Micromanipulación de los cromosomas de espermatocitos de insectos

Resumen

En este protocolo, se describen la selección y preparación de células apropiadas para la micromanipulación y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico para volver a colocar los cromosomas dentro de las células.

Resumen

Ha sido un método esencial para iluminar el mecanismo para cromosoma congression, el puesto de control de huso y los movimientos de cromosoma anafase la micromanipulación de los cromosomas y ha sido clave para entender lo que controla movimientos del cromosoma durante División de célula. Un biólogo experto puede utilizar un micromanipulador para separar los cromosomas del eje, para volver a colocar los cromosomas dentro de la célula y para aplicar fuerzas a los cromosomas con una aguja de pequeño de vidrio con una punta muy fina. Mientras que las perturbaciones se pueden hacer a los cromosomas utilizando otros métodos como las trampas ópticas y otros usos de un láser, hasta la fecha, ningún otro método permite la reposición de componentes celulares en la escala de decenas a cientos de micras con poco a ningún daño a la célula .

La selección y preparación de las células apropiadas para la micromanipulación de los cromosomas, específicamente describiendo la preparación de saltamontes y grillo espermatocito primario para el uso en proyección de imagen de células vivas y micromanipulación, son se describe aquí. Además, mostramos la construcción de una aguja para utilizarse para mover los cromosomas en la célula y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico controlado por joystick con una aguja de vidrio para reposicionar los cromosomas dentro de las células divisorias. Un resultado de ejemplo muestra el uso de un micromanipulador para separar un cromosoma de un eje en un espermatocito primario y para volver a colocar ese cromosoma dentro de la célula.

Introducción

Micromanipulación ha revelado las partes del mecanismo para un cromosoma congression, puesto de control de eje y movimientos de cromosoma anafase. La primera publicación que describe los resultados de experimentos de micromanipulación era por Robert Chambers¹. Cámaras utilizan un micromanipulador mecánica con una aguja de vidrio adjunta para sondear el citoplasma de un número de diferentes tipos de células. Por desgracia, métodos de contraste que permitieron la visualización de los cromosomas y de muchos otros componentes celulares en las células vivas no estaban disponibles en el momento, para que experimentos de cámaras no pueden mostrar los efectos de reubicar estos componentes celulares. Principios micromanipulations que alteración la posición del cromosoma el aparato de cámaras usado para barrer el midzone del huso en células de la anafase, mostrando que tales manipulaciones podrían alterar la posición de los brazos del cromosoma en neuroblastos de saltamontes de anafase² . Nicklas y sus colaboradores fueron los primeros en realizar finos micromanipulations de cromosomas, estirando los cromosomas³, separarlas del husillo e induciendo una reorientación^3,4, estabilizar una malorientation aplicación de tensión a los cromosomas^5,6,7, y midiendo las fuerzas producidas por ejes en anafase^8,9. Otro trabajo en el laboratorio de Nicklas demostró que los gránulos citoplásmicos también podrían ser manipulado¹⁰ y que los centrosomas podrían cambiarse por micromanipulación¹¹. Micromanipulación no es sólo útil para mover los cromosomas y otros componentes celulares. Una aguja de micromanipulación puede cortar limpiamente a través de un huso mitótico en las células de demembranated¹² o se puede utilizar para disolver el sobre nuclear¹³. Además, se pueden fusionar células adyacentes por micromanipulación^14,15.

Con una amplia variedad de experimentos interesantes que pueden hacerse mediante micromanipulación, sorprende a primera vista que se han realizado experimentos de micromanipulación por muy pocos biólogos de cromosoma. Una de las razones para esta deficiencia es que las células cultivadas se dividen mitotically que se derivan de los tejidos vertebrados y se utilizan para estudiar los movimientos del cromosoma son extremadamente difíciles de micromanipulate. Estas células de cultivo de tejidos en general tienen un citoesqueleto cortical que "se pone en el camino" de la micromanipulación de la aguja y los cromosomas ya no se puede llegar por la aguja o muele la aguja a través de la célula, conduciendo a una ruptura de la célula y la muerte. Nos y otros experimentadores que usan micromanipulación, hemos encontrado células artrópodas para ser susceptibles de micromanipulación. Espermatocitos de artrópodos se extienden fácilmente bajo una capa de aceite de halocarburos y parecen tener un mucho menos robusto citoesqueleto cortical subyacente a la membrana de la célula durante la división celular. Así, los testículos artrópodos proporcionan una buena fuente de células dividirse meiotically (espermatocitos) y mitotically dividirse las células (espermatogonios) con cromosomas fácilmente accesibles para la micromanipulación. Un seccionamiento serial de un espermatocito de saltamontes fijado durante una manipulación reveló que la aguja no penetra la membrana de la célula; la membrana de la célula se deforma alrededor de la aguja (Nicklas R.B., comunicación personal). Espermatocitos de un número de taxones de insectos y arañas han estado micromanipulated con éxito, incluyendo saltamontes, orando Mantis, moscas de la fruta, moscas grúa, grillos, spittlebugs, polillas, arañas viuda negra, arañas del sótano y las arañas orbe-que teje ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Las células cultivadas, mitotically dividirse de insectos pueden ser micromanipulated. Por ejemplo, los cromosomas en neuroblastos saltamontes en un cultivo primario tienen cromosomas que pueden ser fácilmente micromanipulated^2,23. Sospechamos que el cultivado líneas derivadas de Drosophila y otros insectos también se micromanipulatable, aunque no hemos probado la técnica con estas células. Vamos a mostrar cómo dividir celdas de saltamontes y grillos se puede preparar para una micromanipulación. Grillos son fáciles de obtener de la mayoría de las tiendas para mascotas en cualquier momento del año. Saltamontes son fácilmente obtenibles en el verano a menos que el investigador tiene acceso a una colonia de laboratorio, pero la especie utilizada (Melanoplus sanguinipes) ha aplanado fácilmente las células y los cromosomas largos, fácil de manipular.

Otra razón por qué se han realizado experimentos de micromanipulación por un puñado de biólogos es que micromanipuladores que mueven los cromosomas bien están raramente disponibles en el mercado. Hemos encontrado que un micromanipulador piezoeléctrico controlado por joystick controla el movimiento de la aguja sin vibración, deriva o desfase entre el movimiento de la palanca de mando y el movimiento de la aguja, pero otros tipos de manipuladores con éxito pueden empujar los cromosomas alrededor de la célula. Los micromanipuladores diseñados por Ellis y Begg^25,26 son ideales para la micromanipulación de los cromosomas, aunque utilizan tecnología más antigua. Micromanipuladores piezoeléctricos están actualmente disponibles y utilizados en electrofisiología; sin embargo, estos micromanipuladores no son normalmente controlado por joystick. Control de joystick es clave para los movimientos requeridos para un exitoso micromanipulación, y un joystick personalizado debe ser construido de tal manera para trabajar los micromanipuladores piezoeléctricos actualmente disponibles para una micromanipulación de cromosoma. Los micromanipuladores piezoeléctricos controlado por joystick que mejor funcionan tienen control directo de posición, en que el movimiento de la palanca de mando se traduce directamente en un movimiento de la aguja.

Un micromanipulador piezoeléctrico nuevo diseño puede construirse de piezas comercialmente disponibles que pueden ser reemplazados fácilmente y de algunos pequeños componentes impresos 3D, y funciona bien para cromosoma micromanipulación²⁴. El micromanipulador sensibilidad ajustable, posicionamiento manual gruesa y no tiene vibración, deriva o retraso en el movimiento de la aguja y el control directo de la posición de la aguja. Los científicos pueden construir el instrumental quirúrgico con instrucciones disponibles en línea²⁴. A continuación se presentan los métodos para la preparación de un cultivo celular de espermatocito primario y micromanipulating los cromosomas dentro de las células en esa cultura.

Protocolo

1. preparación del cultivo celular de espermatocito primario de insectos para micromanipulación

1. Preparación de portaobjetos
   1. Obtener un portaobjetos de vidrio 75 x 25 mm con un agujero circular de 20 mm de diámetro, en el centro de la diapositiva.
      Nota: Estos fueron cortados de una sola hoja de vidrio de la ventana a ser del tamaño de un portaobjetos de vidrio con un orificio en el centro.
   2. Ejecutar un cubreobjetos 25 x 25 mm #1.5 a través de una llama de mechero de Bunsen para 2 s.
   3. Aplique grasa de vacío alrededor del borde del orificio en el portaobjetos de cristal
   4. Coloque el cubreobjetos sobre el agujero como en la figura 1. Presiónelo y asegúrese de que formar un sello hermético.
   5. Voltear el portaobjetos de cristal y completar la disección con aceite de halocarburos.
2. Preparación de cultura espermatocito para visualización en microscopio
   Nota: Aquí, describimos el método de preparación de cultivo con células de saltamontes o grillo. Contenido de los testículos de otros artrópodos puede cultivarse utilizando un método similar.
   1. Obtener grillos macho subadultos (o saltamontes). Colocar un insecto de vivir en el refrigerador por aproximadamente 2 min para frío-anestesiar. Usando las tijeras de disección, rápidamente cortar a través de la superficie dorsal paralela al eje largo del abdomen directamente detrás de los brotes de ala. Apriete manualmente el abdomen suavemente para empujar los testículos a través del corte en el exoesqueleto (figura 2).
   2. Utilizando pinzas, coloque los testículos aislados en una disección que también contiene aceite de halocarburos.
   3. Si es necesario, ver los testículos con un microscopio de disección. Dividirlos en partes más pequeñas con unas pinzas de punta fina, quitar cualquier grasa que cubre los testículos y pinzas de punta fina para romper los testículos (Figura 3A y 3B). Difundir el contenido de los testículos en el aceite, en la superficie del cubreobjetos (figura 3).
   4. Difundir el contenido de los testículos hasta la parte de propagación de los testículos es apenas perceptible a los ojos (figura 3). Usar pozos de disociación adicional cargado de aceite si es necesario.

2. micromanipulación

1. Producción de la microneedle
   1. Coloque un extremo de un tubo de vidrio (0,85 mm de diámetro exterior, 0,65 mm de diámetro interno) en la llama de un mechero de Bunsen. Tire del extremo de los tubos de vidrio de tal manera que se forma un ángulo de 150°, y se crea un área extendida de tubería de cristal estrecho. Romper la tubería en la región delgada para que la región delgada que se extiende desde el ángulo es aproximadamente de 10 mm de largo (Figura 4A).
   2. Utilizando un microforge (por encargo según Powell²⁷ o comercialmente disponible-véase Tabla de materiales), toque la punta de la aguja de vidrio para el alambre de platino caliente para derretir el vidrio en la punta. Forma un ángulo aproximado de 45° entre la aguja y el alambre de platino de la microforge (Figura 4B). Tirar el vidrio de alambre caliente, al mismo tiempo apagando el calor en el cable, formando una fina punta de ≤1. 5 mm en el extremo de la aguja de vidrio.
      Nota: El diámetro de la punta será difícil de medir, pero una punta de esta longitud es probable producir una aguja firme pero flexible que será apropiada para la micromanipulación. Alternativamente, podría utilizarse un extractor de la micropipeta para crear tubos de vidrio con un diámetro de la punta apropiado (el experimentador tendrá que probar diferentes recetas tirando para producir un microneedle adecuadamente firme pero flexible para el trabajo). La aguja podría ser colocada en un soporte que se forma de manera similar a la aguja de manipulación creada según el método descrito anteriormente.
2. Posicionamiento del instrumental quirúrgico
   1. Colocar el portaobjetos preparado en la etapa de un microscopio de contraste de fases invertido. Encontrar las células en división y en el centro en el campo de visión. Se centran en las células con el aumento más bajo posible.
      Nota: Utilizamos un objetivo de contraste de fases de X 16.
   2. Lugar el microneedle en el sostenedor de la aguja en el micromanipulador.
   3. Coloque manualmente el microneedle en la trayectoria de la luz del microscopio para que la punta de la aguja está iluminada por la luz (figura 5B).
   4. Enfocar el microscopio varios planos focales por encima del plano en el cual las células mienten.
   5. Vuelva a colocar el microneedle utilizando el controlador de joystick en una sensibilidad baja varias veces para encontrar la sombra de la aguja en los ejes X y y. Seguir reajustar la posición hasta que la posición de la punta sea visible. Ajuste la posición de la aguja a lo largo del eje z hasta que la punta de la aguja está en foco.
   6. Enfocar en las células, y luego enfocar el microscopio por encima del plano de la celda para que las células están fuera de foco y invisible. Reajuste la posición de la aguja de modo que su punta esté en foco en este plano focal.
   7. Ajuste la ampliación del microscopio como sea necesario.
      Nota: Utiliza un objetivo de contraste de fases 100 X 1.4 apertura numérica (NA) para la micromanipulación.
   8. Después de centrarse en las células con el objetivo de mayor aumento, otra vez enfocar el microscopio por encima del plano de la celda para que las células estén fuera de foco y invisible. Use una mayor sensibilidad, reajuste la posición de la aguja para que su punta está en foco y centrado en el plano focal por encima del plano en el cual las células mienten.
   9. Vuelva a enfocar en las células, ajuste de su posición de manera que permanezcan en el centro del campo de visión. La aguja está ahora lista para la micromanipulación.
3. Micromanipulación de los cromosomas
   1. Utilizando el mismo ajuste de sensibilidad en cuanto a la colocación fina en una alta ampliación, use el joystick para controlar el microneedle y empuje los cromosomas dentro de la célula. Mantenga la punta de la aguja por encima del plano de las células.
   2. Para tirar o mover un cromosoma, se centran en un cromosoma en la parte superior de la célula.
      Nota: Estos cromosomas son fáciles de manipular-manipular cromosomas cerca que el cubreobjetos es probable que la aguja se muela en el cubreobjetos, estallando la célula y acabar con el experimento.
   3. Ajustar el eje z en el joystick para llevar la punta de la aguja en foco y luego mover punta de la aguja con el joystick en X y Y. Coloque la punta de la aguja directamente en el cromosoma para manipular y empujar en la dirección deseada para permitir que el manipulador a repositi en el cromosoma.
   4. Dependiendo de cuánto se empuja el cromosoma, aplique tensión al cromosoma o aplicar suficiente tensión para separar un cromosoma desde el eje. Una vez que un cromosoma es eliminado de un eje, colocar en cualquier lugar dentro de la célula.

Resultados

La figura 6 muestra una micromanipulación de muestra de 2 espermatocitos primarios adyacentes saltamontes en varios ejemplos de los posibles usos de micromanipulación. Este experimento se realizó usando un microscopio de contraste de fases invertido,. El 0:00 (las horas se muestran en min:s) la imagen muestra las células antes de la manipulación. Un cromosoma en la célula de la parte inferior se muestra bajo tensión aplicada por la aguja de micromanipu...

Discusión

Con la práctica, moviendo los cromosomas en la célula puede convertirse en segunda naturaleza. Agujas que son lo suficientemente rígidos y suficientemente delgada con punta son difíciles "conseguir la habilidad de" fabricación, pero esta capacidad también viene con la práctica. Las agujas que son tan finas que se deforman cuando se movió en el aceite de halocarburos no será útiles para empujar los cromosomas en la célula. Las agujas que son tan embotan que sus consejos son visibles y tan grandes como 1/3 de la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300