Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo

Resumen

Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo principios y el método de parafina de seccionamiento y contratinción. Este es un procedimiento fácil y rápido para controlar la expresión génica durante el desarrollo que puede aplicarse también a las secciones de tejido, órganos o células cultivadas.

Resumen

La Escherichia coli LacZ codificación del gene, β-galactosidasa, se utiliza en gran parte como reportera de expresión génica y como trazador en estudios de linaje celular. La reacción histoquímica clásica se basa en la hidrólisis del sustrato X-gal en combinación con los iones férricos y ferrosos, que produce un precipitado insoluble de azul que es fácil de visualizar. Por lo tanto, actividad β-galactosidasa sirve como marcador para el patrón de expresión del gen de interés, medida que avanza el desarrollo. Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo temprano y el posterior método de parafina de seccionamiento y contratinción. Además, se proporciona un procedimiento para clarificar todo embriones para visualizar mejor coloración en regiones más profundas del embrión de X-gal. Resultados se obtienen mediante la realización de este procedimiento, aunque optimización de condiciones de la reacción es necesaria para minimizar la actividad de fondo. Limitaciones en el análisis se deben también considerar, particularmente con respecto al tamaño del embrión en el Monte toda la coloración. Nuestro protocolo proporciona un sensible y un método confiable para la detección de β-galactosidasa durante el desarrollo del ratón que puede ser aún más aplicado a las secciones de criostato como órganos enteros. Así, los patrones de expresión dinámica gene a lo largo del desarrollo se pueden analizar fácilmente mediante el uso de este protocolo en embriones de todo, pero también expresión detallada a nivel celular puede ser evaluada después de parafina secciones.

Introducción

Para describir los patrones de expresión del gen específico, el uso de genes como marcadores del reportero ha sido primordial de Drosophila a mamíferos. En experimentos con animales transgénicos y knockout, el gen bacteriano de la β-galactosidasa (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) es uno de los más utilizados^{1,2,3, 4}. β-galactosidasa (β-gal) cataliza la hidrólisis de β-galactósidos (como la lactosa) en sus monosacáridos (glucosa y galactosa)⁵. Su sustrato más utilizado es X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glucósido que se hidroliza por que dé lugar a 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole y galactosa β-galactosidasa. La primera es oxidada en un dimer que, cuando se utiliza combinado con potasio ferri- y ferro-cianuro, produce un característico insoluble, precipitado de color azul (figura 1)⁶.

El gene del LacZ comenzó a usarse como un gen reportero hace más de treinta años de^7,8. Por lo general, se inserta el LacZ aguas abajo de un promotor endógeno en el lugar del marco de lectura abierto, por lo que puede ser utilizado en la cultura bacteriana y celular para visualizar las células que contienen un relleno especial, así como en animales transgénicos como un trazador de endógeno patrones de expresión génica durante el desarrollo⁹. En este sentido, la visualización de actividad β-galactosidasa se ha ampliamente utilizada en Drosophila para entender los procesos del desarrollo y celulares de las células a los tejidos todos. Genética de la Drosophila a favor de la generación de líneas estables en los que una construcción de elemento P modificada que contiene el gen reportero que lacZ es insertada al azar localizaciones en el genoma. Así, cuando se coloca bajo la influencia de elementos de reforzador puede conducir su expresión en una forma específica de tejido, que ha permitido el análisis sistemático de los patrones de expresión de muchos genes durante los últimos dos décadas¹⁰. Además, el uso de ratones transgénicos para controlar la expresión del gen LacZ también permite la detección de eventos de recombinación génica en Cre-loxP mediada por recombinación y la localización de los derivados de células madre embrionarias mutantes quiméricos análisis ¹¹, que facilita el control de la expresión de LacZ en tejidos específicos, así como temporal. También, en embriones de todo, la detección de la actividad β-galactosidasa puede producir patrones de tinción diferencial en diferentes intensidades que se pueden observar convenientemente a través de diferentes etapas de desarrollo para analizar cambios temporales en la expresión del gen ^8,12.

En este artículo, presentamos un protocolo para visualizar la expresión génica a través de X-gal la coloración en el tejido de montar todo en las primeras etapas del desarrollo de embriones de ratón. Presentamos este método histoquímico como una técnica altamente sensible y económica que favorece la detección precisa de las células etiquetadas en especímenes de todo Monte o a nivel celular después de embebido de parafina tejidos o embriones. El método permite la visualización directa de la coloración en el tejido de ratón con el Fondo mínimo en comparación con otros métodos¹³.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité sobre el ética de los experimentos animales el CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) y la Comunidad Autónoma de Madrid para garantizar el mínimo sufrimiento de los animales.

1. recolección de embriones de ratones embarazadas (desde E8.5 para E12.5)

1. Sacrificio de ratones embarazadas por dislocación cervical o por inhalación de CO₂ . El día de la primera observa tapón vaginal era considerado embrionario día 0.5 (E0.5).
2. Coloque el animal en la posición supina en el cojín absorbente y limpiar la piel abdominal de ratón con etanol al 70%.
   Nota: No es necesaria la esterilidad en los siguientes pasos.
3. Pellizcar y levantar la piel abdominal con unas pinzas diente de ratón.
4. Hacer una incisión a través de la piel y la pared abdominal, 2 a 4 cm verticalmente a través de la línea media del abdomen con tijeras quirúrgicas.
5. Exponer el abdomen y quitar los cuernos uterinos de la madre con pinzas corte vasos a lo largo de la curvatura interna del útero con tijeras quirúrgicas.
6. Eliminar la cadena de los embriones y transferir a un plato de Petri en el hielo que contiene 10 mL helado 0.01 M tampón fosfato salino pH 7.4 (PBS).
7. Disecar cuidadosamente los embriones fuera del útero bajo un estereomicroscopio en una placa de Petri con PBS helado fresco 10 mL. Sujete la pared muscular con fórceps de relojeros para exponer el saco amniótico y luego rasgar la membrana amniótica para eliminar el embrión cerrado y el saco vitelino con las puntas de las pinzas.
8. Recoger los embriones littermate de ratones embarazadas en las primeras etapas (desde E8.5 para E12.5) (figura 2).
9. Transfiera los embriones a un plato fresco con 10 mL x 1 frío PBS utilizando fórceps curvado o embriones muy pequeños (E8.5 E9.5), utilizar pipetas de transferencia de plástico para recoger las muestras sin daño del embrión.
10. Antes de comenzar la fijación, tome una embrionaria muestra en un tubo de microcentrífuga para genotipificación por corte un pequeño trozo del embrión o la membrana amniótica en los embriones más pequeños (de E8.5 a E9.5) con pinzas de relojeros.
    Nota: Genotipado de LacZ es determinada por cartillas de la reacción en cadena (PCR) polimerasa: avance, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; inversa, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fijación de embriones de ratón

1. Transferir cada embrión en un tubo de microcentrífuga de 2 mL con una base redondeada que contiene 1 mL 1 x PBS.
   Nota: Realice todos los pasos en el protocolo en estos tubos con agitación utilizando un agitador de balanceo.
2. Lave los embriones en PBS 1 x durante 1 min a temperatura ambiente para eliminar la sangre restante. Pipetas de transferencia plástica de uso cambiar líquidos en los tubos.
3. Fijar el embrión en 1 mL de glutaraldehído 0.125% sobre hielo.
   Nota: El tiempo de fijación depende del tamaño del embrión: 20 min E8.5 E9.5 embriones, 30 min para embriones E10.5 y 1 h para E12.5 embriones.
4. Retirar el fijador y lave los embriones en PBS 1 x dos veces por 10 min a temperatura ambiente antes de procesar la muestra para tinción de X-gal.

3. todo montaje de β-galactosidasa histoquímica de embriones de ratón

1. Prepare X-Gal enjuague tampón y la solución de tinción de X-Gal antes de iniciar el procedimiento (ver tabla 1 y Tabla de materiales). Utilizar un embriones de tipo salvaje (WT) littermate como controles negativos para la reacción enzimática.
2. Incubar los embriones en buffer de X-Gal enjuague durante 10 minutos a temperatura ambiente (figura 2).
3. Incubar los embriones en la solución de tinción de X-Gal desde 2 h hasta toda la noche a 37 ° C, protegido de la luz. Vigilar la reacción de color periódicamente a través de un microscopio de disección hasta suficiente intensidad de la coloración azul se observa sin el fondo en el embrión. Mantener el pH de la solución entre el 8 y 9 para reducir el fondo durante la toda coloración. Si la solución de tinción se empieza a apagar luz, reemplazarlo con solución de sustrato fresco para ampliar la reacción enzimática.
4. Detener la reacción cuando la señal deseada se obtiene por lavado de embriones en un tubo de microcentrífuga con 1 mL 1 x PBS dos veces por 10 min a temperatura ambiente.
5. Transferir embriones teñidos a paraformaldehído al de 4% 1 mL (PFA) para volver a fijar, durante 1 hora hasta toda la noche a 4 ° C.
   Nota: Los embriones se pueden almacenar en el 4% PFA/PBS por más tiempo a 4 º C o puede ser procesado inmediatamente para seccionamiento. Este paso de fijación final es crucial para la conservación a largo plazo del patrón de coloración.
6. Lave los embriones en PBS de 1 x 1 mL dos veces por 10 min a temperatura ambiente.
7. Opción 1: Clara embriones por inmersión en una serie de soluciones con el aumento de las concentraciones de glicerol (glicerina 20%, 40%, 60% y 80% en PBS 1 x) por 1 h a temperatura ambiente en cada solución.
   Nota: Lave los embriones en 80% de glicerol por más tiempo, incluso días, hasta que se borran y luego almacenan en glicerol al 80% a 4 ° C en este paso (figura 2). Añadiendo una pequeña cantidad de cristal de ora de azida de sodio de timol a los embriones almacenados a 4 ° C en glicerol o 1 x PBS se recomienda para prevenir el crecimiento de moho. Después de la tala, todo Monte embriones pueden utilizarse para fotografiar (paso 4).
8. Opción 2: Proceso de embriones para parafina inclusión y corte usando un micrótomo (figura 2). Documentar el patrón de expresión en toda manchados embriones antes de seccionamiento (pasos 4 y 5).

4. fotografía de toda montura embriones

1. Para fotografiar todo Monte manchado embriones antes de seccionar, transferirlas a una placa de Petri preparadas con una base de solidificado agarosa 1-2% en PBS 1 x.
2. Cubrir el embrión completamente con 10 mL 1 x PBS en los platos de agarosa recubiertas para evitar la deshidratación y la reflexión mientras fotografiaba a través del líquido.
3. Orientar el embrión inmerso en PBS de x 1 con unas pinzas. Para embriones mayores (E10.5-E12.5), hacer un pequeño agujero en la agarosa con pinzas y coloque a la muestra dentro de la misma en diferentes ángulos y para evitar la flotación libre en fotografía.
4. Coloque el plato en el escenario de Estereomicroscopio, usando la luz transmitida (etapa de menores). Cambiar entre el 'campo oscuro' y 'campo brillante' ajustes para configurar la iluminación deseada en fotografía y para optimizar la transparencia de la muestra.
   Nota: Use iluminación óptica de fibra para la etapa posterior de embriones para evitar la reflexión en la superficie del embrión. Al fotografiar embriones hayan borrado, siga el mismo procedimiento pero transferirlas a una placa Petri conteniendo glicerol al 100% y sumergirlos completamente.

5. parafina inclusión y seccionamiento de X-gal manchado embriones

1. Inclusión de parafina
   1. Retire el gal X manchada embriones de 4 ° C (paso 3.5) y lavarlas con 1 mL 1 x PBS tres veces para eliminar el exceso de fijador.
   2. Transferir cada embrión en una casete de histología con unas pinzas.
   3. Colocar las cintas que contienen los embriones en un vaso de precipitados y luego deshidratar pasando a través de una serie gradual de etanol a temperatura ambiente: etanol al 70%, una vez durante 30 minutos; etanol al 96%, dos veces por 30 min cada uno; etanol 100%, dos veces por 30 minutos cada uno.
      Nota: Los embriones se pueden almacenar en etanol al 70% durante un tiempo indeterminado a 4 º C hasta comenzar el proceso de deshidratación.
   4. Incubar el casete todo en isopropanol durante 30 min a temperatura ambiente.
   5. Mediante el uso de fórceps, transferir las cintas a un vaso que contiene isopropanol precalentado a través de la coloración y dejar en el horno a 60 ° C durante 30 minutos.
   6. Los cassettes en un nuevo vidrio que contiene una mezcla de isopropanol al 50% a través de tinción / 50% derritió la cera de parafina y dejar durante 4 horas en un horno de 60 ° C.
   7. Incubar los casetes con los embriones con dos cambios de fundido de cera de parafina, 30 min a 60 C °.
   8. Al final de la colada final parafina, abrir el cassette y transferir cada embrión a un tejido separado incrustar molde para ver la muestra bajo un estereomicroscopio.
   9. Llenar el pozo con cera de parafina fundida a 60 ° C. Uso de pinzas calientes para mantener la cera fundida y orientar cuidadosamente los embriones en el molde.
      Nota: La orientación correcta de la muestra es un paso crítico para seccionar el embrión en el plano deseado.
   10. Antes de parafina se solidifica en el molde, coloque un cassette sin tapa en la parte superior del bloque y llenarlo con cera de parafina fundida. Deje enfriar el resto cera hasta que se solidificó durante la noche a temperatura ambiente.
   11. Una vez que la parafina está completamente solidificada, desmoldar el bloque sólido y almacenar los bloques de parafina a temperatura ambiente o a 4 ° C hasta¹⁴de seccionamiento.
2. Secciones de parafina
   1. Oriente la hoja en el microtomo y configurar 5-7 μm de espesor. 5.2.2. enfriar el bloque de parafina en el hielo y cortar para producir un cubo o una pirámide.
   2. Fijar el bloque al titular del micrótomo utilizando una pequeña cantidad de cera fundida.
   3. Oriente el bloque para el corte óptimo. Sección de los bloques de parafina en rodajas de 5-7 μm a temperatura ambiente mediante micrótomo estándar.
   4. Con un pincel fino, colocar los elementos en un baño de agua a temperatura ambiente durante la manipulación y selección de rebanadas.
   5. Recoge secciones del baño de agua con un portaobjetos de microscopio y transferirlos a un baño de agua a 42 ° C para estirar.
   6. Quitar las secciones del baño de agua y colocarlos suavemente en portaobjetos de adhesión.
   7. Las diapositivas en una estufa a 37 ° C durante la noche para permitir que las secciones se adhieran completamente en seco, de lo contrario, pueden perderse durante la tinción.
      Nota: Almacene las diapositivas a 4 ° C hasta a partir de procedimientos de tinción.
3. Parafina y contratinción de secciones de la parafina teñida de Gal X
   1. Poner los portaobjetos en una bandeja portaobjetos en horno a 60 ° C durante al menos 45 minutos hacer más fluida la cera de parafina.
   2. Transfiera los portaobjetos en un rack y usar tinción platos de vidrio para realizar los siguientes pasos: sumerja la rejilla en los recipientes de tinción que contienen alcoholes de disminuir las concentraciones de retiro completo parafina e hidratación de los tejidos: isopropanol durante 5 min a 60 ° C; isopropanol durante 3 min; etanol al 100% por 2 min; etanol al 96% por 1 min; etanol al 70% durante 1 min a temperatura ambiente.
   3. Enjuague las secciones en agua destilada dos veces para asegurarse de que no hay ningunos residuos de alcohol.
   4. Contratinción secciones con una mancha (e.g. solución Nuclear Fast Red) durante 5 minutos (generalmente entre 3-8 minutos) a temperatura ambiente (figura 2).
      Nota: Esta tinción permite para revelar la estructura general del tejido en las secciones.
   5. Después de la tinción, lave los portaobjetos en agua destilada por 1 min y verifique la sección de tinción al microscopio.
      Nota: Si la coloración deseada es muy débil, contraste las secciones otra vez por más tiempo.
   6. Deshidratar las secciones en las siguientes series con el aumento de las concentraciones de etanol: dos lavados en etanol al 95% por 2 min, dos lava en etanol al 100% por 2 min, y para evitar la disolución azul precipitados de color, un lavado rápido en xileno.
   7. Quite las diapositivas de la parrilla uno por uno y colocarlos en un pedazo de papel. Entonces Monte y cubreobjetos cada diapositiva utilizando un medio de montaje sintético, permanente.
      Nota: Xileno es un producto inflamable, cuyos vapores son irritantes y nocivos para la salud humana y para los organismos acuáticos. Debe ser manipulada dentro de una campana y requiere el uso de equipo de protección adecuado.

Resultados

A continuación os mostramos los resultados de la aplicación del protocolo estándar para la reacción histoquímica de β-galactosidasa utilizando a X-gal como el sustrato en embriones de ratón entero (figura 1 y figura 2). Mediante este protocolo, se examina la membrana tipo 4-matriz metaloproteinasa (Mt4-mmp) la expresión en las diferentes etapas del desarrollo embrionarias (E9.5 E11.5 y E12.5) con Mt4-mmp ratones mutantes ...

Discusión

El gen LacZ de e. coli ha sido ampliamente utilizado como reportero en los estudios de patrones de expresión génica debido a su alta sensibilidad y facilidad de detección. El presente Protocolo describe un método clásico para detectar la expresión de β-gal basada en una reacción enzimática que es fácil y rápido de realizar y barato. Este método también puede aplicarse sin modificaciones importantes en todo montaje embriones, órganos intactos, secciones de criostato del tejido o células cultivadas....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	24137-1L-R
Agarose	SCHARLAU	50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium	VECTOR LABS	H-5501
Synthetic mounting media	MERCK	100579
96% Ethanol	PROLABO	20824365
99.9% Ethanol absolute	SCHARLAU	ET00021000
50% Glutaraldehyde solution	SIGMA-ALDRICH	G6403-100ml
85% Glycerol	MERCK	104094
99.9% Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5516
Magnesium chloride hexahydrate	SIGMA-ALDRICH	63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40)	SIGMA-ALDRICH	542334
Nuclear Fast Red counterstain	SIGMA-ALDRICH	N3020
Paraffin pastilles	MERCK	111609
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets)	SIGMA-ALDRICH	P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate	MERCK	1049840500
Potassium ferrocyanide	MERCK	1049731000
Sodium azide	SIGMA-ALDRICH	S8032
Sodium deoxycholate	SIGMA-ALDRICH	30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	SIGMA-ALDRICH	106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate	SIGMA-ALDRICH	71638
Thymol	SIGMA-ALDRICH	T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)	SIGMA-ALDRICH	10812846001 (Roche)
X-GAL	VENN NOVA	R-0004-1000
Xylene	VWR CHEMICALS	VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm	SAKURA	4566
Rotatory Microtome	Leica	RM2235
Cassettes	Oxford Trade	OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm	VWR	ECN631-1575
Microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	J1820AMNZ
Flotation Water bath	Leica	HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades	Feather	UDM-R35
Paraffin oven	J.R. SELECTA	2000205
Wax Paraffin dispenser	J.R. SELECTA	4000490
Stereomicroscope	Leica	DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL	SIGMA-ALDRICH	T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	SIGMA-ALDRICH	T9661
Orbital shaker	IKA Labortechnik	HS250 BASIC
Stirring Hot Plate	Bibby	HB502
Vortex Shaker	IKA Labortechnik	MS1
Laboratory scale	GRAM	FH-2000
Precision scale	Sartorius	ISO9001
pHmeter	Crison	Basic 20
Optic fiber	Optech	PL2000