Микроманипуляции хромосом в насекомое Spermatocytes

Резюме

В этом протоколе мы описываем, отбора и подготовки соответствующих клеток для микроманипуляции и использование пьезоэлектрической микроманипулятор для перемещения хромосом в этих ячейках.

Аннотация

Микроманипуляции хромосом был важным метод для освещения механизм congression хромосомы, шпиндель контрольно-пропускной пункт и анафазе хромосома движений и был ключом к пониманию, что контролирует движения хромосома во время деления клеток. Опытный биолог можно использовать микроманипулятор для отсоединения хромосомы от шпинделя, чтобы переместить хромосом в клетке и для применения силы к хромосом, с помощью небольшой стеклянный иглу с очень тонкой кончиком. Хотя возмущения могут быть хромосом, используя другие методы, такие как оптические треппинга и других видов использования лазера, до сих пор никакой другой метод позволяет репозиционирования клетчатых компонентов в масштабах от десятков до сотен микрон с практически никаких повреждений в ячейку .

Отбор и подготовка соответствующих клеток для микроманипуляции хромосом, специально описания подготовки первичных культур кузнечик и крикет Сперматоцит для использования в клеток и микроманипуляции, являются описанные здесь. Кроме того мы показываем строительство иглу использоваться для перемещения хромосом внутри клетки и использование джойстика контролируемые пьезоэлектрические микроманипулятор с иглой стекла, прилагается к нему для перемещения хромосом в делящихся клеток. Результат образец показывает использование микроманипулятор для отсоединения хромосомы от шпинделя в первичных Сперматоцит и переместить что хромосом в клетке.

Введение

Микроманипуляции показал частями механизма для congression хромосомы, шпиндель контрольно-пропускной пункт и анафазе хромосома движений. Ранние публикации, описывающие результаты экспериментов микроманипуляции был Роберт палат¹. Камеры используются механические микроманипулятор с прилагаемый стеклянный иглу зонда в цитоплазму целого ряда различных типов клеток. К сожалению контраст методы, которые позволили визуализации хромосом и многих других клеточных компонентов в живых клетках не были доступны в то время, поэтому эксперименты камер не смогли показать последствия перемещения таких клеточных компонентов. Ранние micromanipulations, которые изменили положения хромосомы используется аппарат палат для шпинделя midzone в анафазе клеток, показаны, что такие манипуляции могут изменить положение хромосома оружия в анафазе кузнечик нейробласты² . Никлас и его сотрудники первыми выполнять тонкой micromanipulations хромосом, растяжения хромосом³, отделение их от шпинделя и вызывая переориентацию^3,4, стабилизации malorientation, применяя напряженности в хромосомы^5,6,7и измерения силы, производимые шпинделей в анафазе^8,9. Другие работы в лаборатории Никлас показал, что цитоплазматических гранул также можно манипулировать¹⁰ и что большое может быть приложена микроманипуляции¹¹. Микроманипуляции является не только полезным для перемещения хромосом и других клеточных компонентов. Микроманипуляции иглой можно аккуратно прорезать митотического веретена demembranated клетки¹² или может быть использован для растворения ядерная оболочка¹³. Кроме того смежные ячейки может быть сплавленных микроманипуляции^14,15.

С такой широкий спектр интересных экспериментов, которые можно сделать с помощью микроманипуляции, это на первый взгляд удивительно, что микроманипуляции эксперименты сделали очень мало биологов хромосомы. Одна из причин для этого недостатка является чрезвычайно трудно micromanipulate mitotically деления культивировали клетки, которые являются производными от позвоночных тканей и обычно используются для изучения движения хромосомы. Эти клетки культуры ткани, как правило, имеют корковых цитоскелета, что «попадает в пути» из микроманипуляции иглы и хромосомы либо не может быть достигнуто иглы или иглы перемалывает через клетку, ведущей к ячейке и смертью. Мы и других экспериментаторов, которые используют микроманипуляции, нашли членистоногих клетки поддаются микроманипуляции. Членистоногих сперматоцитах легко распространяться под слоем нефти галоидоуглеводородов и представляется гораздо менее надежные корковых цитоскелета, лежащие в основе клеточной мембраны при делении клеток. Таким образом членистоногих яички обеспечивают хороший источник meiotically деления клеток (сперматоцитах) и mitotically деления клетки (сперматогонии) с легко доступными хромосом для микроманипуляции. Серийный секционирование кузнечик Сперматоцит фиксированной во время манипуляции показали, что игла не проникает клеточной мембраны; клеточной мембраны деформирует вокруг иглы (Никлас р.б., личное сообщение). Сперматоцитах от ряда насекомых и пауков таксонов были micromanipulated успешно, включая кузнечики, молиться богомола, плодовых мух, кран мух, сверчков, spittlebugs, моли, пауки Черная вдова, погреб пауков и шар ткачество пауков ^{3,7,,1718,19,20,21,22}. Культурный, mitotically деления клетки от насекомых может быть micromanipulated. К примеру хромосомы в кузнечик нейробласты в первичной культуре имеют хромосом, которые могут быть легко micromanipulated^2,23. Мы подозреваем, что имеющиеся культивированный линии, производные от дрозофилы и других насекомых также будет micromanipulatable, хотя мы не проверял технику с этими клетками. Мы покажем, как делящиеся клетки от кузнечиков и сверчков может быть подготовлен для микроманипуляции. Сверчки легко получить из большинство зоомагазинов в любое время года. Кузнечики только легко доступный в летнее время, если исследователь имеет доступ к лаборатории колонии, но видов, используемых (Melanoplus sanguinipes) легко плоские клетки и длинный, легко манипулировать хромосом.

Еще одна причина, почему микроманипуляции эксперименты сделали небольшое биологов, что микроманипуляторы, которые хорошо двигаться хромосом редко доступны на рынке. Мы нашли, что джойстик контролируемые пьезоэлектрические микроманипулятор управляет движением иглу без вибрации, дрейф, или запаздывания между движением джойстика и движение иглы, но другие виды манипуляторов также успешно могут подтолкнуть хромосом вокруг в ячейке. Микроманипуляторы, разработанный Эллис и Бегг^25,26 идеальны для микроманипуляции хромосом, хотя они используют старую технологию. Пьезоэлектрические микроманипуляторы, в настоящее время доступны и широко используется в электрофизиологии; Однако эти микроманипуляторов не обычно управляется джойстиком. Джойстик управления является ключом к гладкой движений, необходимых для успешного микроманипуляции, и сконструирована пользовательских джойстик для имеющихся в настоящее время пьезоэлектрические микроманипуляторы работать для микроманипуляции хромосомы. Джойстик контролируемые пьезоэлектрические микроманипуляторы, которые работают лучше всего иметь прямое положение элемента управления, в котором движения джойстика приводит непосредственно к движению иглы.

Недавно разработанных пьезоэлектрический микроманипулятор могут быть построены из коммерчески доступных частей, которые могут быть легко заменены и от некоторых небольших 3-D печатных компонентов, и она работает хорошо для хромосома микроманипуляции²⁴. Микроманипулятор регулируемая чувствительность, ручной грубого определения координат и не имеет вибрации, дрейф или отставание в движение иглы и контроля прямого положения иглы. Ученые могут построить микроманипулятор, с помощью инструкции доступны онлайн²⁴. Ниже приведены методы для подготовки первичной Сперматоцит клеточной культуры и micromanipulating хромосом в клетках в этой культуре.

протокол

1. Подготовка первичных насекомых Сперматоцит клеточной культуры для микроманипуляции

1. Подготовка слайдов
   1. Получите стеклянное скольжение 75 мм x 25 мм с круглым отверстием диаметром 20 мм вырезают в центр слайда.
      Примечание: Эти были вырезаны из одного листа стекла размера слайда стекла с отверстием в центре.
   2. Запуск coverslip 25 мм x 25 мм #1.5 через пламя горелки Бунзена 2 s.
   3. Применение вакуумного жир вокруг края отверстия в стеклянное скольжение
   4. Место coverslip на отверстие, как показано на рисунке 1. Нажмите ее и убедитесь в том сформировать герметичное уплотнение.
   5. Флип стеклянное скольжение и хорошо залить рассечение галоидоуглеводородов масло.
2. Сперматоцит культура подготовка для просмотра на Микроскоп
   Примечание: Здесь мы описываем метод подготовки культуры с использованием клеток кузнечик или крикет. Яички содержимое других членистоногих может культивируемых с помощью аналогичного метода.
   1. Получения неполовозрелых особей мужского пола сверчки (или кузнечики). Место в холодильнике около 2 мин до холодной анестезировать живых насекомых. С использованием рассечения ножницы, быстро прорваться через спинной поверхности параллельно длинной оси живота прямо позади крыла почки. Вручную протиснуться живота осторожно, чтобы подтолкнуть яички через разрез в экзоскелет (рис. 2).
   2. С помощью щипцов, место изолированные яичек в рассечение, также содержащие галоидоуглеводородов масло.
   3. При необходимости просмотрите яичек под микроскопом рассечения. Разделите их на более мелкие куски, используя штраф отметил пинцет, удаление любого жира, охватывающих яички и использовать штраф отметил пинцет сломать вверх семенников (Рисунок 3А и 3Б). Распространение содержимого яичек под нефть, на поверхности coverslip (рис. 3 c).
   4. Распространять содержимое яичек, до тех пор, пока часть спреда яички едва заметно для глаз (рис. 3 c). При необходимости используйте дополнительные загрузки нефти диссоциации скважин.

2. микроманипуляции

1. Производство микроиглы
   1. Поместите один конец трубки стеклянные (0,85 мм Наружный диаметр, 0,65 мм внутренний диаметр) в пламени горелки Бунзена. Вытяните конец стеклянных трубок таким образом, что 150° угол образуется, и создается расширенная область узкая стеклянных трубок. Разорвать трубы в регионе тонкой, так, что тонкий области, простирающейся от угол приблизительно 10 мм (рис. 4A).
   2. С помощью microforge (на заказ согласно Пауэлл²⁷ или коммерчески доступных смотрите Таблицу материалы), Сенсорный кончик стекла к горячий провод платины для плавления стекла на кончике иглы. Формы примерно 45° угол между иглой и провод платины microforge (рис. 4В). Потяните стекла от горячей проволоки, а отключение тепла на проволоку, образуя тонкий кончик канал мм на конце иглы стекла.
      Примечание: Диаметр кончика будет трудно измерить, но подсказка эта длина может производить твердая, но гибкая игла, которая будет подходящим для микроманипуляции. Кроме того микропипеткой съемник может использоваться для создания стеклянных трубок с соответствующим наконечник диаметром (экспериментатор будет иметь для проверки различных потянув рецептов для получения надлежащим образом фирмы, но гибкий микроиглы на работу). Иглы могут быть помещены в держатель, который формируется аналогично для манипуляции иглы, созданный согласно описанным выше способом.
2. Позиционирование микроманипулятор
   1. Место подготовленные слайд на сцене перевернутый, фазово контрастной микроскопа. Найти деления клеток и центр их в поле зрения. Сосредоточиться на клетки, используя низкий масштаб можно.
      Примечание: Мы использовали 16 X фазово контрастной цели.
   2. Место микроиглы в иглодержатель на микроманипулятор.
   3. Вручную положение микроиглы на свет пути микроскопом так, что кончик иглы освещается светом (Рисунок 5B).
   4. Фокус Микроскоп несколько фокальной плоскости выше плоскости, в котором клетки лежат.
   5. Изменить положение микроиглы, с помощью джойстика на низкой чувствительностью несколько раз найти тень иглы в X - и y. Продолжать корректировать позицию до тех пор, пока положение кончика видна. Отрегулируйте положение иглы вдоль оси z, до тех пор, пока кончик иглы находится в фокусе.
   6. Переориентировать на клетки, а затем сосредоточить Микроскоп выше плоскости клетки, так что клетки не в фокусе и невидимым. Скорректировать положение иглы, так что его оконечности находится в фокусе в этой фокальной плоскости.
   7. При необходимости измените масштаб микроскопа.
      Примечание: Мы использовали 100 X 1.4 числовой апертуры (NA) фазово контрастной цель для микроманипуляции.
   8. После сосредоточения на клетки, используя цель увеличение, снова сосредоточиться Микроскоп выше плоскости клетки так, что клетки являются просто не в фокусе и невидимым. Используя выше чувствительность, скорректировать положение иглы, так что его оконечности находится в фокусе и сосредоточены в фокальной плоскости выше плоскости, в котором клетки лежат.
   9. Переориентировать на клетки, регулируя их позиции, так что они остаются в центре поля зрения. Игла для микроманипуляции теперь готов.
3. Микроманипуляции хромосом
   1. Используя те же настройки чувствительности для тонкой позиционирования с высоким увеличением, используйте джойстик для управления микроиглы и нажимаем хромосомы внутри клетки. Держите кончик иглы выше плоскости клеток.
   2. Тяните или переместить хромосомы, сосредоточиться на хромосоме в верхней части клетки.
      Примечание: Эти хромосомы являются легче манипулировать манипулирования хромосомы близко к coverslip делает вероятным, что игла будет измельчить в coverslip, разрывая ячейки и заканчивая эксперимент.
   3. Отрегулируйте оси z на джойстик для приведения кончик иглы в фокус, а затем переместите иглы наконечник с джойстиком в X и Y. Поместите кончик иглы непосредственно на хромосоме манипулировать и вставьте его в нужном направлении, чтобы позволить манипулятор для repositi на хромосоме.
   4. В зависимости от того, насколько помещается хромосоме либо обратиться хромосомы напряженности или применить достаточное натяжение для отсоединения хромосомы от шпинделя. После того, как хромосомы удаляется из шпинделя, в любое место в пределах ячейки.

Результаты

На рисунке 6 показан пример микроманипуляции 2 смежных кузнечик первичных сперматоцитах в несколько примеров возможного использования микроманипуляции. Этот эксперимент было сделано с помощью инвертированного, фазово контрастной микроскопа. 0:00 (вре?...

Обсуждение

С практикой передвижение хромосом в клетке может стать второй натурой. Иглы, которые являются достаточно жесткой и достаточно тонким наконечником трудно «получить умение» фабрикацией, но эта способность также приходит с практикой. Иглы, которые так хорошо, что они деформируются при пе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300