곤충 Spermatocytes에 염색체의 micromanipulation

요약

이 프로토콜에서 선택과 그 세포 내에서 염색체 위치를 micromanipulation에 대 한 적절 한 셀의 준비와 압 전 micromanipulator의 사용을 설명 합니다.

초록

염색체의 micromanipulation는 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘을 조명 하는 필수적인 방법 고 있다 염색체의 움직임을 제어 하는 무슨을 이해 하는 열쇠 셀 부 중. 숙련 된 생물학자는 micromanipulator 염색체는 세포 내에서 위치를 변경 하 고 아주 좋은 팁는 작은 유리 바늘을 사용 하 여 염색체를 힘을 적용 하는 스핀 들에서 염색체를 분리 사용할 수 있습니다. 섭 염색체 광학 트래핑 같은 다른 방법과 레이저의 다른 사용을 사용 하 여 만들 수 있습니다, 하는 동안 날짜, 아니 다른 메서드를 사용 하면 셀에 아무 손상도 거의 미크론의 수백에 10의 규모에 세포 구성 성분의 위치 .

선택과 적절 한 세포의 염색체, 메뚜기 및 귀뚜라미 spermatocyte 기본 문화권의 준비 라이브 셀 이미징 및 micromanipulation, 사용에 대 한 설명의 micromanipulation에 대 한 준비는 여기 설명합니다. 또한, 우리는 나누어 세포 내에서 염색체 위치를 그것에 붙어 있던 유리 바늘으로 세포, 그리고 조이스틱 제어 압 전 micromanipulator 사용 내 염색체 이동에 사용할 바늘의 건설을 보여줍니다. 샘플 결과 micromanipulator 기본 spermatocyte에 스핀 들에서 염색체를 분리 하 고 세포 내에서 해당 염색체 위치를 사용을 보여준다.

서문

Micromanipulation은 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘의 일부를 공개 했다. 가장 이른 간행물 micromanipulation 실험의 결과 설명 하는 로버트 챔버¹했다. 챔버는 여러 종류의 다른 세포의 세포질을 연결 된 유리 바늘 기계 micromanipulator를 사용. 불행 하 게도, 염색체와 살아있는 세포에 많은 다른 세포 구성 성분의 시각화를 허용 하는 대비 방법을 사용할 수 없었습니다, 당시 챔버 실험 재배치 같은 세포 구성 성분의 효과 표시 하지 수 있으므로. 초기 micromanipulations 염색체 위치를 변경 하는 이러한 조작 anaphase 메뚜기 neuroblasts^{2에서에서 염색체 팔의 위치를 변경할 수 보여주는 anaphase 셀에 스핀 들 midzone 청소 챔버 장치 사용} . 니와 그의 공동 작업자 최초로 염색체의 미세 micromanipulations 수행 염색체³스트레칭, 스핀 들에서 그들을 분리 하 고 재교육^3,4, 안정화를 유도 한 염색체^5,,67, 긴장을 적용 anaphase^8,9스핀 들에 의해 생산 하는 힘을 측정 하 여 malorientation. 니 클 랩 다른 작업 세포질과 립 또한 조작된¹⁰ 수와 micromanipulation¹¹centrosomes의 위치를 변경할 수는 나타났다. Micromanipulation은 염색체와 다른 세포질 구성 요소 이동 단지 유용 하지 않습니다. Micromanipulation 바늘 demembranated 셀¹² mitotic 스핀 들을 통해 청결 하 게 자를 수 있다 또는 핵 봉투¹³해산 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 인접 한 셀 micromanipulation^14,15융합 될 수 있다.

이러한 다양 한 할 수 있는 재미 있는 실험의 micromanipulation를 사용 하 여, 그것은 첫눈에 놀라운 micromanipulation 실험 거의 염색체 생물학에 의해 수행 되었습니다. 이 결핍에 대 한 이유 중 하나입니다 척추 조직에서 파생 되 고 염색체 움직임을 공부에 대 한 일반적으로 사용 되는 mitotically 분할 배양된 세포 micromanipulate 매우 어렵다. 이 조직 배양 세포는 일반적으로 바늘 "방해가 된다"는 micromanipulation의 그리고 염색체 중 하나는 바늘에 의해 도달할 수 없는 또는 바늘 세포 파열 및 죽음으로 이어지는 셀 grinds 대뇌 피 질의 골격을 있다. 우리, 그리고 micromanipulation를 사용 하 여 다른 경험 arthropod 셀 micromanipulation 의무가 있을을 발견 했다. Arthropod spermatocytes halocarbon 기름의 층에서 쉽게 확산 하 고 세포 분열 중 세포 막 내부는 훨씬 강력한 대뇌 피 질의 골격을가지고 있는 것 같습니다. 따라서, arthropod testes meiotically 분할 세포 (spermatocytes)의 좋은 소스를 제공 하 고 (spermatogonia) micromanipulation 위한 쉽게 접근할 수 있는 염색체를 가진 세포 mitotically 분할. 바늘 적 세포 막; 침투 계시는 조작 하는 동안 고정 메뚜기 spermatocyte의 직렬 구분 바늘 (니 클 R.B., 개인 커뮤니케이션) 주위 세포 막 변형. 곤충과 거미 taxa의 수에서 spermatocytes 되었습니다 micromanipulated 성공적으로, 메뚜기, 등 기도 mantids, 과일 파리, 크레인 파리, 귀뚜라미, spittlebugs, 나 방, 검은 부 거미, 지하실 거미, 천체 길 쌈 거미 ^{3,7,17,18,19,20,,2122}. 곤충에서 교양, mitotically 분할 셀 micromanipulated 될 수 있습니다. 예를 들어 기본 문화에 메뚜기 neuroblasts에서 염색체 염색체 micromanipulated^2,23쉽게 될 수 있는 있다. 우리 용의자 사용 가능한 교양 라인 초파리 에서 파생 된 다른 곤충 또한 micromanipulatable, 있을 것입니다 비록 우리가 이러한 세포와 기법을 테스트 하지 않았습니다. 우리는 어떻게 메뚜기와 귀뚜라미에서 셀 분할 수 준비는 micromanipulation에 대 한 표시 됩니다. 귀뚜라미 들 언제 든 지 올해의 대부분의 애완 동물 상점에서 얻을 수 있습니다. 메뚜기는 연구원 실험실 식민지에 권한이 않으면 종 사용 (Melanoplus sanguinipes)는 쉽게 평평 하 게 셀, 그리고 긴, 쉬운 조작 염색체만 여름에 쉽게 얻을 수 있습니다.

또 다른 이유 왜 micromanipulation 실험 생물학의 작은 소수에 의해 수행 되었습니다 micromanipulators 염색체를 잘 이동 하는 시장에서 거의 사용할 수입니다. 우리는 진동, 드리프트, 또는 조이스틱 움직임와 바늘 움직임 사이의 지연 없이 바늘 움직임을 제어 하는 조이스틱 제어 압 전 micromanipulator 하지만 조작자의 다른 유형 또한 성공적으로 염색체를 밀 수 있다 발견 주변 셀에. 하지만 그들은 오래 된 기술을 사용 하 여 설계한 엘리스와 Begg^25,26 micromanipulators 염색체의 micromanipulation에 이상적입니다. 압 전 micromanipulators 현재 사용할 수 있으며 일반적으로 전기 생리학;에 사용 그러나,이 micromanipulators 일반적으로 조이스틱을 제어 하지 않습니다. 조이스틱 제어는 성공적인 micromanipulation에 필요한 부드러운 움직임을 키 고 그래서 사용자 정의 조이스틱 염색체 micromanipulation 위해 일 하는 현재 사용할 수 있는 압 전 micromanipulators을 건설 한다. 최고의 작품은 조이스틱 제어 압 전 micromanipulators 직접 위치 제어를, 조이스틱의 움직임이 바늘 움직임에 직접 변환 하는 있다.

새롭게 설계 된 압 전 micromanipulator 쉽게 대체 될 수 있습니다 상용 부품 및 일부 작은 3 차원 인쇄 구성 요소를 생성할 수 있습니다 그리고 염색체 micromanipulation²⁴를 위해 잘 작동 합니다. micromanipulator 조정 가능한 감도, 수동 거친 위치 및 진동, 드리프트, 또는 지연 바늘 운동, 그리고 바늘의 직접 위치 제어에 있다. 과학자 들은 micromanipulator 지침 사용할 수 온라인²⁴를 사용 하 여 구성할 수 있습니다. 아래 기본 spermatocyte 세포 배양 준비 및 micromanipulating 메서드는 그 문화에 있는 세포 내에서 염색체.

프로토콜

1. Micromanipulation에 대 한 기본 곤충 Spermatocyte 세포 배양의 준비

1. 슬라이드 준비
   1. 슬라이드의 중심에서 밖으로 잘라 20 m m 직경 원형 구멍 75 m m x 25 m m 유리 슬라이드를 가져옵니다.
      참고:이 창 유리 유리 슬라이드 중심에 구멍의 크기를 한 시트에서 절단 했다.
   2. 2 분 젠 버너 불꽃을 통해 25 m m x 25 m m #1.5 coverslip 실행 s.
   3. 유리 슬라이드에 구멍의 가장자리 주위에 진공 그리즈
   4. 그림 1과 같이 구멍에 coverslip 장소. 그것은 누르고 단단한 물개를 형성 하는 것을 확인 하십시오.
   5. 유리 슬라이드를 플립 하 고 halocarbon 기름으로 잘 해 부를 입력 합니다.
2. 현미경에 대 한 spermatocyte 문화 준비
   참고: 여기, 우리가 메뚜기 또는 귀뚜라미 셀을 사용 하 여 문화 준비 방법을 설명 합니다. 다른 절지동물의 testes 내용은 비슷한 방법을 사용 하 여 양식 수 있습니다.
   1. Subadult 남성 귀뚜라미 (메뚜기)를 가져옵니다. 감기-anesthetize에 약 2 분 동안 냉장고에서 살아있는 곤충을 놓습니다. 해가 위를 사용 하 여 신속 하 게 잘라 등 쪽 표면을 통해 직접 날개 싹 뒤에 복 부의 긴 축에 평행. 수동으로 외장 (그림 2)에서 잘라내기 통해 testes를 부드럽게 복 부를 짠 다.
   2. 집게를 사용 하 여 고립된 고환을 잘 halocarbon 유를 포함 해 부에 배치 합니다.
   3. 필요한 경우, 해 현미경 testes 볼. 잘 지적 집게, testes, 다루는 모든 지방 제거를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 분할 하 고 벌금 지적 집게를 사용 하 여 (그림 3A 와 3B) testes 헤어. Coverslip (그림 3C)의 표면에 기름에서 testes 내용을 확산.
   4. 고환의 확산 부분은 눈 (그림 3C)에 거의 눈에 띄는 때까지 고환 내용을 확산. 추가 오일 로드 분리 웰 스를 사용 하 여 필요한 경우.

2입니다. micromanipulation

1. 미세 바늘의 생산
   1. 분 젠 버너의 불꽃에 (0.85 m m 외경, 내경 0.65 m m) 유리 튜브의 한쪽 끝을 배치 합니다. 150 °의 각도 형성 하 고 좁은 유리 튜브의 확장된 영역 생성 방식에 유리 튜브의 끝을 당겨. 각도에서 연장 하는 얇은 지역은 약 10 m m 긴 (그림 4A) 얇은 지역에서 튜브를 휴식.
   2. microforge을 사용 하 여 (파월²⁷ 에 따라 주문 품 또는 상업적으로 사용 가능한 참조 테이블의 자료), 끝에 유리를 녹기 뜨거운 백 금 철사에 유리 바늘의 끝을 터치. 형태는 바늘과 microforge (그림 4B)의 백 금 철사 사이 약 45 ° 각도. 와이어, ≤1.5 유리 바늘의 끝에 m m의 얇은 끝을 형성 하는 열을 종료 하는 동안 뜨거운 철사에서 유리를 당겨.
      참고: 팁 직경 측정 하기 어려운 것 이지만 끝이이 길이 micromanipulation에 대 한 적절 한 될 것입니다 확고 하지만 유연한 바늘을 생산할 가능성이. 또는, micropipette 끌어당기는 사람 (는 실험 작업에 대 한 적절 하 게 확고 하지만 유연한 미세 바늘을 생산 하는 다른 당기 조리법을 테스트 해야 합니다) 적절 한 팁 직경 유리 튜브를 만드는 데 사용 될 수 있습니다. 바늘 위에서 설명한 방법에 따라 만든 조작 바늘에 비슷한 모양의 홀더에 배치 될 수 있습니다.
2. 위치는 micromanipulator
   1. 거꾸로, 단계 대조 현미경의 스테이지 준비 슬라이드를 놓습니다. 분할 셀을 찾아서 보기의 필드에 센터. 가능한 가장 낮은 확대를 사용 하 여 셀에 초점.
      참고: 우리는 16 X 단계 대조 목적 사용.
   2. 장소에는 micromanipulator에 바늘 홀더 미세 바늘.
   3. 바늘의 팁 (그림 5B) 빛에 의해 조명 되도록 수동으로 현미경의 빛 경로에 microneedle를 놓습니다.
   4. 초점 현미경 셀 거짓말 평면 위에 여러 초점 비행기.
   5. 사용 하 여 조이스틱 컨트롤러 낮은 감도에서 여러 번 여 X 축과 y 축의에 바늘의 그림자를 찾아 미세 바늘 위치를 변경할. 계속 팁의 위치 표시 될 때까지 위치를 조정 합니다. 바늘 팁은 초점에까지 z 축 따라 바늘의 위치를 조정 합니다.
   6. 셀, refocus 다음 셀이 단지 초점 그리고 보이지 않는 되도록 셀 평면 위의 현미경 초점. 그것의 팁이 초점면에 초점에 바늘의 위치를 재조정.
   7. 필요에 따라 현미경의 배율을 조정 합니다.
      참고: 우리는 micromanipulation에 대 한 100 X 1.4 수 가늠 구멍 (NA) 단계 대조 목적을 사용.
   8. 높은 배율 목표를 사용 하 여 셀에 초점을 맞추고, 후 다시 초점을 셀 평면 위의 현미경 세포는 단지 초점 그리고 보이지 않는 있도록. 팁 초점이 고 셀 거짓말 평면 위에 초점면에서 높은 감도 설정을 사용 하 여, 바늘의 위치 조정.
   9. 그래서 그들은 보기의 필드의 중앙에 남아 그들의 위치를 조정 하는 셀에 촛점. 바늘은 이제는 micromanipulation에 대 한 준비.
3. 염색체의 micromanipulation
   1. 높은 확대에 좋은 위치에 관해서는 동일한 감도 설정을 사용 하는 미세 바늘을 제어 하 고 셀 내부를 염색체를 밀어 조이스틱을 사용 합니다. 셀의 평면 위에 바늘 팁을 유지.
   2. 당겨 또는 염색체 이동, 셀의 위쪽에 염색체에 초점.
      참고: 이러한 염색체는 쉽게 조작 조작 염색체 가까이 coverslip 게 바늘 coverslip 셀 파열 및 실험 끝에 갈아 버릴 가능성이 있습니다.
   3. 초점, 및 다음 이동 x에서 조이스틱 바늘 팁에 바늘 팁을가지고 조이스틱에 z 축 조정 및 Y. 조작 하 고 repositi 조작 수 있도록 원하는 방향으로 밀어 염색체에 직접 바늘의 팁을 배치 염색체.
   4. 염색체 누르면 얼마나 멀리에 따라 염색체에 긴장을 적용 하거나 스핀 들에서 염색체 분리에 충분 한 긴장을 적용 합니다. 염색체는 스핀 들에서 제거 되 면 장소 어디서 나 셀 내에.

결과

그림 6 micromanipulation의 가능한 사용의 몇 가지 예 2 인접 한 메뚜기 기본 spermatocytes의 샘플 micromanipulation를 보여 줍니다. 이 실험 수행 되었다 거꾸로, 단계 대조 현미경을 사용 하 여. 0:00 (시간 표시 있는 min:s) 이미지 조작 전에 두 셀을 보여 줍니다. 맨 아래 셀에 하나의 염색체 micromanipulation 바늘에 의해 적용 긴장 아래 표시 (0:05; 검은 화살표) 다음 스...

토론

연습으로, 세포에서 염색체를 이동 하는 것은 제 2의 천 될 수 있다. 충분히 뻣 뻣 한 그리고 충분히 얇은 밀고 바늘은 어려운 "의 요령" 조작, 하지만이 기능 또한 연습으로 온다. 그래서 괜 찮 그들은 변형 halocarbon 기름에 이동할 때 바늘 셀에 염색체를 추진 하는 데 유용 되지 않습니다. 그래서 바늘 그들의 팁을 볼 수 있습니다으로 염색체의 폭의 1/3로 (또는 더 큰)는 세포를 죽 일 가능성이 매우 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300