スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

要約

ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。

要約

細胞遊走創傷治癒や、がんなどの健康の多くの側面に影響する重要なプロセスであり、したがって、移行を研究する手法を開発するため非常に重要。スクラッチのアッセイは、その低コストと簡単な手順のため反プロ移行のプロパティを持つ化合物をテストする最も一般的な体外メソッドをずっと。ただし、アッセイのしばしば報告されている問題は傷の端の間で細胞の積み重ねであります。さらに、測定からデータを取得する異なる露出の画像取られなければならない期間にわたって同じ場所で移行の動きを比較します。傷の閉鎖を説明する別の解析プログラムを使用ことができますが、彼らは、労働集約的、不正確なと温度変化の力サイクル。本研究では、テスト移行効果、例えば人間と牛ラクトフェリンの天然の蛋白質およびその N 末端ペプチド ラクトフェリシン上皮細胞線 HaCaT 最適化手法を示す.重要な最適化は、洗浄し、エッジに沿って細胞の前述の蓄積を排除、PBS のスクラッチです。これは、ケラチノ サイトの細胞間の接続に影響を及ぼすことが示されている陽イオンの除去によって説明できます。移行の true 検出するように、マイトマイシン C、DNA 合成阻害剤の前処理は、プロトコルに追加されました。最後に、再現性を向上し、時間をかけて傷の同一断面の解析しながら自動光学カメラ、過度の温度サイクルを排除するスクラッチ閉鎖分析で、肉体労働を示します。

概要

移行は、いくつかの生理学的な側面に影響を与える重要なプロセスです。創傷治癒の移行は皮膚の再上皮の再生を促進します。慢性の傷などのヒーリング以外の傷で日和見細菌が傷口の感染症を引き起こすし、傷口が細菌の成長とバイオ^1,2の形成に最適です。バイオ フィルムは、私たちの現代社会³に対する最大の脅威の一つである抵抗力がある細菌の開発の原因の一つです。創傷治癒の免疫細胞は、バイオ フィルムを突き通すことができません。癌、癌細胞の移行は固形腫瘍^4,5患者の死亡の主な原因である転移の要となる一歩です。したがって、移行を検討することができることが重要です。

スクラッチの試金はそれは安価で簡単に線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞ライン^6,7などの付着性のセルラインに実行できますので、細胞遊走をテストによく使用されます。今日、傷⁸を実行するためにいくつかの方法が存在して、さまざまな材料が使用される報告されている、つまようじ⁹、セル スクレーパー¹⁰、レーザー¹¹、電流¹²など。異なる長所と短所があるすべてのメソッドと、メソッドは、細胞の種類、予算、および分析ツールによって決められるべきです。例として使用されているセル型コーティング, 手動圧力除去が必要な場合例えばつまようじまたはピペットの先端と地域内での移行に影響を与える、異なるメソッドを使用してください。本研究では手動さげ仕上に焦点を当てます。

手動削りの欠点は、サイズのバリエーション、傷の形状と傷の端のセルの蓄積です。多くのプロトコルが存在して被引用論文アドバイス増加速度や¹³をスクラッチした後徹底的に洗浄します。さらに、いくつかの方法は、細胞の増殖が移行から識別することはできません、したがって移行の偽陽性の結果を与える可能性がありますので、増殖を最小限に抑えるために使用されています。いくつか報告方法、血清飢餓スクラッチ¹⁴の前と血清¹⁵の量を減少させます。但し、どちらの方法は、増殖がないことを保障できます。したがって、移行の真の結果を得るためにマイトマイシン C の細胞の前処理を報告します。マイトマイシン C は、DNA が¹⁶を分離することを防ぐ DNA と共有結合を形成することにより DNA 合成を阻害する抗生物質です。マイトマイシン C の前処理してスクラッチ前に PBS で洗浄するには、ギャップの検出された閉鎖は細胞 (図 1) の真の移動を示します。

すべてのメソッドの特徴は、移行¹⁷のプロセスを分析するシステムの必要性です。共通して、進捗状況を分析するための安価な方法イメージ ソフトウェア^18,19のギャップの閉鎖の分析に続いて、事前に決められた時点で傷の画像を撮影するライト フィールド顕微鏡を使用することです。このメソッドは、時間のかかる、フォーカス、同じ場所で写真を撮ることに関して信頼できないと撮影しながら温度変化のサイクルを強制的にインキュベーターからカメラへの動き。他の方法は、電流の流れを測定することによって移行を検出するために開発されています。現在の変更セルとしてインピー ダンス²⁰の増加として読み込まれる皿の上のより多くのスペースをカバーします。インピー ダンスを測定することにより、細胞の環境に影響がないとメソッドを非侵襲的な考えです。この方法は高価である金電極を用いた特殊なプレートに頼るが、彼らは細胞の付着、増殖、移行、および細胞死などの多くのプロセスの検出を有効にします。この方法の大きな欠点は、温度などの要因が大きな影響を与えるインピー ダンス インピー ダンス測定が直接移行を示されていないことです。データの解析をより難しくして、ソフトウェアによって見直されないいくつかの要因によってインピー ダンスの変化が起こります。したがって、可視化の欠如には、移行を検証する従来の光学顕微鏡が必要です。

利用可能な技術の欠点の多くを克服するためには、リアルタイム自動光学カメラを使用してください。光学カメラ、レンズ、照明ユニット、デジタル カメラと小さなプラットフォームで高スループットの顕微鏡による検出システムです。それが移行および他のものの間で拡散をテストすることができます内蔵のソフトウェアです。移行を検出するには、2 つのアルゴリズムを使用して、成長と細胞増殖および治癒解析、それぞれと呼ばれる移行動態を分析します。増殖解析は細胞に覆われた部分 (黄色で表示) の差を検出するためのテクスチャ解析を適用する 2 段階画像セグメンテーション アルゴリズムに基づいて、空高度なヒストグラム解析による背景のエリア。創傷治癒の分析は、単層細胞を検出し、特定して傷ギャップ ギャップの幅を決定する 3 つのステップ アルゴリズムに基づいています。ユーザーが決定した時点で、次の手順を実施し、カバーエリア、ギャップ幅、およびギャップ領域としてデータを表示します。この機械の大きな利点の 1 つはカメラ²¹の角度のため液体を付着細胞のイメージングが可能です。確実にフォーカス (図 2)、画像に生成が単一の z 平面の z スタックに予測されているカメラ傾斜 lenstakes イメージです。z スタックは、全体の傷の傷の端に垂直撮影 (例えば40) の写真のシリーズをマージすることによって生成されます。Z スタックは、フォーカスの面と同様、細胞層の深さの傷全体をキャプチャできます。さらに、一連の画像はボタンをクリックすると、画像のビデオ コレクションにまとめることができます。

ケラチノ サイト細胞株 HaCaT 移行の検出のための最適化されたプロトコルを示す.ラクトフェリンとその N 末端ペプチド、同様、人間と牛、抗菌、免疫変調分子²²として多数のアプリケーションを持っているこれらの分子が実証されている、移行に及ぼす影響を分析する実験を行った^,23します。 4 つの化合物を比較した未処理細胞と上皮成長因子 (EGF) が肯定的な制御として使用されました。

プロトコル

実験のセットアップは倫理的、法的制限を持たず、ロスキレ大学との合意を行った。実験のセットアップの概要については、図 1と図 2の光学カメラの機構の見ることができます。

1. 準備

1. ベンチ ・実験の開始前に 70% のエタノールとすべての設備をクリーニングして滅菌の層流ベンチですべての手順を実行します。
2. セルの最適な条件を確保する 5% CO₂と 37 ° C で従来のインキュベーターで光学カメラを配置します。
3. 10 %fbs と 1 x 抗生物質 (ペニシリンとストレプトマイシン) T75 フラスコ DMEM メディア HaCaT 細胞を成長します。
4. 1 mL 1 x トリプシンを使用して、セルをデタッチし、サブ細胞の層の上にそれを分散させることによってすべての 3-4 日を育成します。使用する前に部屋の温度に予熱しておく。

2. HaCaT の単分子膜を生成する細胞の 48 ウェル マイクロ プレート

1. パスツール ピペット T75 フラスコからメディアを削除します。
2. 5 mL × 1 滅菌 PBS を T75 フラスコに追加することによってフラスコ内での付着性のセルを洗浄します。
   注:PBS はカルシウムとマグネシウムの無料を確認します。
3. PBS を循環、パスツール ピペットを取り外します。
4. 2.2 2.3 の手順を繰り返します。
5. フラスコに 1 mL 1 x トリプシンを追加し、細胞層の間で分散します。
6. セルを取り外すまでに従来のインキュベーターで 37 ° C でフラスコを孵化させなさい (5-8 分でほとんどの細胞ラインの十分です)。
7. 顕微鏡下で細胞が分離される場合を表示します。セルを取り外したら、一度追加 10% と通常の培地の 9 mL FBS 1 x トリプシンを不活化します。
8. どちらか検定を持つセルをカウント、コールター カウンターまたは似たような。
   注:トリパン ブルーは、死んだ細胞を表示する使用できます。ただし、1 x トリプシン HaCaT の生きている細胞はラウンド完全に。
9. 250 μ L 10 %fbs メディアで 10 の⁴細胞/ウェル x 7.5 を丸底 48 ウェル培養プレート (標準プレート) に転送します。
   注: アッセイは、6、12、24、または 96 ウェル プレート、すべて光学顕微鏡の下で試金することができますをも設定できます。
10. 優しくように細胞が等しく広げ、井戸の側に側からプレートを移動やセルが井戸の中心に収集されます。光メディアで均等に配分したセルを確認する顕微鏡検査します。
11. 一晩、またはセルが付いて、井戸の底にまで、37 ° C で従来の CO₂インキュベーターに皿を置きます。

3. 移行性の刺激の追加

1. 井戸光顕微鏡下で 90-95% 合流かどうかを確認します。
2. 媒体の適切な量のマイトマイシン C の 10 μ g/mL を準備します。
   注:本研究では、マイトマイシン C は 4 ° c で 1 mg/mL 原液で保持されます。マイトマイシン C 溶液中で 2-8 ° C で暗闇の中で 1 週間格納できます。
3. 各ウェルからパスツール ピペット使用済みメディアを削除します。
4. 各ウェルにマイトマイシン C の 5 μ g/mL の 250 μ L を追加します。
5. 37 ° C、5% CO₂で 2 時間版を孵化させなさい。
6. ペプチドの刺激を準備するには、メディアの適切な量でそれらを希釈します。
   注:本研究では、両方、人間と牛ラクトフェリンやラクトフェリシンは 250 μ L のボリュームで 25 μ g/mL でテストされました。
7. マイトマイシン C パスツール ピペットで培地を削除します。
8. 1 x 250 μ L の PBS (室温)、削除、パスツールを洗う × 1 ピペット洗浄します。
9. 1x PBS の 250 μ L を追加し、手動で 200 μ L ピペット チップと垂直の井戸をスクラッチします。各ウェルに新しいピペット チップを使用します。
10. PBS を削除し、250 μ L ペプチド刺激を追加します。
11. プレートの両側のネジを調整することによって、光学カメラ システムでプレートをマウントします。マイクロタイター プレートに蓋を残します。
    注:カメラは、蓋が必要な場合は開いたまま操作できます。

4. 光学カメラ コンピューター上のプログラムを設定します。

1. 左側のタスクバーを取得をクリックします。
2. 左上のタスクバーに創傷治癒の関数を選択します。
3. プレートの種類を選択するには、以下のプレートの図クリックします。
4. マークすることによって、使用ではなく、井戸を選択せず、画面の左上側で [有効] をクリックします。
   注:すべての井戸は、既定で選択されます。
5. 井戸の井戸の 1 つを右クリックして、セルの位置に合わせてレンズの焦点を調整します。
   注:板図の右にバーを移動することによって、オート フォーカスを手動で調整もできます。
6. 画像間隔下画像の時間期間を設定 (例えば(00:30:00))。
7. (例えば97 の繰り返し) の希望の期間に合わせて繰り返し数を設定します。
8. 右下のスタートボタンをクリックして、実行を開始します。

結果

HaCaT はケラチノ サイト細胞ライン、皮膚の最も豊富なセル型の 1 つです。傷が発生すると、皮膚細胞は増殖し、傷のベッド (図 3) 傷を閉じるために移行を開始します。両方のプロセスは、したがって、適切な治療のため非常に重要です。

光学カメラは、リアルタイムでの両方のプロセスに従うこと?...

ディスカッション

開発、創傷治癒、免疫学、癌研究の移行の重要性は移行を検討するいくつかの異なる方法をもたらした。移行は、展開の式またはセルによるギャップの閉鎖することができます。ほとんどの場合傷の閉鎖はテスト細胞単層を成長し、特定のフォーム⁸細胞を成長させるよりもスクラッチに簡単です。我々 の研究は、テクニックはマスターに簡単・低コスト マニュアル掻くた?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro