Mikromanipulation von Chromosomen in Insekten Spermatozyten

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir die Auswahl und Vorbereitung der entsprechenden Zellen für Mikromanipulation und den Einsatz von piezoelektrischen Mikromanipulator Chromosomen in den Zellen neu zu positionieren.

Zusammenfassung

Die Mikromanipulation Chromosomen hat eine wesentliche Methode zur Beleuchtung des Mechanismus zum Chromosom Congression Spindel Checkpoint und Anaphase Chromosom Bewegungen, und wurde Schlüssel zum Verständnis, was Chromosom Bewegungen steuert während der Zellteilung. Eine erfahrene Biologe können einem Mikromanipulator um Chromosomen von der Spindel, um Chromosomen innerhalb der Zelle neu zu positionieren und Chromosomen mit Hilfe einer kleinen Glas-Nadel mit einer sehr feinen Spitze Kräfte zuweisen zu lösen. Während Störungen an Chromosomen, die mit anderen Methoden wie optische fallen und andere Verwendungen von einem Laser vorgenommen werden können, kann bisher keine andere Methode der Neupositionierung der zellulären Komponenten auf der Skala der Dutzende bis Hunderte von Mikron mit wenig bis keine Beschädigung der Zelle .

Die Auswahl und Vorbereitung der entsprechenden Zellen für die Mikromanipulation der Chromosomen, die Vorbereitung der Heuschrecke und Cricket Spermatocyte Primärkulturen für den Einsatz in live Cell Imaging und Mikromanipulation, genau beschreiben hier beschrieben. Darüber hinaus zeigen wir den Aufbau einer Nadel verwendet werden für das Verschieben von Chromosomen innerhalb der Zelle und die Verwendung von einem Joystick gesteuerte piezoelektrischen Mikromanipulator mit einer glasnadel attached to it. Chromosomen innerhalb teilenden Zellen neu zu positionieren. Ein Beispielergebnis zeigt die Verwendung von einem Mikromanipulator, ein Chromosom von einer Spindel in eine primäre Spermatocyte zu lösen und das Chromosom innerhalb der Zelle neu zu positionieren.

Einleitung

Mikromanipulation hat Teile des Mechanismus für ein Chromosom Congression Spindel Checkpoint und der Anaphase Chromosom Bewegungen ergeben. Die früheste Publikation beschreibt die Ergebnisse der Mikromanipulation Experimente wurde von Robert Chambers¹. Kammern verwendet eine mechanische Mikromanipulator mit einer angehängten glasnadel das Zytoplasma einer Reihe von verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Leider fehlten Kontrastverfahren, die erlaubt die Visualisierung der Chromosomen und viele andere Zellbestandteile in lebenden Zellen zum Zeitpunkt Chambers Experimente zeigen nicht die Auswirkungen der Neupositionierung solche Zellkomponenten. Frühe Micromanipulations, die die Chromosom-Position verändert verwendet den Kammern Apparat um zu fegen die Spindel Midzone in Anaphase Zellen zeigen, dass solche Manipulationen die Position des Chromosom Arme in Anaphase Heuschrecke Neuroblasten^{2 verändern könnte} . Nicklas und seine Mitarbeiter waren die ersten, feine Micromanipulations der Chromosomen, durchführen, Dehnung der Chromosomen³, trennen sie von der Spindel und induzieren eine Neuorientierung^3,4, Stabilisierung eine Malorientation durch die Anwendung Spannung auf den Chromosomen^5,6,7, und Messung der Kräfte von Spindeln in Anaphase^8,9produziert. Andere Arbeiten von Nicklas Labor zeigte, dass zytoplasmatischen Granulat auch manipulierte¹⁰ sein könnte und zentrosomen durch Mikromanipulation¹¹neu positioniert werden können. Mikromanipulation eignet sich nicht nur zum Verschieben von Chromosomen und anderen zellulären Komponenten. Mikromanipulation Nadel kann durch eine mitotische Spindel in Demembranated Zellen¹² sauber geschnitten oder Auflösen der Kernhülle¹³eingesetzt werden. Darüber hinaus können benachbarte Zellen durch Mikromanipulation^14,15fusioniert werden.

Mit einer Vielzahl von interessanten Experimenten, die getan werden kann mit Mikromanipulation ist es auf den ersten Blick verwunderlich, dass sehr wenige Chromosom Biologen Mikromanipulation Experimente geleistet haben. Ein Grund für diesen Mangel ist, dass mitotically teilenden kultivierten Zellen, die fest gefügten Gewebe abgeleitet sind und sind weit verbreitet für das Studium Chromosom Bewegungen extrem schwer zu Micromanipulate sind. Diese Gewebekultur Zellen haben in der Regel eine kortikale Zytoskelett, dass "wird in der Weise" von der Mikromanipulation Nadel, und Chromosomen entweder nicht durch die Nadel erreichbar oder die Nadel durch die Zelle, was zu einer Zelle Bruch und Tod schleift. Wir und andere Experimentatoren, die Mikromanipulation, verwenden fanden Arthropoden Zellen Mikromanipulation zugänglich sein. Arthropoden Spermatozyten sind leicht unter einer Schicht von Öl Halocarbon verbreiten und scheinen eine viel weniger robust kortikalen Zytoskelett zugrunde liegt der Zellmembran während einer Zellteilung haben. So Arthropoden Hoden bieten eine gute Quelle von meiotically teilenden Zellen (Spermatozyten) und mitotically teilenden Zellen (Spermatogonien) mit leicht zugänglichen Chromosomen für Mikromanipulation. Eine serielle Schnitt eine Heuschrecke Spermatocyte während einer Manipulation ergeben, daß die Nadel dringt nie in der Zellmembran. die Zellmembran verformt sich um die Nadel (Nicklas r.b., persönliche Mitteilung). Spermatozyten aus einer Reihe von Insekten und Spinnen Taxa wurden Micromanipulated, einschließlich Heuschrecken, Betenden Mantiden, Fruchtfliegen, Schnaken, Grillen, schaumzirpen, Motten, Schwarze Witwe Spinnen, Keller Spinnen und Orb-Weben Spinnen ^{erfolgreich 3,7,17,18,19,20,21,22}. Kultivierte und mitotically teilenden Zellen von Insekten können Micromanipulated sein. Zum Beispiel haben die Chromosomen in Grasshopper Neuroblasten in eine Primärkultur Chromosomen, die leicht Micromanipulated^2,23sein können. Wir vermuten, dass die verfügbaren Linien abgeleitet von Drosophila kultiviert und andere Insekten auch Micromanipulatable werden, obwohl die Technik mit diesen Zellen haben wir nicht getestet haben. Wir zeigen Ihnen, wie teilender Zellen, die aus Heuschrecken und Grillen auf einem Mikromanipulation vorbereitet werden kann. Grillen sind leicht von den meisten Zoohandlungen zu jeder Zeit des Jahres zu erhalten. Heuschrecken sind nur im Sommer leicht erhältlich, es sei denn, der Forscher Zugang zu einer Labor-Kolonie hat, aber Tierspezies (Melanoplus Sanguinipes) leicht Zellen und Chromosomen lange, leicht zu manipulieren abgeflachte hat.

Ein weiterer Grund warum Mikromanipulation Experimente von einer Handvoll von Biologen gemacht wurden ist, dass Mikromanipulatoren, die Chromosomen gut bewegen auf dem Markt nur selten zur Verfügung stehen. Wir haben festgestellt, dass ein Joystick gesteuerte piezoelektrischen Mikromanipulator die Nadelbewegung ohne Vibration, Drift oder Verzögerung zwischen der Joystick und die Nadelbewegung steuert, aber andere Arten von Manipulatoren können auch erfolgreich Chromosomen schieben um in der Zelle. Die Mikromanipulatoren, entworfen von Ellis und Begg^25,26 sind ideal für die Mikromanipulation Chromosomen, wenn sie älteren Technologie nutzen. Piezoelektrische Mikromanipulatoren sind derzeit verfügbar und häufig verwendete in Elektrophysiologie; Diese Mikromanipulatoren sind jedoch nicht in der Regel Joystick gesteuert. Joystick-Steuerung ist der Schlüssel zu den geschmeidigen Bewegungen für eine erfolgreiche Mikromanipulation erforderlich, und so sollte ein benutzerdefinierte Joystick zu den derzeit verfügbaren piezoelektrischen Mikromanipulatoren für ein Chromosom Mikromanipulation Arbeiten konstruiert werden. Der Joystick gesteuerte piezoelektrischen Mikromanipulatoren, die beste Arbeit haben direkte Lageregelung, in dem die Bewegung des Joysticks direkt auf eine Nadelbewegung übersetzt.

Eine neu gestaltete piezoelektrischen Mikromanipulator aus handelsüblichen teilen, die leicht ausgetauscht werden können und einige kleine 3-d-gedruckten Komponenten konstruiert werden kann, und es funktioniert gut für Chromosom Mikromanipulation²⁴. Der Mikromanipulator hat einstellbare Empfindlichkeit, manuelle grobe Positionierung und keine Vibration, Drift oder Verzögerung in der Nadelbewegung und direkte Positionskontrolle der Nadel. Wissenschaftler können die Defekte mit Anweisungen zur Verfügung Online-²⁴konstruieren. Im folgenden sind die Methoden für die Vorbereitung einer primären Spermatocyte Zellkultur und für Micromanipulating der Chromosomen in den Zellen in dieser Kultur.

Protokoll

1. Vorbereitung der primären Insekt Spermatocyte Zellkultur Mikromanipulation

1. Schieben Sie Vorbereitung
   1. Erhalten Sie einen 75 mm x 25 mm-Objektträger mit einem 20 mm Durchmesser rundes Loch in der Mitte der Folie ausgeschnitten.
      Hinweis: Diese wurden aus einem einzigen Blatt von Fensterglas auf die Größe von einem Objektträger mit einem Loch in der Mitte geschnitten.
   2. Ein 25 x 25 mm #1.5-Deckglas durchlaufen einen Bunsenbrenner Flamme für 2 s.
   3. Vakuum Fett rund um den Rand des Lochs in der gläsernen Objektträger auftragen
   4. Legen Sie das Deckglas auf das Loch wie in Abbildung 1. Drücken sie die Taste und stellen Sie sicher, eine gute Abdichtung zu bilden.
   5. Drehen Sie den Objektträger und füllen Sie die Dissektion Halocarbon Öl gut ein.
2. Spermatocyte Kultur Vorbereitung für die Anzeige am Mikroskop
   Hinweis: Hier beschreiben wir die Art der Kultur-Zubereitung mit Heuschrecke oder Kricket Zellen. Hoden-Inhalte von anderen Arthropoden können mit einer ähnlichen Methode kultiviert werden.
   1. Subadulte männliche Grillen (oder Heuschrecken) erhalten. Legen Sie eine lebende Insekt im Kühlschrank für ca. 2 min um Kälte-betäuben. Mit sezierenden Schere, schnell Durchtrennen der dorsalen Oberfläche parallel zur Längsachse des Bauches direkt hinter dem Flügel Knospen. Manuell drücken Sie den Bauch sanft um die Hoden durch den Schnitt in das Exoskelett (Abbildung 2) drücken.
   2. Mit Pinzette, legen Sie die isolierten Hoden in eine Dissektion auch Halocarbon ölhaltigen.
   3. Bei Bedarf die Hoden unter dem Mikroskop sezierenden Blick. Teilen Sie diese in kleinere Stücke mit feinen Spitzen Pinzette entfernen Fett für die Hoden und verwenden Sie feine Spitzen Pinzette zum Aufbrechen der Hoden (Abbildung 3A und 3 b) zu. Verbreiten Sie die Hoden Inhalte unter das Öl auf der Oberfläche des Deckglases (Abbildung 3).
   4. Die Hoden-Inhalte zu verbreiten, bis die Ausbreitung Teil der Hoden kaum spürbar auf die Augen (Abbildung 3 ist). Bei Bedarf verwenden Sie zusätzliche Öl beladenen Dissoziation Brunnen.

(2) Mikromanipulation

1. Produktion von der microneedle
   1. Platzieren Sie ein Ende aus einer Glasröhre (0,85 mm Außendurchmesser, 0,65 mm Innendurchmesser) in der Flamme einen Bunsenbrenner. Ziehen Sie das Ende von der Glasröhren derart, dass ein Winkel von 150° gebildet wird, und ein erweiterter Bereich von engen Glasröhren entsteht. Brechen Sie den Schlauch in der dünnen Region, so dass die dünne Region erstreckt sich von der Winkel ca. 10 mm lang (Abb. 4A ist).
   2. Mit einem Microforge (entweder entsprechend Powell²⁷ nach Maß oder im Handel erhältlich-siehe Tabelle der Materialien), berühren Sie die Spitze der glasnadel, um die heißen Platindraht, das Glas an der Spitze zu schmelzen. Form einer ca. 45° Winkel zwischen der Nadel und der Platindraht Microforge (Abbildung 4 b). Ziehen Sie das Glas von der heiße Draht beim Absperren der Hitze auf den Draht, bilden eine dünne Spitze von ≤1.5 mm am Ende der glasnadel.
      Hinweis: Der Kopfkreis werden schwer zu messen, aber ein Trinkgeld von dieser Länge wird voraussichtlich eine feste, aber flexible Nadel zu produzieren, die für Mikromanipulation geeignet ist. Alternativ könnte ein Mikropipette Abzieher Glasröhren mit einer entsprechenden Spitzendurchmesser erstellen (der Experimentator müssen verschiedene ziehen Rezepte zur Herstellung eine angemessene feste, aber flexible Microneedle für den Job testen) verwendet werden. Die Nadel kann in einem Halter platziert werden, die zur Manipulation Nadel nach dem oben beschriebenen Verfahren erstellt ebenso geprägt ist.
2. Positionierung der Mikromanipulator
   1. Legen Sie die vorbereitete Folie auf der Bühne von einem inversen, Phasenkontrast-Mikroskop. Die teilenden Zellen zu finden und in das Blickfeld zu zentrieren. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen mit den niedrigsten Vergrößerung möglich.
      Hinweis: Wir haben ein 16 X Phasenkontrast-Ziel.
   2. Legen Sie die Microneedle in den Nadelhalter auf dem Mikromanipulator.
   3. Manuell positionieren Sie die Microneedle im Strahlengang des Mikroskops, so dass die Spitze der Nadel durch das Licht (Abb. 5 b) beleuchtet wird.
   4. Konzentrieren Sie dem Mikroskop mehrere fokale Flugzeuge über der Ebene, in der die Zellen liegen.
   5. Positionieren Sie die Microneedle mit dem Joystick Controller bei einer niedrigen Empfindlichkeit mehrmals, den Schatten der Nadel in der x- und Y-Achse zu finden. Weiter, die Position zu korrigieren, bis die Position der Spitze sichtbar ist. Passen Sie die Position der Nadel entlang der z-Achse, bis die Nadelspitze im Fokus ist.
   6. Auf die Zellen zu konzentrieren Sie, dann konzentrieren Sie die Lupe über der Zelle Ebene, so dass Zellen nur unscharf und unsichtbar sind. Passen Sie die Position der Nadel, so dass seine Spitze im Fokus in diesem Brennebene ist.
   7. Passen Sie die Vergrößerung des Mikroskops nach Bedarf an.
      Hinweis: Wir haben ein 100 X 1.4 numerische Apertur (NA) Phasenkontrast-Ziel für die Mikromanipulation.
   8. Nach dem fokussieren auf die Zellen mit höherer Vergrößerung Ziel, wieder konzentrieren Sie das Mikroskop über der Ebene der Zelle, so dass die Zellen nur unscharf und unsichtbar sind. Verwenden eine höhere Empfindlichkeit, die Position der Nadel neu stellen Sie damit seine Spitze im Mittelpunkt steht und in der Brennebene über der Ebene zentriert, in der die Zellen liegen ein.
   9. Auf die Zellen, deren Position anpassen, so sie in der Mitte des Sichtfeldes bleiben zu konzentrieren. Die Nadel ist nun bereit für die Mikromanipulation.
3. Mikromanipulation der Chromosomen
   1. Mit der gleichen Einstellung der Empfindlichkeit für die Feinpositionierung bei hoher Vergrößerung, den Joystick zur Steuerung der Microneedle und herumschieben der Chromosomen der Zelle verwenden. Halten Sie die Spitze der Nadel über der Ebene der Zellen.
   2. Ziehen oder verschieben ein Chromosoms im Fokus eines Chromosoms am oberen Rand der Zelle.
      Hinweis: Diese Chromosomen sind leichter zu manipulieren-Manipulation Chromosomen nah an, dass das Deckglas macht es wahrscheinlich, dass die Nadel wird in das Deckglas, Platzen der Zelle und endet das Experiment zu mahlen.
   3. Passen Sie die z-Achse auf dem Joystick bringen die Nadelspitze in den Fokus, und gehen Sie dann die Nadel tip mit dem Joystick in X und Y. setzen Sie die Spitze der Nadel direkt auf dem Chromosom manipuliert werden und schieben es in die gewünschte Richtung um den Manipulator zu Repositi zu ermöglichen auf dem Chromosom.
   4. Je nachdem, wie weit das Chromosom geschoben wird das Chromosom Spannung zuweisen, oder genügend Spannung um ein Chromosom von der Welle lösen. Sobald ein Chromosom von einer Spindel entfernt wird, legen Sie sie überall innerhalb der Zelle.

Ergebnisse

Abbildung 6 zeigt ein Beispiel Mikromanipulation von 2 benachbarten Grasshopper primären Spermatozyten in mehrere Beispiele für die Einsatzmöglichkeiten der Mikromanipulation. Dieses Experiment wurde durchgeführt mit Hilfe einer inversen, Phasenkontrast-Mikroskop. Die 0:00 (angezeigten Uhrzeiten sind in Min: s) Bild zeigt beide Zellen vor der Manipulation. Ein Chromosom in die untere Zelle zeigt unter Spannung durch die Mikromanipulation Nadel (0:05; schw...

Diskussion

Mit etwas Übung kann die Chromosomen in der Zelle bewegen zweiten Natur geworden. Nadeln, ausreichend steif und ausreichend dünn-Kreissägeblätter sind schwer zu "den Dreh raus zu bekommen" fabrizieren, aber diese Fähigkeit kommt auch mit der Praxis. Nadeln, die so fein sind, dass sie sich verformen, wenn im Öl Halocarbon verschoben werden nicht für den Druck von Chromosomen in der Zelle. Nadeln, die so stumpf, dass ihre Tipps sichtbar sind und so groß wie 1/3 der Breite eines Chromosoms (oder größer) sehr wahrs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300