Scratch-Test für die In-vitro- Prüfung der Zellwanderung mit einer automatisierten optischen Kamera optimiert

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Prozedur, um die Zelle Migration in Vitro mit einer automatisierten optischen Kamera Mikroskop zu testen. Der Scratch-Test hat verbreitet wo die Schließung von Grund auf für einen bestimmten Zeitraum gefolgt ist. Das optische Mikroskop ermöglicht eine zuverlässige und preiswerte Erfassung von Zellmigration.

Zusammenfassung

Zellmigration ist ein wichtiger Prozess, der viele Aspekte der Gesundheit, wie Wundheilung und Krebs beeinflusst und es ist daher entscheidend für die Entwicklung von Methoden, um die Migration zu studieren. Der Scratch-Test ist seit langem die am häufigsten in-vitro- Methode, Verbindungen mit Anti - pro ungs Eigenschaften wegen seiner niedrigen Kosten und einfache Verfahren zu testen. Allerdings ist ein oft berichtete Problem des Assays die Anhäufung von Zellen über den Rand des Kratzers. Darüber hinaus müssen zum Abrufen von Daten aus der Assay Bilder von unterschiedlichen Belichtungen über einen bestimmten Zeitraum hinweg auf der exakt gleichen Stelle getroffen werden, die Bewegungen der Migration zu vergleichen. Unterschiedliche Analyseprogramme können verwendet werden, um die Kratzer Schließung zu beschreiben, aber sie sind arbeitsintensiv, ungenau, und Kräfte Zyklen von Temperaturänderungen. In der vorliegenden Studie zeigen wir eine optimierte Methode zum Testen der Migration-Effekt, z. B. mit den natürlich vorkommenden Proteinen Mensch und Rind-Lactoferrin und ihre N-terminalen Peptids Lactoferricin auf die epithelialen Zellinie HaCaT. Eine wesentliche Optimierung ist zu waschen und kratzen mit PBS-Puffer, die die oben genannten Anhäufung von Zellen entlang der Kante beseitigt. Dies könnte durch die Entfernung von Kationen, erklärt werden, die erwiesenermaßen auf Keratinozyten-Zell-Zell-Verbindung auswirken. Um wahre Erkennung von Migration zu gewährleisten, wurde Vorbehandeln mit Mitomycin C, ein DNA-Synthese-Hemmer, das Protokoll hinzugefügt. Schließlich zeigen wir die automatisierte optische Kamera, die übermäßige Temperaturzyklen beseitigt Handarbeit mit Scratch Verschluss Analyse, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und sorgt für Analyse der identische Abschnitte des Kratzers im Laufe der Zeit.

Einleitung

Migration ist ein wichtiger Prozess, der verschiedene physiologische Aspekte beeinflusst. Bei der Wundheilung erleichtert Migration Re Epithelisierung der Haut. Bei nicht heilenden Wunden, z. B. chronische Wunden opportunistische Bakterien verursachen Infektion der Wunde und offene Wunden sind ideal für Bakterienwachstum und die Bildung von Biofilm^1,2. Biofilm ist eine der Ursachen für die Entwicklung von resistenten Bakterien, das ist einer der größten Gefahren für unsere moderne Gesellschaft³. Bei der Wundheilung durchdringen nicht die Immunzellen den Biofilm. Im Krebs ist Migration der Krebszellen ein entscheidender Schritt der Metastasierung, die die primäre Todesursache bei Patienten mit soliden Tumoren^4,5. Daher ist es entscheidend, die Migration zu studieren zu können.

Der Scratch-Test wird häufig verwendet, um Zellwanderung zu testen, weil es billig und einfach durchzuführen auf adhärenten Zelllinien, wie Fibroblasten, Endothelzellen, und Epithelzelle Linien^6,7. Heute gibt es mehrere Methoden für die Durchführung von Kratzer⁸, und verschiedene Materialien gemeldet wurden verwendet werden, einschließlich Zahnstocher⁹, Zelle Schaber¹⁰, Laser¹¹und elektrische Ströme¹². Alle Methoden haben verschiedene vor- und Nachteile, und die Methode sollte nach der Zelle Art, Budget und Analyse-Tool entschieden werden. Als Beispiel wenn die verwendeten Zellentyp erfordert Beschichtung, manuellem Druck entfernen, z.B. mit einem Zahnstocher oder einer Pipette Spitze wird beeinflussen Migration im Bereich, sollte eine andere Methode verwendet werden. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die manuelle Schaben.

Ein Nachteil für manuelle Schaben ist die Variation der Größe, Formen der Kratzer und Anhäufung von Zellen an den Rändern des Kratzers. Viele Protokolle sind vorhanden, und zitierte Papier berät, erhöhte Geschwindigkeit und/oder gründliches waschen nach kratzen¹³. Darüber hinaus wurden verschiedene Methoden zur Verbreitung, zu minimieren, da die Proliferation der Zellen nicht unterschieden von der Migration werden und daher falsch-Positive Ergebnisse der Migration geben kann. Einige berichtet, dass Methoden Serum Hunger vor der Scratch¹⁴ und Verringerung der Menge an Serum¹⁵sind. Jedoch kann keines dieser Verfahren sicherstellen, dass es keine Verbreitung gibt. Daher melden wir eine Vorbehandlung der Zellen mit Mitomycin C um echte Ergebnisse der Migration zu gewährleisten. Mitomycin C ist ein Antibiotikum, das hemmt die DNA-Synthese durch die Bildung einer kovalente Bindung mit der DNA, die verhindert, dass die DNA trennen¹⁶. Durch die Vorbehandlung mit Mitomycin C und Waschen mit PBS vor Verkratzen, zeigt die erkannten Schließung der Lücke die wahre Wanderung von Zellen (Abbildung 1).

Ein Merkmal aller Methoden ist die Notwendigkeit eines Systems zur Analyse des Prozesses der Migration¹⁷. Eine gemeinsame und eine kostengünstige Methode, um den Fortschritt zu analysieren ist ein Lichtfeld Mikroskop verwenden, um Bilder von Grund auf zu vorher festgelegten Zeitpunkten, gefolgt von einer Analyse der Schließung der Lücke in einem Bild Software^18,19. Diese Methode ist zeitaufwendig, unzuverlässig in Bezug auf die Aufnahme von Bildern an der gleichen Stelle und Fokus, und die Bewegung von Inkubator Kamera zwingt Zyklen von Temperaturänderungen während Bilder aufgenommen wurden. Andere Methoden wurden entwickelt, um Migration zu erkennen, durch die Messung des Stromflusses. Die aktuellen Änderungen, decken als Zellen mehr Platz auf der Platte, die als eine Zunahme der Impedanz²⁰gelesen wird. Durch Messung der Impedanz, die Umgebung der Zellen ist nicht betroffen, und die Methode wird daher als nicht-invasive. Diese Methode beruht auf spezielle Platten mit gold-Elektroden, die teuer sind, aber sie ermöglichen Erkennung vieler Prozesse, wie zelluläre festhalten, Proliferation, Migration und Zelltod. Ein großer Nachteil dieser Methode ist, dass die Impedanzmessung nicht direkt, Migration anzeigt, da Faktoren wie Temperatur einen großen Einfluss auf die Impedanz haben. Änderungen in der Impedanz können durch verschiedene Faktoren verursacht werden, die nicht von der Software, erschwert die Analyse der Daten überprüft werden. Daher erfordert das Fehlen der Visualisierung einer herkömmlichen Lichtmikroskop, Migration zu überprüfen.

Um viele der Nachteile der verfügbaren Techniken zu überwinden, verwenden wir eine Echtzeit-automatisierte optische Kamera. Die optische Kamera ist ein System zur Erkennung mit einem Hochdurchsatz-Mikroskop in eine kleine Plattform mit einem Objektiv, Beleuchtung und eine Digitalkamera. Es verfügt über eine integrierte Software, die Migration und Proliferation unter anderem testen können. Um Migration zu erkennen, dienen zwei Algorithmen zur Analyse, das Wachstum und die Migration Kinetik der Zellen, die die Verbreitung und die Wundheilung Analyse, bzw. genannt werden. Die Verbreitung Analyse ist basiert auf einem zweistufigen Bild Segmentierungsalgorithmus, die Texturanalyse um den Unterschied zwischen Zelle bedeckten Bereichen (gezeigt im gelb) zu entdecken gilt und leeren Hintergrund Bereiche durch erweiterte Histogramm-Analyse. Die Wundheilung Analyse basiert auf einem drei-Stufen-Algorithmus, erkennt die Zelle Monolage, sucht die Wunde Lücke, und bestimmt die Breite der Lücke. Diese Schritte werden an Benutzer festgelegten Zeitpunkten durchgeführt und die Daten werden als überdachte Fläche, Spaltbreite und Spaltbereich präsentiert. Einer der großen Vorteile dieser Maschine ist, dass es wegen des Winkels der Kamera²¹Bildgebung von adhärenten Zellen durch Flüssigkeit ermöglicht. Die Bilder der Kamera-Lenstakes geneigt, die zu einem Z-Stapel von einer Z-Ebene projiziert werden zu generieren um sicherzustellen, dass die Bilder im Fokus (Abbildung 2). Z-Stapel entstehen durch die Zusammenlegung der Serie von Aufnahmen (z.B. 40) senkrecht an den Rand der Wunde, und über die gesamte Wunde. Die Z-Stapel ermöglicht die Erfassung der Tiefe der Zellschicht sowie eine Fokusebene über die Wunde. Darüber hinaus kann die Serie von Bildern auf eine video-Sammlung von Bildern, mit einem Knopfdruck zusammengestellt werden.

Wir zeigen ein optimiertes Protokoll zur Erkennung der Migration in den Keratinozyten-Zell-Linie HaCaT. Wir testeten Lactoferrin und seine N-terminale Peptide, Lactoferricin, von Menschen und Kühen, um ihre Auswirkungen auf die Migration zu analysieren, wie diese Moleküle nachgewiesen wurden, zahlreiche Anwendungen als antimikrobiell und das Immunsystem modulieren Moleküle²² haben ^{, 23}. die vier Verbindungen waren im Vergleich zu unbehandelten HaCaT-Zellen und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) wurde als Positivkontrolle verwendet.

Protokoll

Der Versuchsaufbau hat keine ethischen und rechtlichen Beschränkung und in Absprache mit Roskilde University durchgeführt wurde. Ein Überblick über die Versuchsanordnung ist in Abbildung 1 und die Mechanismen der optischen Kamera in Abbildung 2ersichtlich.

1. Vorbereitung

1. Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Bank durch die Reinigung der Bank und alle Geräte mit 70 % Ethanol vor Beginn des Experiments.
2. Legen Sie die optische Kamera in einem konventionellen Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂ , optimale Bedingungen für die Zellen zu gewährleisten.
3. Wachsen Sie HaCaT-Zellen in DMEM Medien mit 10 % FBS und 1 X Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) in einem T75 Kolben.
4. Verwenden Sie 1 mL 1 X Trypsin, lösen die Zellen und kultivieren Sub alle 3-4 Tage durch über die zelluläre Ebene verteilen. Wärmen Sie vor Gebrauch auf Raumtemperatur.

2. Erzeugung einer Monoschicht von HaCaT Zellen in einer Mikrotiterplatte 48-Brunnen

1. Entfernen Sie das Medium aus der T75-Flasche mit einer Pasteurpipette.
2. Waschen Sie adhärenten Zellen in den Kolben durch Zugabe von 5 mL 1 X sterile PBS in den T75 Kolben.
   Hinweis: Dafür, dass die PBS von Calcium und Magnesium ist.
3. Zirkulieren Sie die PBS und entfernen Sie es mit einer Pasteurpipette.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.2-2.3.
5. Fügen Sie 1 mL 1 X Trypsin in den Kolben und in der Zellschicht zu zerstreuen.
6. Den Kolben bei 37 ° C in einem konventionellen Inkubator inkubieren, bis die Zellen gelöst sind (5-8 min reicht für die meisten Zell-Linien).
7. Zeigen Sie unter die Lupe genommen an, wenn die Zellen getrennt sind. Sobald die Zellen getrennt sind, fügen Sie 9 mL die regelmäßige Nährmedien mit 10 % FBS, 1 X Trypsin zu inaktivieren.
8. Zählen Sie die Zelle mit entweder ein Hemocytometer pro Coulter-Counter oder ähnliches.
   Hinweis: Trypan blau kann verwendet werden, um abgestorbene Zellen anzuzeigen. Jedoch in 1 X Trypsin HaCaT sind Zellen perfekt runde, wenn lebendig.
9. 7,5 x 10⁴ Zellen/Brunnen in 250 µL 10 % FBS Medien auf eine Runde Talsohle 48-Well-Zellkultur-Platte (standard Platte) übertragen.
   Hinweis: Assay kann auch in 6, 12, 24 oder 96-Well-Platten, die alle unter dem Lichtmikroskop untersucht werden können eingerichtet werden.
10. Sanft bewegen der Plattenrandes von Seite zu Seite, um sicherzustellen, dass die Zellen in den Vertiefungen gleichmäßig verteilt sind, oder die Zellen werden in der Mitte der Brunnen versammeln. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Zelle gleichmäßig in den Medien verbreitet wird
11. Legen Sie die Platte in einem herkömmlichen CO₂ Inkubator bei 37 ° C über Nacht oder bis die Zellen an der Unterseite der Brunnen gehalten haben.

(3) Zugabe von Stimuli für Migration Effekte

1. Überprüfen Sie, ob die Brunnen 90-95 % Zusammenfluss unter einem Lichtmikroskop sind.
2. Bereiten Sie 10 µg/mL von Mitomycin C in angemessener Höhe des Mediums.
   Hinweis: In dieser Studie wird Mitomycin C auf 4 ° C in einer Stammlösung 1 mg/ml gehalten. Mitomycin C in Lösung kann bis zu einer Woche im Dunkeln bei 2-8 ° c gelagert werden
3. Entfernen Sie die verbrauchten Medien mit einer Pasteurpipette aus jedem Brunnen.
4. Fügen Sie 250 µL 5 µg/mL von Mitomycin C, in jede Vertiefung.
5. Inkubieren Sie die Platte für 2 h bei 37 ° C und 5 % CO₂.
6. Bereiten Sie Reize von Peptiden durch Verdünnen sie in angemessener Höhe des Mediums.
   Hinweis: In dieser Studie wurden sowohl die menschlichen und bovine Lactoferrin und Lactoferricin bei 25 µg/mL in einem Volumen von 250 µL getestet.
7. Entfernen Sie das Medium mit Mitomycin C mit einer Pasteurpipette.
8. Waschen Sie die Brunnen, 1 X mit 250 µL 1 x PBS (Raumtemperatur) und entfernen das Waschen mit einer Pasteur pipette.
9. Fügen Sie 250 µL 1 X PBS und manuell kratzen Sie die Brunnen vertikal mit einem 200 µL PIPETTENSPITZE. Verwenden Sie eine neue PIPETTENSPITZE für jedes gut.
10. Entfernen der PBS und 250 µL Peptid Reize.
11. Montieren Sie die Platte in optischen Kamerasystem durch Verstellen der Schrauben auf beiden Seiten der Platte. Lassen Sie den Deckel auf der Mikrotiterplatte.
    Hinweis: Die Kamera kann bei geschlossenem Deckel öffnen bei Bedarf bedienen.

4. richten Sie das Programm für die optische Kamera auf den Computer

1. Klicken Sie in der Taskleiste auf der linken Seite erwerben .
2. Wählen Sie die Funktion, die Wundheilung in der Taskleiste auf der linken Seite.
3. Wählen Sie die Platte unterhalb der Platte Abbildungklicken.
4. Deaktivieren Sie Brunnen nicht in Gebrauch, indem Sie sie markieren und klicken Sie oben links auf dem Bildschirm ermöglichen .
   Hinweis: Alle Brunnen sind standardmäßig ausgewählt.
5. Stellen Sie den Fokus des Objektivs auf die Brunnen, die Position der Zellen mit der rechten Maustaste auf eines der Brunnen passen.
   Hinweis: Autofokus kann auch manuell eingestellt werden, indem Sie die Leiste auf der rechten Seite der Platte Illustration verschieben.
6. Legen Sie den Zeitraum für Bilder unter Bild-Intervall (z.B. (00:30:00)).
7. Legen Sie die Anzahl der Wiederholungen für den gewünschten Zeitraum (z. B. 97 Wiederholungen) passen.
8. Starten Sie durch Klicken auf die Schaltfläche " Start " in der rechten unteren Ecke den Durchlauf.

Ergebnisse

HaCaT ist eine Keratinozyten-Zell-Linie, einer der am häufigsten vorkommenden Zelltypen in der Haut. Tritt eine Wunde, beginnen die Hautzellen vermehren sich und Wandern über in das Wundbett, schließen Sie die Wunde (Abbildung 3). Beide Prozesse sind daher von größter Bedeutung für die ordnungsgemäße Heilung.

Die optische Kamera kann beide Prozesse in Echtzeit verfolgen. Für die Migration, ...

Diskussion

Die Bedeutung der Migration in den Studien von Entwicklung, Wundheilung, Immunologie und Krebs führte verschiedene Methoden zur Migration zu studieren. Migration kann ein Ausdruck für die Erweiterung oder die Schließung der Lücke durch die Zellen. In den meisten Fällen die Schließung des Kratzers wird getestet, da es einfacher zu wachsen Zellen in einem monomolekularen Film und machen dann einen Kratzer als wachsen die Zellen in einem bestimmten Formular⁸. Unsere Studie zeigt eine optimierte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro