Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

Resumen

Aquí describimos un procedimiento para probar la migración la célula en vitro con un microscopio de cámara óptica automatizada. El ensayo de rayado ha sido ampliamente utilizado donde el cierre de la raya es seguido por un período determinado. El microscopio óptico permite la detección confiable y barata de migración de la célula.

Resumen

Migración celular es un proceso importante que influye en muchos aspectos de la salud, como la cicatrización de heridas y el cáncer, y por lo tanto, es crucial para el desarrollo de métodos para el estudio de la migración. El ensayo de rayado ha sido el método más común de en vitro para probar compuestos con propiedades anti y pro migration debido a su bajo costo y simple procedimiento. Sin embargo, un problema a menudo informado del ensayo es la acumulación de células en el borde de la raya. Además, para obtener datos de lo análisis, imágenes de diferente exposición deben tomarse durante un período de tiempo en el mismo lugar exacto para comparar los movimientos de la migración. Programas de análisis diferentes pueden utilizarse para describir el cierre scratch, pero son intensivas en mano de obra, inexacto y las fuerzas de los ciclos de cambios de temperatura. En este estudio, demostramos un método optimizado para probar el efecto de la migración, por ejemplo con las proteínas que ocurren naturalmente humanos y bovinos lactoferrina y su péptido N-terminal Lactoferricin en la línea de células epiteliales HaCaT. Una optimización crucial es lavar y rayar en PBS, que elimina la mencionada acumulación de células en el borde. Esto podría explicarse por la eliminación de cationes, que han demostrado tener un efecto en la conexión de la célula de queratinocitos. Para asegurar la detección real de la migración, previo tratamiento con mitomicina C, un inhibidor de la síntesis de ADN, fue agregado al Protocolo. Finalmente, demostramos la automatizado óptica cámara, que elimina los ciclos de temperatura excesiva, mano de obra con el análisis de cierre scratch, mejora en la reproducibilidad y garantizando el análisis de secciones idénticas de cero con el tiempo.

Introducción

La migración es un proceso importante que influye en varios aspectos fisiológicos. En la cicatrización de heridas, migración facilita la re-epitelización de la piel. En las heridas no cicatrizan, como heridas crónicas, bacterias oportunistas causan infección de la herida, y las heridas abiertas son ideales para el crecimiento de bacterias y formación de biofilm^1,2. Biofilm es una de las causas del desarrollo de bacterias resistentes, que es una de las mayores amenazas a nuestra sociedad moderna³. En la curación de la herida, las células inmunitarias no pueden penetrar el biofilm. En el cáncer, la migración de las células cancerosas es un paso fundamental de la metástasis, que es la principal causa de muerte para los pacientes con tumores sólidos^4,5. Por lo tanto, es crucial poder estudiar la migración.

El ensayo de rayado se utiliza a menudo para probar la migración de la célula porque es barato y fácil de realizar en líneas de células adherentes, tales como fibroblastos endoteliales y células epiteliales líneas^6,7. Hoy en día, existen varios métodos para realizar rayas⁸y diversos materiales se han divulgado para ser utilizado, incluyendo palillos⁹, celular raspadores¹⁰, láseres¹¹y corrientes eléctricas¹². Todos los métodos tienen desventajas y ventajas diferentes, y el método debe ser decidido según la herramienta de análisis, presupuesto y tipo de célula. Por ejemplo, si el tipo de celda utilizado requiere revestimiento, retiro de presión manual, por ejemplo con una punta de palillo de dientes o de la pipeta, influirá en la migración dentro de la zona, se debe usar un método diferente. En este estudio, nos centraremos en raspado manual.

Una desventaja para el raspado manual es la variación del tamaño, las formas de los arañazos y acumulación de células en los bordes del scratch. Existen muchos protocolos, y un papel altamente citado informa aumento de la velocidad o lavar bien después de rayar¹³. Además, se han utilizado varios métodos para reducir al mínimo la proliferación, ya que la proliferación de las células no se puede diferenciar de la migración y por lo tanto puede dar resultados falsos positivos de la migración. Algunos divulgan métodos son hambre suero precede el rasguño¹⁴ y disminuyendo la cantidad de suero¹⁵. Sin embargo, ninguno de estos métodos puede asegurar que no hay ninguna proliferación. Por lo tanto, se presenta un tratamiento previo de las células con el mitomycin C para obtener resultados verdaderos de la migración. La mitomicina C es un antibiótico que inhibe la síntesis de ADN mediante la formación de un enlace covalente con el ADN, lo que impide que el ADN separa¹⁶. Por el tratamiento con mitomicina C y lavar con PBS antes de rayar, el cierre detectado de la brecha muestra la verdadera migración de las células (figura 1).

Una característica de todos los métodos es la necesidad de un sistema para analizar el proceso de migración¹⁷. Común y un método económico para analizar el progreso es usar un microscopio de campo de luz para tomar imágenes de la cero en momentos predeterminados, seguidos de un análisis del cierre de la brecha en un software de imagen^18,19. Este método es lento, poco fiable en cuanto a tomar fotografías en el mismo lugar y el enfoque, y el movimiento de la incubadora a cámara las fuerzas ciclos de cambios de temperatura mientras se toman fotos. Otros métodos se han desarrollado para detectar la migración midiendo el flujo de corriente. Los cambios actuales, como las células cubren más espacio en la placa, que se lee como un aumento en la impedancia²⁰. Mediante la medición de impedancia, no se ve afectado el medio ambiente de las células, y por lo tanto se considera el método no invasivo. Este método se basa en platos especializados con electrodos de oro, que son caros, pero permiten la detección de muchos procesos, como la adhesión celular, proliferación, migración y muerte celular. Una gran desventaja de este método es que la medición de impedancia no indica directamente la migración, como factores como la temperatura tienen un gran impacto en la impedancia. Cambios en la impedancia pueden ser causadas por varios factores que no son revisados por el software, haciendo más difícil el análisis de los datos. Por lo tanto, la falta de visualización requiere un microscopio de luz convencional para verificar la migración.

Para superar muchos de los inconvenientes de las técnicas disponibles, utilizamos una cámara óptica automatizada en tiempo real. La cámara óptica es un sistema de detección con un microscopio de alto rendimiento en una plataforma pequeña con una lente, unidad de iluminación y una cámara digital. Cuenta con un software incorporado, que puede probar la migración y proliferación entre otras cosas. Para detectar la migración, se utilizan dos algoritmos para analizar el crecimiento y la cinética de la migración de las células, que se llaman la proliferación y la cicatrización análisis, respectivamente. El análisis de la proliferación se basa en un algoritmo de segmentación de imagen de dos etapas que se aplica el análisis de textura para detectar la diferencia entre zonas cubiertas de la célula (se muestra en amarillo) y vacío fondo áreas por análisis del histograma avanzado. La cicatrización de análisis se basa en un algoritmo de tres pasos que detecta la monocapa celular, localiza el boquete de la herida y determina el ancho de la brecha. Estos pasos se llevan a cabo en momentos determinados por el usuario y los datos se presentan como área cubierta, distancia y área de boquete. Una de las grandes ventajas de esta máquina es que permite la proyección de imagen de células adherentes a través de líquido debido al ángulo de la cámara²¹. Las imágenes de lenstakes inclinado de cámara que se proyectan a una pila de z de un solo plano z generan para asegurarse de que las fotos son foco (figura 2). pilas de z se generan por la fusión de la serie de fotografías (por ejemplo 40) perpendiculares al borde de la herida y a través de la herida toda. Las pilas de z permite la captación de la profundidad de la capa de células, así como un plano de foco a través de la herida. Además, la serie de imágenes se puede poner junto a una colección de vídeos de las imágenes con el clic de un botón.

Demostramos un protocolo optimizado para la detección de la migración en la línea celular de queratinocitos HaCaT. Hemos probado lactoferrina y su péptido N-terminal, Lactoferricin, de seres humanos y las vacas, para analizar su efecto sobre la migración como estas moléculas se han demostrado tener numerosas aplicaciones como antimicrobiano e inmune modulación de moléculas^{22 , 23}. los cuatro compuestos se compararon con las células HaCaT no tratadas y factor de crecimiento epidérmico (EGF) fue utilizado como control positivo.

Protocolo

El montaje experimental no tiene ninguna restricción ética y jurídica y se llevó a cabo de acuerdo con la Universidad de Roskilde. Una visión general del montaje experimental se aprecia en la figura 1 y los mecanismos de la cámara óptica en la figura 2.

1. preparación

1. Realizar todos los pasos en un banco de flujo laminar estéril limpiar la banca y todos los equipos con etanol al 70% antes del inicio del experimento.
2. Coloque la cámara óptica en una incubadora convencional a 37 ° C con 5% CO₂ para garantizar las condiciones óptimas para las células.
3. Cultivar células HaCaT en medio DMEM con 10% FBS y 1 x antibióticos (penicilina y estreptomicina) en un matraz T75.
4. Para separar las células y el cultivarlos cada 3-4 días, por la dispersión sobre la capa celular usar la tripsina de 1 x 1 mL. Precaliente a temperatura ambiente antes de usar.

2. generar una monocapa de HaCaT células en una placa de microtitulación de 48 pozos

1. Retire el medio del frasco T75 con una pipeta Pasteur.
2. Lavar las células adherentes en el matraz mediante la adición de 5 mL 1 x PBS estéril al matraz T75.
   Nota: Asegúrese de que la PBS está libre de calcio y magnesio.
3. Circulan por el PBS y extraiga con una pipeta Pasteur.
4. Repita el paso 2.2-2.3.
5. Añadir tripsina de 1 x 1 mL en el matraz y dispersa a través de la capa de células.
6. Incube el frasco a 37 ° C en una incubadora convencional hasta que las células son separadas (5-8 minutos es suficiente para la mayoría de las líneas de la célula).
7. Ver bajo el microscopio si las células son separadas. Una vez que las células son separadas, añadir 9 mL de los medios de cultivo regular con 10% FBS para inactivar la tripsina 1 x.
8. Cuenta la célula con cualquiera un hemocitómetro, un contador coulter o similares.
   Nota: Azul de tripán puede utilizarse para ver las células muertas. Sin embargo, en tripsina 1 x HaCaT las células son redondas perfectamente cuando vivo.
9. Transferencia de 7.5 x 10⁴ células/pozo en 250 μl 10% FBS media a una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos fondo redondo (placa estándar).
   Nota: ensayo también puede configurarse en 6, 12, 24-o placas de 96 pocillos, que todo pueden ser analizadas bajo el microscopio óptico.
10. Mueva suavemente la placa de lado a lado para asegurar que las células se distribuyen igualmente en los pozos o las células se reunirán en el centro de los pozos. Examinar bajo un microscopio de luz para asegurarse de que la célula es distribuida uniformemente en los medios de comunicación
11. Poner la placa en un convencional incubador de CO₂ a 37 ° C durante la noche o hasta que las células se han adherido a la parte inferior de los pozos.

3. Además de los estímulos para efectos de migración

1. Comprobar si los pozos son confluentes de 90-95% bajo un microscopio de luz.
2. Preparar 10 μg/mL de mitomicina C en una cantidad adecuada del medio.
   Nota: En este estudio, la mitomicina C se mantiene a 4 ° C en una solución madre de 1 mg/ml. Mitomicina C en la solución puede ser almacenada una semana en la oscuridad a 2-8 ° C.
3. Retire los medios gastados con una pipeta Pasteur de cada pozo.
4. Añadir 250 μl de 5 μg/mL de mitomicina C a cada pocillo.
5. Incubar la placa por 2 h a 37 ° C y 5% CO₂.
6. Preparar estímulos de péptidos por diluir en una cantidad adecuada del medio.
   Nota: En este estudio, tanto la humana y bovina lactoferrina y Lactoferricin fueron probados a 25 μg/mL en un volumen de 250 μl
7. Retire el medio con el mitomycin C con una pipeta Pasteur.
8. Lave los pocillos 1 x con 250 μl de 1 x PBS (temperatura ambiente) y retire el lavado con un Pasteur pipeta.
9. Añadir 250 μl de 1 x PBS y raspar manualmente los pozos verticalmente con una punta de pipeta de 200 μl. Utilice una nueva pipeta para cada pozo.
10. Retirar el PBS y añadir estímulos de péptido de 250 μl.
11. Monte la placa en sistema óptico de la cámara mediante el ajuste de los tornillos en ambos lados de la placa. Deje la tapa en la placa de microtitulación.
    Nota: La cámara puede funcionar con la tapa abierta si es necesario.

4. configurar el programa para la cámara óptica en la computadora

1. Haga clic en adquirir en la barra de tareas de la izquierda.
2. Elija la función de la cicatrización de heridas en la barra de tareas de la izquierda.
3. Seleccione el tipo de placa haciendo clic debajo de la ilustración de la placa.
4. Anular la selección de pozos, no esté en uso, marcándolos y haga clic en Activar en la parte superior izquierda de la pantalla.
   Nota: Todos los pozos se seleccionan por defecto.
5. Ajuste el enfoque de la lente en los pozos para ajustar la posición de las celdas haciendo clic derecho en uno de los pozos.
   Nota: Enfoque automático también se puede ajustar manualmente moviendo la barra hacia la derecha de la ilustración de la placa.
6. Establecer el período de tiempo para imágenes en el Cuadro intervalo (por ejemplo, (00: 30:00)).
7. Establecer el número de repetición para el período deseado (por ejemplo 97 repeticiones).
8. Iniciar la ejecución pulsando el botón Start en la esquina inferior derecha.

Resultados

HaCaT es una línea de celular de queratinocitos, uno de los tipos celulares más abundantes en la piel. Cuando se produce una herida, las células de la piel comienzan a proliferar y migrar más al lecho de la herida para cerrar la herida (figura 3). Ambos procesos son, por lo tanto, de suma importancia para la curación adecuada.

La cámara óptica puede seguir ambos procesos en tiempo real. Para ...

Discusión

La importancia de la migración en los estudios del desarrollo, la cicatrización de heridas, Inmunología y cáncer ha llevado a varios métodos para estudiar la migración. La migración puede ser una expresión de la expansión o el cierre de la brecha por las células. Se prueba más a menudo posible cierre del cero, que es más fácil crecer las células en una monocapa y luego hacer un rasguño que el crecimiento de las células en forma específica⁸. Nuestro estudio demuestra un método opt...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro