategia indicata nel passaggio 4.1.1.1 (Figura 4A), contare il numero dei frammenti rilevato. In questa strategia, il numero di frammenti ibridizzate si riferisce al numero di integrazioni T-DNA.
      1. Confrontare il numero dei frammenti rilevata con una sonda per la sinistra (figura 7B) e la parte destra (Figura 7) del T-DNA.
        Nota: Se un diverso numero di frammenti di ibridazione è rilevato, quindi entrambi i) più copie di T-DNA (sia in orientamento invertito o diretto) o ii) non completamente integrato T-DNAs sono presenti.
      2. Stimare le dimensioni dei frammenti ibridati sulla macchia basato sulle dimensioni delle bande dell'indicatore e confrontano le dimensioni dei frammenti ibridati con il frammento previsto le dimensioni calcolate sulla base della strategia di restrizione di inserimenti tandem (Figura 4A) per identificare la disposizione in tandem possibili di T-DNAs. Utilizzare la Figura 4A come una guida per calcolare le dimensioni dei frammenti previsti.
        Nota: Se la dimensione dei frammenti ibridate non sono d'accordo con quelli calcolati, quindi molto probabilmente uno delle integrazioni presenti non è completo.
    2. Quando si analizza il blot preparato secondo la strategia indicata nel passaggio 4.1.1.2 (Figura 4B), stimare la dimensione del frammento ibridazione sulla macchia in base alla dimensione delle bande dell'indicatore e confrontarlo con le dimensioni previste. Un inserimento intatto produce un singolo frammento con una lunghezza definita. Qualsiasi deviazione della durata prevista indica integrazione incompleta (Figura 7).
  11. Striscia la macchia per re-ibridazione (opzionale).
    Nota: La stessa macchia può essere ibridata consecutivamente con diverse sonde. Prima di continuare con una nuova sonda, striscia una sonda ibridizzata precedente dalla macchia.
    1. Per rimuovere la sonda dal blot, posizionare la macchia in un vassoio con il suo DNA-lato rivolto verso il basso. Versare un surplus di 0,5% SDS nel vassoio. Far bollire la membrana per 2 – 5 min. La durata del trattamento dipende dalla dimensione e contenuto di GC della sonda utilizzata. Più lunghe e più ricco GC sonde necessitano di un trattamento più lungo.
    2. Dopo la sverniciatura, ibridare il blot con un'altra sonda, o sigillare e conservare a-20 ° C.

Risultati

Utilizzando il sistema di BIBAC-GW, costruzioni del reporter per studiare ODM in piante erano generati10. Costrutti sono stati progettati nella voce Gateway vettoriale pENTR-gm12 e inseriti nel pBIBAC-BAR-GW (Figura 1) usando la reazione di ricombinazione LR Gateway.

Arabidopsis sono stati trasformati con pDM19, un plasmide BIBAC-BAR-GW con un reporter...

Discussione

Critica alla generazione transgenica con integrazioni singoli, intatti di un transgene è la scelta del vettore binario utilizzato. Vettori di famiglia BIBAC sono stati utilizzati per fornire sequenze di interesse a molti pianta specie23,24,25,26,27,28. Vettori di BIBAC, tra cui BIBAC-GW, resa singola copia integrazioni con a...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questa ricerca è sostenuta dall'olandese Technology Foundation STW (12385), che fa parte dell'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO), e che è in parte finanziato dal Ministero degli affari economici (OTP Grant 12385 a MS).  Ringraziamo Carol M. Hamilton (Cornell University, Stati Uniti) per la fornitura di pCH20, la spina dorsale dei vettori BIBAC-GW.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Kanamycin sulphate monohydrateDuchefaK0126
Gentamycin sulphateDuchefaG0124
RifampicinDuchefaR0146
Tetracycline hydrochlorideSigmaT-3383
DB3.1 competent cellsThermo Scientific - Invitrogen11782-018One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cellsThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
tri-Sodium citrate dihydrateMerck106432
Trizma baseSigma-AldrichT1503
EDTA disodium dihydrateDuchefaE0511
Proteinase KThermo Scientific EO0491
Bacto tryptoneBD211705
Yeast extractBD212750
Sodium chlorideHoneywell Fluka13423
Potassium chlorideMerck104936
D(+)-Glucose monohydrateMerck108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gapBiorad1652089
Electroporator Gene PulserBioRad
Magnesium sulfate heptahydrateCalbiochem442613
D(+)-Maltose monohydrate 90%Acros Organics32991
SucroseSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Skoog mediumDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosinate-ammonium (Basta)Bayer79391781
Restriction enzymesNEB
Ethidium BromideBio-Rad1610433
Electrophoresis systemBio-Rad
Sodium hydroxideMerck106498
Hydrochloric acidMerck100316
Blotting nylon membrane Hybond N+Sigma Aldrich15358or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paperGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acetylated BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-MercaptoethanolMerck805740
Sephadex G-50 CoarseGE Healthcare Life Sciences17004401or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium saltSigma-AldrichD8906
Sodium Dodecyl Sulfate US BiologicalS5010
Salmon Sperm DNASigma-AldrichD7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateMerck106346
Storage Phosphor screen and casetteGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Phosphor imagerGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrosslinkerStratageneStratalinker 1800
cling film (Saran wrap)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Boric acidMerck100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder.MRC HollandMCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladderMRC HollandMCT8080
Hexanucleotide MixRoche11277081001
Large-Construct KitQiagen12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clearvarious providersthe width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter diskMerckVSWP02500
Magnesium chlorideMerck105833
Hybridization meshGE Healthcare Life SciencesRPN2519

Riferimenti

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