Micromanipulação de cromossomos em espermatócitos insetos

Resumo

Neste protocolo, descrevemos a seleção e a preparação de células adequadas para micromanipulação e o uso de um micromanipulador piezoelétrico para reposicionar os cromossomos dentro dessas células.

Resumo

A micromanipulação de cromossomos tem sido um método essencial para iluminar o mecanismo para congression do cromossomo, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase e tem sido a chave para entender o que controla os movimentos do cromossomo durante a divisão celular. Um biólogo especializado pode usar um micromanipulador para desanexar cromossomos do eixo, para reposicionar cromossomos dentro da célula e para aplicar forças aos cromossomas usando uma agulha de vidro pequeno com uma ponta muito fina. Enquanto que as perturbações podem ser feitas para cromossomos usando outros métodos, como armadilhas ópticas e outros usos de um laser, até à data, nenhum outro método permite o reposicionamento dos componentes celulares na escala de dezenas a centenas de micra, com pouco ou nenhum dano à célula .

A seleção e preparação de células adequadas para a micromanipulação de cromossomos, especificamente, descrevendo a preparação do gafanhoto e grilo culturas primárias de maturação para o uso em imagem latente da viver-pilha e micromanipulação, são descritos aqui. Além disso, mostramos a construção de uma agulha a ser usado para mover-se com uma agulha de vidro acompanhada de cromossomos dentro da célula e o uso de um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick para reposicionar os cromossomos dentro das células de divisão. Um resultado de exemplo mostra o uso de um micromanipulador para desanexar um cromossomo de um eixo em uma maturação primário e reposicionar esse cromossomo dentro da célula.

Introdução

Micromanipulação revelou partes do mecanismo de um cromossoma congression, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase. A mais antiga publicação descrevendo os resultados de experimentos de micromanipulação foi por Robert Chambers¹. Câmaras usado um micromanipulador mecânica com uma agulha de vidro anexado para sondar o citoplasma de um número de diferentes tipos de células. Infelizmente, os métodos de contraste que permitiu a visualização dos cromossomos e muitos outros componentes celulares em células vivas não estavam disponíveis na época, para que experimentos de Chambers não podem mostrar os efeitos de reposicionamento tais componentes celulares. Micromanipulations precoce que alterou a posição do cromossomo usado o aparelho de câmaras para varrer a midzone do eixo nas células anáfase, mostrando que tais manipulações podem alterar a posição dos braços do cromossoma em neuroblastos de gafanhoto anáfase² . Nicklas e seus colaboradores foram os primeiros a realizar bem micromanipulations de cromossomos, esticando os cromossomos³, desanexando-os do eixo e induzir a uma reorientação^3,4, estabilizando uma malorientation, aplicando a tensão ao cromossomos^5,6,7e medindo as forças produzidas por eixos em anáfase^8,9. Outros trabalhos por Nicklas laboratório mostraram que os grânulos citoplasmáticos também podem ser manipulado¹⁰ e que podem ser reposicionadas centrossomas micromanipulação¹¹. Micromanipulação não é apenas útil para mover cromossomos e outros componentes celulares. Uma agulha de micromanipulação limpa pode cortar um fuso mitótico em células de demembranated¹² , ou pode ser usada para dissolver o envelope nuclear¹³. Além disso, células adjacentes podem ser fundidas por micromanipulação^14,15.

Com uma grande variedade de experiências interessantes que pode ser feito usando micromanipulação, é à primeira vista surpreendente que experimentos de micromanipulação tem sido feitos por muito poucos biólogos de cromossomo. Uma razão para esta deficiência é que mitotically-divisão de culturas de células que são derivadas de tecidos de vertebrados e são comumente usadas para estudar os movimentos do cromossomo são extremamente difíceis de micromanipulate. Estas células de cultura de tecido geralmente têm um citoesqueleto cortical que "fica no caminho", da micromanipulação de agulha e cromossomos também não podem ser alcançados pela agulha ou a agulha mói através da célula, levando a uma ruptura da célula e a morte. Nós e outros experimentadores que usam micromanipulação, encontraram células artrópodes para ser passível de micromanipulação. Artrópodes espermatócitos espalham-se facilmente sob uma camada de óleo halocarbono e parecem ter um muito menos robusto citoesqueleto cortical subjacente da membrana celular durante a divisão celular. Assim, os testículos de artrópodes fornecem uma boa fonte de meiotically-divisão de células (espermatócitos) e mitotically-divisão de células (espermatogónias) com cromossomos facilmente acessíveis para micromanipulação. Um seccionamento serial de uma maturação de gafanhoto fixada durante uma manipulação revelou que a agulha não penetra a membrana celular; a membrana celular deforma ao redor da agulha (Nicklas R.B., comunicação pessoal). Espermatócitos de vários táxons de insetos e aranhas têm sido micromanipulated com sucesso, incluindo gafanhotos, mantids orando, moscas de fruta, guindaste moscas, grilos, spittlebugs, traças, aranhas viúva-negra, aranhas adega e aranhas orb-tecendo ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Cultas, mitotically-divisão de células de insetos podem ser micromanipulated. Por exemplo, os cromossomos em neuroblastos de gafanhoto numa cultura primária têm cromossomos que podem ser prontamente micromanipulated^2,23. Suspeitamos que o disponível cultivadas linhas derivadas de Drosophila e outros insetos também será micromanipulatable, embora nós não testamos a técnica com essas células. Vamos mostrar como dividir células de gafanhotos e grilos pode estar preparado para uma micromanipulação. Grilos são fáceis de obter da maioria das lojas de animais em qualquer época do ano. Gafanhotos só são facilmente obteníveis no verão, a menos que o pesquisador tem acesso a uma colônia de laboratório, mas a espécie utilizada (Melanoplus sanguinipes) tem aplainado facilmente células e cromossomos longos, fácil de manipular.

Outra razão por que os experimentos de micromanipulação tem sido feitos por um pequeno punhado de biólogos é que Micromanipuladores que movem os cromossomos bem estão raramente disponíveis no mercado. Descobrimos que um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick controla o movimento da agulha sem vibração, deriva, ou desfasamento entre o movimento do joystick e o movimento da agulha, mas outros tipos de manipuladores também com êxito podem empurrar cromossomos ao redor na célula. Os Micromanipuladores desenhados por Ellis e Begg^25,26 são ideais para a micromanipulação de cromossomos, embora eles usam a tecnologia mais antiga. Micromanipuladores piezoelétricos são atualmente disponíveis e comumente utilizada em eletrofisiologia; no entanto, estes Micromanipuladores não são normalmente controlado por joystick. Controle de joystick é chave para os movimentos suaves necessários para uma bem sucedida micromanipulação, e então um joystick personalizado deve ser construído a funcione os Micromanipuladores piezoelétricos atualmente disponíveis para micromanipulação um cromossomo. Os manche-controlou piezoelétricos Micromanipuladores que funcionam melhor tem controle direto da posição, na qual o movimento do joystick traduz diretamente a um movimento de agulha.

Um micromanipulador piezoelétrico recém-projetado pode ser construído de peças comercialmente disponíveis que podem ser facilmente substituídas e de alguns pequenos componentes impressos em 3D, e funciona bem para cromossomo micromanipulação²⁴. O micromanipulador sensibilidade ajustável, posicionamento manual grosseiros e não tem vibração, deriva ou atraso no movimento da agulha e controle direto da posição da agulha. Os cientistas podem construir o micromanipulador usando instruções disponíveis on-line²⁴. Abaixo estão os métodos para a preparação de uma cultura de células primárias de maturação e para micromanipulating os cromossomos dentro das células em cultura.

Protocolo

1. preparação da cultura de pilha de maturação insetos primários para micromanipulação

1. Preparação de slide
   1. Obter uma lâmina de vidro de 75 mm x 25 mm com um orifício circular de 20 mm de diâmetro cortado no centro do slide.
      Nota: Estas foram cortadas de uma única folha de janela de vidro do tamanho de uma lâmina de vidro com um buraco no centro.
   2. Executar uma lamela de 25 x 25 mm #1.5 através de uma chama de bico de Bunsen 2 s.
   3. Aplique lubrificante vácuo ao redor da borda do furo no vidro slide
   4. Coloca a lamela sobre o buraco como na Figura 1. Pressione-o e certifique-se de forma a um selo apertado.
   5. Virar a lâmina de vidro e encha a dissecação bem com óleo halocarbono.
2. Preparação de cultura de maturação para visualização no microscópio
   Nota: Aqui, descrevemos o método de preparação de cultura usando células gafanhoto ou grilo. Conteúdo de testículos de outros artrópodes pode ser cultivado utilizando um método semelhante.
   1. Obter promissor grilos masculinos (ou gafanhotos). Coloque um inseto vivo no frigorífico durante cerca de 2 min para frio-anestesiá-lo. Usando tesouras de dissecação, rapidamente corte a superfície dorsal paralelo ao eixo longitudinal do abdome diretamente para trás os botões da asa. Aperte manualmente o abdômen suavemente para empurrar os testículos através do corte no exoesqueleto (Figura 2).
   2. Usando a pinça, coloque os testículos isolados em uma dissecação bem contendo óleo halocarbono.
   3. Se necessário, Ver os testículos sob um microscópio de dissecação. Dividi-los em pedaços menores, usando pinça pontas fina, removendo qualquer gordura cobrindo os testículos e usar fórceps pontas fina para separar os testículos (Figura 3A e 3B). Espalhe o conteúdo de testículos sob o óleo, na superfície da lamela (Figura 3).
   4. Espalhe o conteúdo de testículos até a porção de propagação do testículo é pouco perceptível aos olhos (Figura 3). Use poços adicionais dissociação carregados de óleo se necessário.

2. micromanipulação

1. Produção do microneedle
   1. Coloque uma extremidade de um tubo de vidro (0,85 mm de diâmetro exterior, 0.65 mm de diâmetro interno) na chama de um bico de Bunsen. Puxe a extremidade do tubo de vidro de tal forma que é formado um ângulo de 150°, e uma área estendida do tubo de vidro estreito é criada. Quebre a tubulação na região fina para que a região fina, estendendo-se desde o ângulo é aproximadamente 10 mm de comprimento (Figura 4A).
   2. Usando um microforge (ou feitos sob medida de acordo com Powell²⁷ ou comercialmente disponíveis-consulte Tabela de materiais), toque na ponta da agulha para o fio de platina quente para derreter o vidro na ponta vidro. Forma um ângulo de aproximadamente 45° entre a agulha e o fio de platina da microforge (Figura 4B). Puxe o vidro do fio quente, enquanto a interrompê-lo para o fio, formando uma ponta fina de ≤1.5 milímetros na extremidade da agulha vidro.
      Nota: O diâmetro de ponta será difícil de medir, mas uma ponta deste comprimento é susceptível de produzir uma agulha firme, mas flexível que será apropriada para micromanipulação. Alternativamente, um puxador de micropipeta poderia ser usado para criar o tubo de vidro com um diâmetro de ponta adequada (o experimentador terá que testar diferentes receitas puxa para produzir um microneedle apropriadamente firme, mas flexível para o trabalho). A agulha pode ser colocada num suporte que é dado forma similarmente para a manipulação de agulha criada de acordo com o método descrito acima.
2. Posicionamento do micromanipulador
   1. O slide preparado no palco de um microscópio de contraste de fase invertida, de lugar. Encontrar as células em divisão e centralizá-las no campo de visão. Concentre-se nas células usando a ampliação mais reduzida possível.
      Nota: Usamos um objectivo de contraste de fase X 16.
   2. Coloque o microneedle no suporte de agulha sobre o micromanipulador.
   3. Manualmente, posicione o microneedle no caminho de luz do microscópio, para que a ponta da agulha é iluminada pela luz (Figura 5B).
   4. Focar o microscópio vários aviões focais acima do plano em que as células mentem.
   5. Reposicione o microneedle usando o controlador de joystick em uma baixa sensibilidade várias vezes para encontrar a sombra da agulha no X - e y-Axes. Continue a reajustar a posição até que a posição da ponta é visível. Ajuste a posição da agulha ao longo do eixo z até a ponta da agulha está em foco.
   6. Mudar o foco sobre as células e, em seguida, focar o microscópio acima do plano de celular para que as células são apenas fora de foco e invisível. Reajuste a posição da agulha para que sua ponta está em foco neste plano focal.
   7. Ajuste a ampliação do microscópio, conforme necessário.
      Nota: Utilizamos um objectivo de contraste de fase de abertura numérica (NA) 100 X 1.4 para a micromanipulação.
   8. Depois focando as células com o objectivo de maior ampliação, focar novamente o microscópio acima do plano de celular para que as células são apenas fora de foco e invisível. Usando uma definição de maior sensibilidade, reajuste a posição da agulha para que sua ponta está em foco e centrado no plano focal acima do plano em que as células mentem.
   9. Mudar o foco sobre as células, ajustando a sua posição, então eles permanecem no centro do campo de visão. A agulha está agora pronta para a micromanipulação.
3. Micromanipulação de cromossomos
   1. Usando a mesma configuração de sensibilidade quanto o bom posicionamento em uma ampliação alta, use o joystick para controlar o microneedle e intimidar os cromossomos dentro da célula. Mantenha a ponta da agulha acima do plano das células.
   2. Para puxar ou mover um cromossomo, focar um cromossomo perto do topo da célula.
      Nota: Esses cromossomos são mais fáceis de manipular-manipulando cromossomos perto de que lamela torna provável que a agulha vai moer em lamela, estourando a célula e acabar com o experimento.
   3. Ajuste do eixo z no joystick para trazer a ponta da agulha em foco e então mover a agulha de ponta com o joystick em X e Y. Coloque a ponta da agulha diretamente no cromossomo para ser manipulado e empurrá-lo na direção desejada para permitir que o manipulador para o repositi no cromossomo.
   4. Dependendo de quão longe o cromossomo é empurrado, ou aplicar uma tensão para o cromossomo ou aplicar uma tensão suficiente para desanexar um cromossomo do eixo. Uma vez que um cromossomo é removido de um eixo, colocá-lo em qualquer lugar dentro da célula.

Resultados

A Figura 6 mostra uma micromanipulação de amostra de 2 espermatócitos primários de gafanhoto adjacentes em vários exemplos dos possíveis usos de micromanipulação. Esta experiência foi feita usando um microscópio de contraste de fase invertida,. A 0:00 (tempos mostrados estão em min:s) imagem mostra ambas as células antes da manipulação. Um cromossomo na célula inferior é mostrado sob tensão aplicada pela agulha micromanipulação (0:05; preto...

Discussão

Com a prática, a se mover cromossomos na célula pode se tornar segunda natureza. Agulhas que são suficientemente rígida e suficientemente fina com ponta são difíceis de "pegar o jeito de" fabricando, mas essa capacidade também vem com a prática. Agulhas, que são tão finas que eles deformam quando mudei o óleo halocarbono não será útil para empurrar os cromossomos na célula. Agulhas, que são tão blunt que suas dicas são visíveis e tão grande como 1/3 da largura de um cromossoma (ou maior) é muito prov...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300