Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Özet

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Özet

Hücre göç sağlık, yara iyileşmesi ve kanser, gibi birçok yönünü etkileyen önemli bir süreçtir ve bu, bu nedenle, geçiş çalışma yöntemleri geliştirmek için çok önemlidir. Kazı-kazan tahlil uzun bileşikler ile anti ve pro migration özellikleri nedeniyle, düşük maliyetli ve basit yordamı sınamak için en yaygın vitro yöntemi olmuştur. Ancak, bir sık rapor tahlil hücreleri birikimi sıfırdan kenar boyunca bir sorundur. Ayrıca, tahlil verileri elde etmek için farklı pozlama görüntüleri bir süre içinde tam olarak aynı noktada göç hareketleri karşılaştırmak için alınması gerekir. Farklı analiz programları sıfırdan kapatılması tanımlamak için kullanılan, ancak emek yoğun, yanlış ve kuvvetleri döngüleri sıcaklık değişiklikleri. Bu çalışmada, geçiş etkisi, Örneğin doğal olarak meydana gelen proteinler insan ve sığır Laktoferrin ile ve epitel hücre satırındaki HaCaT onların N-terminal peptid Lactoferricin test etmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi göstermektedir. Çok önemli bir optimizasyon yıkayın ve söz konusu birikimi hücre kenarı boyunca ortadan kaldırır PBS sıfırdan etmektir. Bu özellikler, keratinosit hücre-hücre bağlantısı üzerinde etkisi olduğu gösterilmiştir kaldırma tarafından açıklanabilir. Geçiş doğru tespiti sağlamaktır, mitomycin C, DNA sentezi inhibitörü ile önceden tedavi protokolü için eklendi. Son olarak, aşırı sıcaklık döngüleri, ortadan kaldıran otomatik optik kamera, el emeği ile sıfırdan kapatma analizi, tekrarlanabilirlik üzerinde iyileştirilmesi ve zamanla çizik aynı bölümden analiz sağlanması sırasında göstermek.

Giriş

Geçiş birçok fizyolojik açıdan etkileyen önemli bir süreçtir. Yara iyileşmesinde, geçiş cildin yeniden epithelization kolaylaştırır. Kronik yaralar gibi Sigara şifa yaralar fırsatçı bakteriler yara enfeksiyonu neden ve açık yaralar bakteri büyüme ve biyofilm^1,2oluşumu için idealdir. Biyofilm dirençli bakterilerin gelişimi nedenleri biri bizim modern toplumun³için en büyük tehdit olan biridir. Yara iyileşmesinde, bağışıklık hücreleri biyofilm aşamıyor. Kanser, kanser hücrelerinin geçiş metastaz, çok önemli bir adım olan ölüm solid tümör^4,5olan hastalar için birincil nedeni olmasıdır. Bu nedenle, geçiş çalışma çok önemlidir.

Kazı-kazan tahlil kez çünkü ucuz ve kolay, fibroblast, endotel ve epitel hücre hatları^6,7gibi yapışık hücre satırları üzerinde gerçekleştirmek için hücre göç sınamak için kullanılır. Bugün, çizikler⁸gerçekleştirmek için birkaç yöntem var ve farklı malzemeler kullanılmak üzere, kürdan⁹, hücre Kazıma aletleri¹⁰, lazerler¹¹ve elektrik akımları¹²de dahil olmak üzere bildirilmiştir. Tüm yöntemleri farklı artıları ve eksileri var ve yöntem üzerine hücre türü, bütçe ve analiz aracına göre karar vermesi gerektiğini. Örnek olarak, kullanılan hücre tipi, el ile basınç kaldırma, kaplama gerektiriyorsa, Örneğin bir kürdan veya pipet ucu ile geçiş alanı içinde etkisi, farklı bir yöntem kullanılmalıdır. Bu çalışmada, el ile kazıma üzerinde durulacak.

El ile kazıma için bir zararı olmaz bu çizikler şekilleri ve çizik kenarlarında hücre birikimi, boyutu varyasyonu. Birçok protokoller bulunmaktadır ve hızlı artış ve/veya¹³çizilmemesi sonra ayrıntılı çamaşır yüksek atıf kağıt tavsiye eder. Buna ek olarak, hücrelerin çoğalması göç--dan ayırt edici olamaz ve bu nedenle yanlış pozitif sonuçlar göç verebilir beri yayılması, en aza indirmek için birkaç yöntem kullanılmıştır. Bazı yöntemler sıfırdan¹⁴ önceki ve serum¹⁵miktarı azalan serum açlık bildirilir. Ancak, bu yöntemlerin ikisi de hiçbir nükleer silahların yayılmasına karşı olduğundan emin olabilirsiniz. Bu nedenle, biz ön arıtma göç doğru sonuçlar sağlamak için mitomycin C içeren hücrelerin raporu. Mitomycin C DNA¹⁶ayıran engeller DNA ile kovalent bağ oluşturarak DNA sentezini engeller bir antibiyotiktir. Mitomycin C ile önceden tedavi ve çizilmemesi önce PBS ile yıkama, Gap algılanan kapatılması (Şekil 1) hücrelerinin doğru geçiş gösteriyor.

Tüm yöntemleri geçiş¹⁷süreci analiz etmek bir sistemi için ihtiyaç özelliğidir. Ortak bir ilerleme çözümlemek için ucuz bir yöntem ise bir görüntü yazılımı^18,19boşluğu kapatılması bir analizini ve ardından önceden belirlenmiş zaman noktalarda çizik görüntülerini çekmek için ışık alan mikroskop kullanmak için. Bu yöntem zaman alan, aynı yerde ve odak fotoğraf çekmek açısından güvenilmez ve resimlerin çekildiği ise sıcaklık değişiklikleri döngüleri kuluçka hareketinden kamera için zorlar. Diğer yöntemler mevcut akışını ölçerek geçiş algılamak için geliştirilmiştir. Geçerli değişiklikleri hücreler olarak empedans²⁰artış olarak okumak plaka üzerinde daha fazla yer kapsamaktadır. Empedans ölçüm, çevrenin hücrelerin etkilenmez ve yöntemi bu nedenle non-invaziv olarak kabul edilir. Bu yöntem pahalı, altın elektrotlar ile özel plakaları kullanır ama onlar hücresel bağlılık, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve hücre ölümü gibi birçok işlemlerin algılanmasını sağlar. Sıcaklık gibi faktörler empedansı üzerinde büyük bir etkiye sahip olarak empedans ölçüm doğrudan geçiş, göstermez bu yöntemin bir engel olduğunu. Empedans değişimler veri analizi daha zor hale yazılım tarafından incelenir değil çeşitli faktörler neden olabilir. Bu nedenle, görselleştirme eksikliği geçiş doğrulamak için geleneksel bir ışık mikroskobu gerektirir.

Birçok kullanılabilir teknikleri downsides üstesinden gelmek için gerçek zamanlı otomatik optik kamera kullanın. Optik kamera küçük bir platformda bir lens, aydınlatma ünitesi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile yüksek-den geçerek mikroskop ile algılama sistemidir. Göç ve diğer şeyler arasında nükleer silahların yayılmasına karşı test edebilirsiniz bir yerleşik yazılım vardır. Geçiş algılamak için iki algoritmaları büyüme ve hücrelerin çoğalması ve analizi, sırasıyla şifa yara adı verilen geçiş kinetik çözümlemek için kullanılır. Doku analizi (sarı renkle gösterilmiştir) cep kaplı alanlar arasındaki farkı bulmak için geçerlidir bir iki aşamalı görüntü segmentasyonu algoritma dayalı ve boş yayılması analizi arka plan alanları göre gelişmiş çubuk grafik analiz. Analiz şifa yara hücre monolayer algılar, yara boşluk bulur ve boşluk genişliğini belirler bir üç adım algoritmasına dayanan. Aşağıdaki adımları Kullanıcı tarafından belirlenen saat-noktalarda yapıldığı ve verileri kapalı alan, boşluk genişliği ve gap alanı sunulur. Bu makine büyük avantajlarından biri²¹kamera açısı yüzünden sıvı ile yapışık hücreleri görüntüleme sağlar olduğunu. Resimleri odak noktası (Şekil 2) olduğundan emin olmak için bir z-yığını için tek bir z uçağı öngörülen kamera hareket ettirildiğinde lenstakes görüntüler oluşturmak. z-yığınlar yara kenarına ve tüm yara arasında dikey çekilen fotoğraflar (Örneğin 40) dizi birleştirme tarafından oluşturulur. Z-yığınlar hücre katmanı hem de bir odakta uçak derinliği yara yakalama sağlar. Ayrıca, resimleri dizi görüntüleri, video koleksiyonuna bir düğmeyi tıklamak ile birlikte konabilir.

Biz algılanması HaCaT keratinosit hücre doğrultusunda geçiş için en iyi duruma getirilmiş bir protokol göstermek. Laktoferrin ve onun N-terminal peptid, Lactoferricin, insanlar ve inekler, bu moleküller çok sayıda uygulama antimikrobiyal ve bağışıklık molekülleri²² oransal için gösterildiği şekilde geçiş üzerindeki etkileri analiz etmek için test ^{, 23}. dört bileşikler tedavi edilmezse HaCaT hücrelere karşılaştırıldı ve epidermal büyüme faktörü (EGF) olumlu bir denetim olarak kullanıldı.

Protokol

Deneysel Kur etik ve yasal sınırlama yoktur vardır ve Roskilde Üniversitesi ile anlaşma yapılmıştır. Deneysel set-up bir bakış resim 1 ve Şekil 2optik kamera mekanizmaları görülebilir.

1. hazırlık

1. Tüm adımları bir steril laminar akış-tezgah tezgah ve tüm ekipmanları ile % 70 etanol başından önce deneme temizleyerek gerçekleştirin.
2. Hücreler için en uygun koşulları sağlamak için % 5 CO₂ 37 ° C'de geleneksel bir kuluçka optik kamera yerleştirin.
3. %10 FBS ve 1 x antibiyotik (penisilin ve streptomisin) bir T75 şişesi ile DMEM medyada HaCaT hücrelerin büyümesine.
4. 1 mL 1 x tripsin hücreleri bağlantısını kesin ve onları her 3-4 gün yetiştirmek hücresel katmanı üzerinden Dispergatör tarafından alt için kullanın. Oda sıcaklığına kullanmadan önce ön ısı.

2. HaCaT Monolayer üreten hücreleri bir 48-kuyu Microtiter plaka

1. Orta T75 şişeye Pasteur pipet ile kaldırın.
2. Şişeye yapışık hücreleri T75 şişesi 5 mL 1 x steril PBS ekleyerek yıkayın.
   Not: PBS kalsiyum ve magnezyum serbest olduğundan emin olun.
3. PBS geçirilip yorumlanması için dolaştırmak ve Pasteur pipet ile çıkarın.
4. 2.2 2.3 arasındaki adımları yineleyin.
5. Şişesi için 1 mL 1 x tripsin ekleyin ve hücre katmanı dağıttı.
6. Hücreleri müstakil kadar geleneksel bir kuluçka 37 ° C'de şişeye kuluçkaya (5-8 dk çoğu hücre hatlarında yeterli).
7. Hücreleri müstakil ise mikroskop altında görüntüleyin. Hücreleri müstakil kez 9 mL % 10 ile düzenli kültür ortamının eklemek FBS 1 x tripsin devre dışı bırakabilirsiniz.
8. Her iki hemasitometre, hücresiyle saymak coulter-sayaç veya benzer bir.
   Not: Trypan mavi ölü hücreleri görüntülemek için kullanılabilir. Ancak, 1 x tripsin HaCaT hücreleri vardır mükemmel yuvarlak zaman canlı.
9. 7.5 x 10⁴ hücreleri/iyi 250 µL % 10 FBS medya 48-iyi doku kültürü yuvarlak popolu plaka (Standart plaka) aktarın.
   Not: tahlil de ayarlanabilir 6-, 12-, 24-veya hangi optik mikroskop altında denetlesinler 96-şey plakaları.
10. Yavaşça plaka yan tarafında hücreleri aynı derecede içinde wells yayılır emin olmak için hareket veya hücreleri kuyuları Merkezi'nde bir araya gelecek. Hücre medyada eşit yayılmış emin olmak için hafif bir mikroskop altında incelemek
11. Gecede veya hücreleri kuyu dibine yapıştırılır kadar geleneksel bir CO₂ kuluçka 37 ° C'de plaka koymak.

3. geçiş efektleri için bir çekim gücü eklenmesi

1. Kuyuları % 90-95 birleşmesi hafif bir mikroskop altında olup olmadığını kontrol edin.
2. 10 µg/mL mitomycin C orta uygun bir miktarda hazırlamak.
   Not: Bu çalışmada, Mitomycin C 1 mg/mL, hisse senedi bir çözümde 4 ° C'de tutulur. 2-8 ° C'de karanlıkta bir hafta için Mitomycin C çözüm içinde depolanması
3. Pasteur pipet ile harcanan medya her kuyudan çıkarın.
4. 5 µg/mL mitomycin C de 250 µL her şey için ekleyin.
5. 2 h 37 ° C ve % 5 CO₂plaka kuluçkaya.
6. Peptidler uyaranlara onları Orta uygun bir miktarda sulandrarak hazırlayın.
   Not: Bu çalışmada, insan ve sığır laktoferrin hem Lactoferricin 25 µg/mL 250 µL hacmine, test edildi
7. Mitomycin C ile Pasteur pipet ile orta kaldırın.
8. 1 x 1 x PBS (Oda sıcaklığında) ve Kaldır yıkama bir Pasteur ile 250 µL ile pipet wells yıkayın.
9. 1 x PBS 250 µL ekleme ve el ile wells 200 µL pipet ucu ile dikey çizik. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.
10. PBS kaldırın ve 250 µL peptid uyaranlara ekleyin.
11. Plaka plaka her iki tarafındaki vidaları ayarlayarak optik kamera sistemi monte. Kapak microtiter plaka üzerinde bırakın.
    Not: Kameranın açık gerekirse kapak ile çalışabilir.

4. Program bilgisayarın optik kamera için ayarlama

1. Al soldaki görev çubuğundaki düğmesini tıklatın.
2. Görev çubuğundaki soldaki iyileşmesi işlevi seçin.
3. Plaka tipi plaka illüstrasyonaşağı tıklatarak seçin.
4. Wells, kullanılmadığı, onları işaretleyerek seçimini kaldırın ve ekranın üst sol tarafında, Etkinleştir ' i tıklatın.
   Not: Bütün wells varsayılan olarak seçilir.
5. Hücrelerin konumunu bir kuyu üzerinde sağ tıklatarak sığdırmak için kuyu objektif odak noktası ayarlayın.
   Not: Otofokus da plaka illüstrasyon sağında çubuğunu taşıyarak el ile ayarlanabilir.
6. Zaman dönemi Resim aralığı altında görüntü için ayarla (Örneğin (00: 30:00)).
7. Tekrarı istenen dönem (Örneğin 97 tekrarlar) sığacak şekilde ayarlayın.
8. Run Başlat düğmesini sağ alt köşesine tıklatarak başlatın.

Sonuçlar

HaCaT keratinosit hücre, deride en bol bulunan hücre türlerinden biri olan bir. Bir yara ortaya çıktığında, cilt hücrelerini çoğalırlar ve üzerinde yara (Şekil 3) kapatmak için yara yatağına geçirmek başlatın. Her iki süreç vardır, bu nedenle, uygun şifa için son derece önemlidir.

Optik kamera her iki süreç gerçek zamanlı olarak takip edebilirsiniz. Geçiş için sistem...

Tartışmalar

Geliştirme, yara iyileşmesi, immünoloji ve kanser araştırmaları göç önemi için birkaç farklı yöntem geçiş çalışma yol açmıştır. Geçiş ya da bir ifade genişleme veya boşluk hücreleri tarafından kapatılması olabilir. Bir monolayer hücreleri büyümek ve daha belirli form⁸hücrelerde büyüyen bir çizik bile yapmak daha kolay olduğu gibi en sık kapatılması çizik, mercek altına alındı. Tekniği Master kolay ve düşük maliyetli olduğu gibi bizim çalışma man...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro