Оптимизированный скретч Assay в Vitro тестирования миграции клеток с автоматической оптической камеры

Резюме

Здесь мы опишем процедуру тест ячейка миграции в пробирке с автоматической оптической камеры микроскопа. Царапинам assay широко используется где закрытие нуля следуют за определенный период. Оптический микроскоп обеспечивает надежный и дешевый обнаружение миграции клеток.

Аннотация

Клетки миграция является важным процессом, который влияет на многие аспекты здоровья, таких как ранозаживляющее и рак, и он, таким образом, решающее значение для разработки методов для изучения миграции. Царапинам assay уже давно наиболее распространенных в vitro метод для проверки соединений с анти - и про migration свойства из-за его низкой стоимости и простая процедура. Однако часто сообщили проблема анализа — это совокупность клеток по всему краю нуля. Кроме того для получения данных от assay, изображения различных воздействий необходимо принять в течение времени в точно то же место для сравнения движения миграции. Различные анализа программы могут использоваться для описания скретч закрытия, но они являются трудоемким, неточной и силы циклам изменений температуры. В этом исследовании мы демонстрируем оптимизированный метод для тестирования миграции эффект, например с естественным белки лактоферрина человека и говядину и их N-терминальный пептидные Lactoferricin на линии эпителиальных клеток HaCaT. Решающее значение оптимизация является мыть и нуля в PBS, который устраняет вышеупомянутых накопления клеток вдоль края. Это можно объяснить путем удаления катионы, которые показали, чтобы иметь влияние на связи клеток кератиноцитов. Чтобы верно обнаружения миграции, предварительной обработки с митомицин C, ингибитор синтеза ДНК, был добавлен к протоколу. Наконец мы демонстрируем автоматизированных оптической камеры, которая исключает чрезмерное температурных циклов, ручной труд с нуля закрытия анализа, улучшения на воспроизводимость и обеспечивая анализ идентичных секций нуля с течением времени.

Введение

Миграция является важным процессом, который влияет на некоторые физиологические аспекты. В заживлении ран, миграции облегчает повторное эпителизации кожи. В незаживающие раны, таких как хронические раны оппортунистических бактерии вызывают инфекции раны, и открытые раны идеальны для роста бактерий и образование биопленки^1,2. Биопленки является одной из причин развития резистентных бактерий, который является одним из самых серьезных угроз для нашего современного общества³. В заживлении ран, иммунные клетки не могут проникнуть биопленки. В рак миграция раковых клеток является ключевой шаг метастазов, который является основной причиной смерти больных с солидными опухолями^4,5. Таким образом важно иметь возможность изучения миграции.

Царапинам assay часто используется для тестирования миграции клеток, потому что это дешево и легко выполнять на линиях адэрентных клеток, фибробластов, эндотелия сосудов, и эпителиальных клеток линии^6,7. Сегодня существует несколько методов для выполнения царапин⁸, и различные материалы были зарегистрированы для использования, включая зубочистки⁹, клетки скребки¹⁰, лазеры¹¹и электрические токи¹². Все методы имеют различные плюсы и минусы, и метод должно быть принято в соответствии с ячейки типа, бюджета и анализа инструмент. Например если тип используемой ячейки требует покрытия, удаление ручного давления, например с концом toothpick или пипетки, будет влиять на миграцию в пределах области, следует использовать другой метод. В этом исследовании мы сосредоточимся на ручное выскабливание.

Для ручной соскоб оборотная изменения размера, формы царапины и накопления клеток на краях нуля. Многие протоколы существуют, и высоко цитируется документ советует увеличена скорость и/или тщательного мытья после царапин¹³. Кроме того некоторые методы были использованы для сведения к минимуму распространения, поскольку распространение клетки не могут быть отделены от миграции и поэтому может дать ложно положительных результатов миграции. Некоторые сообщили, что методы являются сыворотки голода предшествующего нуля¹⁴ и уменьшается количество сыворотки¹⁵. Однако ни один из этих методов можно обеспечить, что нет никакого распространения. Таким образом мы приводим предварительной обработки клеток с митомицин C обеспечить реальные результаты миграции. Митомицин C — антибиотик, который подавляет синтез ДНК, формируя ковалентной связи с ДНК, которая предотвращает разделение¹⁶ДНК. Путем предварительной обработки с митомицин C и мойки с PBS до царапин, обнаруженных закрытия разрыва демонстрирует истинный миграции клеток (рис. 1).

Характерной особенностью всех методов является необходимость создания системы для анализа процесса миграции¹⁷. Общей и недорогой метод для анализа прогресса заключается в использовании микроскопом свет поле принять изображения нуля в предопределенное время точках, следуют анализ закрытия разрыва в образ программного обеспечения^18,19. Этот метод является длительным, ненадежные отношении фотографировать на том же месте и фокус, и движение от инкубатора для камеры сил циклы изменения температуры во время съемки. Были разработаны другие методы для обнаружения миграции путем измерения тока. Текущие изменения, как клетки охватывают больше места на табличке, который читается как увеличение импеданса²⁰. Путем измерения импеданса, средой клеток не влияет, и поэтому считается неинвазивный метод. Этот метод полагается на специализированных пластины с золотых электродов, которые являются дорогими, но они включить обнаружение многих процессов, таких как сотовый присоединению, распространения, миграции и гибели клеток. Большим недостатком этого метода является измерение импеданса не указывать непосредственно миграции, поскольку такие факторы, как температура имеют большое влияние на сопротивление. Изменения в сопротивление может быть вызвана несколько факторов, которые не проверены программного обеспечения, затрудняет анализ данных. Таким образом отсутствие визуализация требует обычных световой микроскоп для проверки миграции.

Чтобы преодолеть многие из недостатков имеющихся методов, мы используем реального времени автоматизированных оптической камеры. Оптическая камера является системой обнаружения с микроскопом высокой пропускной способности в небольшой платформе с объективом, блок подсветки и цифровой фотоаппарат. Она имеет встроенный программного обеспечения, которое можно проверить, миграции и распространения среди других вещей. Чтобы обнаружить миграции, два алгоритмы используются для анализа роста и кинетика миграции клеток, которые называются распространения и ранозаживляющее анализа, соответственно. Анализ распространения основе алгоритма сегментации изображения двухэтапный, которая применяет текстуру анализ различий между районами охватывает ячейки (показано желтым цветом) и пустой фон области путем анализа передовых гистограммы. Ранозаживляющее анализ основан на три шага алгоритма, который обнаруживает монослое клеток, находит разрыва раны и определяет ширина зазора. Эти действия проводятся в моменты времени, определяемые пользователем, и данные представлены как крытой площади, ширина зазора и разрыв области. Одним из главных преимуществ этой машины является, что он позволяет изображений адэрентных клеток через жидкости из-за угла камеры²¹. Изображения камеры lenstakes наклонена, которые, согласно прогнозам, z стек одной плоскости z генерировать для обеспечения того, чтобы фотографии в фокусе (рис. 2). z стеки создаются путем слияния серии фотографий (например 40) перпендикулярно к краю рану и через всю рану. Z стеки позволяет захвата глубины слоя клеток, а также в фокальной плоскости через рану. Кроме того серии изображений могут быть объединены в коллекцию видео изображения, с одним нажатием кнопки.

Мы демонстрируем оптимизированный протокол для обнаружения миграции в линии клеток кератиноцитов HaCaT. Мы проверили, лактоферрин и его N-терминальный пептида, Lactoferricin, от людей и коров, чтобы анализировать их влияние на миграцию, как было продемонстрировано, что эти молекулы имеют многочисленные приложения как антимикробное и иммунной, модулирует молекулы^{22 , 23}. четыре соединения были по сравнению с необработанными HaCaT клеток и эпидермального фактора роста (EGF) был использован в качестве позитивного элемента управления.

протокол

Экспериментальной установки не имеет этических и правовых ограничений и было проведено по согласованию с университет Роскилле. Обзор экспериментальной установки можно увидеть на рисунке 1 и механизмами оптической камеры на рисунке 2.

1. Подготовка

1. Выполните все шаги в лавочке стерильных ламинарного потока путем очистки скамейке и все оборудование с 70% этанол до начала эксперимента.
2. Место оптическую камеру в обычных инкубатора при 37 ° C с 5% CO₂ для обеспечения оптимальных условий для клеток.
3. Растут HaCaT клеток в среде DMEM СМИ с 10% FBS и 1 x антибиотики (пенициллин и стрептомицин) в колбе T75.
4. Используйте 1 мл 1 x трипсина отсоединить клетки и югу культивировать их каждые 3-4 дня, путем диспергирования сотовой слоя. Нагреть до комнатной температуры перед использованием.

2. формирование монослоя HaCaT клеток в плите микротитровальных 48-Уэллс

1. Удалите носитель из T75 колбу с пипетка Пастера.
2. Вымойте адэрентных клеток в колбу, добавив 5 мл стерильной ПБС T75 колбу.
   Примечание: Убедитесь, что PBS свободного кальция и магния.
3. Распространить PBS и удалить его с пипетка Пастера.
4. Повторите шаг 2.2-2.3.
5. Добавить 1 мл 1 x трипсина в колбу и разогнать его через слоя клеток.
6. Инкубировать настой при 37 ° C в обычных инкубатор, до тех пор, пока отдельные клетки (5-8 мин является достаточным для большинства клеточных линий).
7. Смотреть под микроскопом, если отдельные клетки. После того, как отдельные клетки, добавить 9 мл регулярные СМИ культуры с 10% FBS для инактивации 1 x трипсина.
8. Подсчитать ячейки с либо Горяева Коултер счетчик или аналогичный.
   Примечание: Трипановый синий может использоваться для просмотра мертвые клетки. Однако в 1 x трипсина HaCaT клетки являются идеально круглой когда жив.
9. 7.5 x 10⁴ клетки/колодец в средствах массовой информации FBS 10% 250 мкл передать круглодонные 48-ну тканевые культуры плиты (стандартная пластина).
   Примечание: Assay можно также настроить в 6-, 12-, 24- или 96-луночных пластины, которые могут быть assayed под оптический микроскоп.
10. Осторожно двигаться пластину из стороны в сторону, чтобы убедиться, что клетки одинаково распределены в скважинах, или клетки соберутся в центре скважин. Проверить под микроскопом света, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределяется в средствах массовой информации
11. Установите пластину в обычных инкубатор CO₂ при 37 ° C, на ночь, или до тех пор, пока клетки присоединились к нижней части скважины.

3. Добавление стимулы для миграции эффекты

1. Проверьте, если скважины 90-95% притока под микроскопом света.
2. Подготовка 10 мкг/мл митомицин C в соответствующее количество среды.
   Примечание: В этом исследовании митомицин C хранится при температуре 4 ° C в раствор на 1 мг/мл. Митомицин C в растворе может храниться до одной недели в темноте при температуре 2-8 ° C.
3. Удаление отработанного СМИ с пипетка Пастера из каждой скважины.
4. Добавьте 250 мкл 5 мкг/мл митомицин C в каждой скважине.
5. Инкубируйте пластину для 2 ч при 37 ° C и 5% CO₂.
6. Подготовьте раздражители пептидов путем разбавления их в соответствующее количество среды.
   Примечание: В этом исследовании как человека и говядину лактоферрин и Lactoferricin были протестированы на 25 мкг/мл в объеме 250 мкл
7. Удалите носитель с митомицин C с пипетка Пастера.
8. Промойте скважин, Пипетка 1 x с 250 мкл 1 x PBS (комнатной температуры) и удалить моют Пастер.
9. 250 мкл ПБС и вручную поцарапать скважин вертикально с 200 мкл кончиком пипетки. Используйте новый наконечник пипетки для каждой скважины.
10. Удалите PBS и добавьте 250 мкл пептид раздражителей.
11. Установите крепежную пластину в оптической камеры системы, регулируя винты с обеих сторон плиты. Оставьте крышку на микротитровальных табличке.
    Примечание: Камера может работать с открытой при необходимости крышкой.

4. Настройка программы для оптической камеры на компьютер

1. Нажмите кнопку получить в панели слева.
2. Выберите функцию, заживление ран в панели слева.
3. Выберите тип пластины, нажав ниже иллюстрации пластины.
4. Отменить выбор скважин, не в использовании, помечая их и нажмите кнопку включить в верхнем левом углу на экране.
   Примечание: По умолчанию выбраны все скважины.
5. Отрегулируйте фокус объектива на скважинах, чтобы соответствовать позиции ячейки правой кнопкой мыши на одной из скважин.
   Примечание: Автофокусировки также может регулироваться вручную путем перемещения панели справа на рисунке пластины.
6. Задайте период времени для изображений под Картину интервал (например (00: 30:00)).
7. Задайте количество повторов подогнать нужный период (например 97 повторений).
8. Запустите запустить, нажав кнопку « Пуск » в правом нижнем углу.

Результаты

HaCaT — линия клеток кератиноцитов, один из самых распространенных типов клеток в коже. Когда происходит рану, клетки кожи начинают размножаться и мигрируют через рану спать, чтобы закрыть рану (рис. 3). Оба процесса являются, таким образом, первостепенное ...

Обсуждение

О важности миграции в исследованиях развития, заживление ран, иммунологии и рака привело к несколько различных методов для изучения миграции. Миграция может быть выражением расширения или закрытия разрыва клетками. Чаще всего закрытие нуля проверяется, как это легче расти клеток в мон...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro