Suivi de l’Expression génique par la détection d’activité β-galactosidase dans des embryons de souris entière

Résumé

Nous décrivons ici le protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase dans des embryons de souris tout au début et à la méthode paraffine sectionnement et contre-coloration. Il s’agit d’une procédure simple et rapide pour contrôler l’expression des gènes au cours du développement qui peut également être appliquée à des coupes de tissus, organes ou cellules en culture.

Résumé

Le gène de l’Escherichia coli LacZ , codant la β-galactosidase, est largement utilisé comme reporter pour l’expression des gènes et comme traceur dans les études de lignée de cellules. La réaction classique histochimique est issue de l’hydrolyse du substrat X-gal en combinaison avec les ions ferreux et ferreux, qui produit un précipité insoluble bleu qui est facile à visualiser. Par conséquent, activité β-galactosidase sert de marqueur pour le modèle d’expression du gène d’intérêt à mesure que le développement progresse. Nous décrivons ici le protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase dans des embryons de souris tout début et la méthode suivante paraffine sectionnement et contre-coloration. En outre, une procédure pour clarifier les embryons entiers est fournie pour mieux visualiser le X-gal de coloration dans les régions plus profondes de l’embryon. Résultats cohérents obtenus à la suite de cette procédure, bien que l’optimisation des conditions de réaction est nécessaire pour réduire l’activité de fond. Limitations lors de l’essai devraient être considérées, notamment quant à la taille de l’embryon dans la coloration entière de support. Notre protocole prévoit un sensible et une méthode fiable pour la détection de la β-galactosidase lors du développement de souris qui peut s’appliquer davantage à la sections cryostat, mais aussi les organes entiers. Ainsi, les patrons d’expression de gène dynamique tout au long du développement peuvent être analysés facilement à l’aide de ce protocole dans les embryons entiers, mais aussi expression détaillée au niveau cellulaire peut être évaluée après le sectionnement de la paraffine.

Introduction

Afin de décrire des profils d’expression génique spécifique, l’utilisation de gènes marqueurs a été primordiale de drosophile aux mammifères. Dans les expériences impliquant des animaux transgéniques et knock-out, le gène de la β-galactosidase bactérienne (LacZ) d' Escherichia coli (e. coli) est l’un des plus largement utilisé^{1,2,3, 4}. β-galactosidase (β-gal) catalyse l’hydrolyse des β-galactosides (tels que le lactose) dans son monosaccharides (glucose et galactose)⁵. Son substrat plus couramment utilisé est le X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glucoside qui est hydrolysé par une β-galactosidase donnant lieu à 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole et le galactose. Le premier est oxydé en un dimère qui, lorsqu’il est utilisé combiné avec potassium ferri- et ferro-cyanure, produit une caractéristique insoluble, couleur bleue précipiter (Figure 1)⁶.

Le gène LacZ ont commencé à être utilisé comme un gène rapporteur il y a plus de trente ans^7,8. Habituellement, les LacZ est inséré en aval d’un promoteur endogène à la place de la trame de lecture ouverte, donc il peut être utilisé dans la culture bactérienne et cellule de visualiser les cellules contenant un insert en particulier, ainsi que chez les animaux transgéniques comme traceur d’endogène profils d’expression génique au cours du développement⁹. À cet égard, la visualisation de l’activité β-galactosidase a été largement utilisée chez la drosophile pour comprendre les processus cellulaires et du développement de cellules individuelles à tissus entiers. Drosophila génétique favorise la génération de lignes stables dans laquelle une construction élément P modifiée contenant le gène rapporteur que lacZ est inséré au hasard des endroits dans le génome. Ainsi, lorsqu’il est placé sous l’influence d’éléments activateurs il peut conduire son expression d’une manière spécifique de tissu, qui a permis l’analyse systématique des modèles expression de nombreux gènes pendant les dernières deux décennies¹⁰. En outre, l’utilisation de souris transgéniques pour surveiller l’expression du gène LacZ permet aussi détection des événements de recombinaison du gène par Cre-loxP médiée par recombinaison et localisation des dérivés mutant les cellules souches embryonnaires dans les analyses chimériques ¹¹, qui facilite le contrôle de l’expression de LacZ dans des tissus spécifiques ainsi que dans le temps. En outre, dans les embryons entiers, détection de l’activité β-galactosidase peut-être produire des colorations différentielles à des intensités différentes que l'on peut observer commodément à travers des stades différents de développement pour analyser les changements temporels dans l’expression des gènes ^8,,¹².

Dans cet article, nous présentons un protocole afin de visualiser l’expression des gènes par le biais de X-gal coloration dans les tissus de support entier aux premiers stades du développement des embryons de souris. Nous présentons cette méthode histochimique comme une technique très sensible et peu coûteuse qui favorise la détection précise des cellules marquées au niveau cellulaire ou dans des échantillons de toute monture après que paraffine encastré de tissus ou embryons. La méthode permet la visualisation directe de la coloration dans les tissus de souris avec le fond minimal par rapport aux autres méthodes de¹³.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale du CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) et de la Comunidad Autónoma de Madrid pour assurer minimal animal souffrant.

1. la collecte d’embryons de souris enceintes (à partir de E8.5 à E12.5)

1. Sacrifier des souris enceintes par dislocation cervicale ou inhalation de CO₂ . Le jour de la première observée plug vaginal était considéré comme embryonnaire jour 0.5 (E0.5).
2. Posez l’animal en position couchée sur le tampon absorbant et nettoyer la peau abdominale de la souris avec l’éthanol à 70 %.
   Remarque : La stérilité n’est pas nécessaire dans les étapes suivantes.
3. Pincez et soulever la peau abdominale à l’aide de pinces à souris à dents.
4. Faites une incision à travers la peau et la paroi abdominale, 2 à 4 cm verticalement dans l’ensemble de la ligne médiane de l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
5. Exposer l’abdomen et retirer les cornes utérines de la mère avec pince coupe vaisseaux le long de la courbure intérieure de l’utérus avec des ciseaux chirurgicaux.
6. Retirez la corde d’embryons et la transférer sur un plat de Pétri sur glace contenant 10 mL glacee 0,01 M tampon phosphate salin pH 7,4 (PBS).
7. Soigneusement disséquer les embryons en dehors de l’utérus sous un stéréomicroscope dans une boîte de Pétri avec 10 mL de PBS glacée fraîche. Saisir la paroi musculaire avec une pince de grands noms pour exposer la cavité amniotique et puis déchirer la membrane amniotique pour enlever l’embryon clos et le sac vitellin à l’aide de la pointe de la pince.
8. Rassembler les embryons de la même portée de souris enceintes des stades précoces (à partir de E8.5 à E12.5) (Figure 2).
9. Transférer les embryons dans un plat frais avec du PBS de froid 1 x 10 mL avec une pincette courbée ou, pour les très petits embryons (E8.5-E9.5), utiliser des pipettes de transfert en plastique pour recueillir les échantillons sans dommage de l’embryon.
10. Avant de commencer la fixation, prendre un échantillon embryonnaire dans un tube de microcentrifuge de génotypage en coupe un petit morceau de l’embryon ou en prenant la membrane amniotique chez les embryons plus petits (à partir de E8.5 à E9.5) avec une pince des horlogers.
    NOTE : LacZ génotypage est déterminée par des amorces polymerase chain reaction (PCR) : avant, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´ ; Reverse, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fixation des embryons de souris

1. Transférer chaque embryon dans un tube de microcentrifuge de 2 mL avec une base arrondie contenant du PBS 1 x 1 mL.
   Remarque : Exécutez toutes les étapes du protocole dans ces tubes en agitant le mélange à l’aide d’un agitateur de roulement.
2. Lavez les embryons dans du PBS 1 x pendant 1 min à température ambiante pour éliminer le sang restant. Utiliser les pipettes de transfert en plastique pour changer des liquides dans les tubes.
3. Fixer l’embryon dans 1 mL de 0,125 % glutaraldéhyde sur la glace.
   NOTE : Le temps de fixation dépend de la taille de l’embryon : 20 mn pour les embryons de E8.5-E9.5, 30 min pour les embryons E10.5 et 1 h pour les embryons E12.5.
4. Retirez le fixateur et lavez les embryons dans du PBS 1 x deux fois pendant 10 min à température ambiante avant de traiter l’échantillon pour la coloration de X-gal.

3. toute monture β-galactosidase histochimie d’embryons de souris

1. Tampon de rinçage X-Gal prepare et Solution de X-Gal coloration avant de commencer la procédure (voir tableau 1 et Table des matières). Utiliser un embryons de même portée sauvage (WT) comme témoins négatifs pour la réaction enzymatique.
2. Incuber les embryons dans un tampon de X-Gal rincer pendant 10 min à température ambiante (Figure 2).
3. Incuber les embryons dans la Solution de coloration de X-Gal de 2 h à une nuit à 37 ° C, abri de la lumière. Surveiller la réaction de couleur périodiquement par un microscope à dissection jusqu'à ce qu’on observe une intensité suffisante de coloration bleu sans le fond dans l’embryon. Garder le pH de la solution entre 8 et 9 pour réduire le fond durant la toute coloration. Si la solution colorante commence à allumer la lumière, remplacez-la par la solution de substrat frais d’étendre la réaction enzymatique.
4. Arrêter la réaction lorsque le signal désiré est obtenu en lavant les embryons dans un tube de microcentrifuge avec du PBS 1 x 1 mL deux fois plus de 10 min chacun, à température ambiante.
5. Transfert des embryons colorés à 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pour les re-fixer, pendant 1 h à une nuit à 4 ° C.
   Remarque : Les embryons peuvent être stockés dans 4 % PFA/PBS pour les plus longs à 4 ° C ou peut être traité immédiatement pour le sectionnement. Cette étape de fixation définitive est fondamentale pour la conservation à long terme du modèle coloration.
6. Lavez les embryons dans du PBS 1 x 1 mL deux fois pendant 10 min à température ambiante.
7. Option 1 : Désactivez les embryons par immersion dans une série de solutions avec des concentrations croissantes de glycérol (20 %, 40 %, 60 % et 80 % de glycérol dans du PBS 1 x) pendant 1 h à température ambiante dans chaque solution.
   Remarque : Lavez les embryons dans 80 % de glycérol pour les plus longs, voire des jours, jusqu'à ce qu’ils sont effacés et puis les stocker dans 80 % de glycérol à 4 ° C à cette étape (Figure 2). Ajout d’une très petite quantité de sodium azide ora cristaux de thymol pour les embryons stockés à 4 ° C en glycérol ou 1 x PBS est recommandée pour prévenir la croissance de moisissures. Après compensation, embryons de support entier peuvent être utilisés pour photographier (étape 4).
8. Option 2 : Traiter les embryons paraffine incorporation et la découpe à l’aide d’un microtome (Figure 2). Le document le modèle d’expression chez les embryons tout tachés avant sectionnement (étapes 4 et 5).

4. photographie d’embryons entiers de Mont

1. Pour photographier toute monture coloré des embryons avant incision, transférez-les sur un plat de Pétri préparé à base de solidifié 1-2 % d’agarose dans du PBS 1 x.
2. Couvrir l’embryon complètement avec 10 mL 1 x PBS dans les plats revêtus d’agarose pour prévenir la déshydratation et la réflexion alors qu’elle photographiait à travers le liquide.
3. Orientez l’embryon plongé dans 1 x PBS avec une pincette. Pour les plus vieux embryons (E10.5-E12.5), faire un petit trou dans l’agarose avec une pince pour placer et positionner l’échantillon qu’il contient à des angles différents et éviter le flottant au cours de la photographie.
4. Placez le plat sur la scène du stéréomicroscope, à l’aide de la lumière transmise (stade sous). La variation entre le « champ sombre » et ajustements « lumineux-zone » pour régler l’éclairage désiré au cours de photographie et d’optimiser la translucidité de l’échantillon.
   Remarque : Utilisez l’illumination optique de fibre pour les embryons de stade avancé pour éviter la réflexion à la surface de l’embryon. Lorsque vous photographiez des embryons défrichées, suivez la même procédure mais les transférer sur un plat de Pétri contenant 100 % de glycérol et les plonger pleinement.

5. paraffine incorporation et sectionnement du X-gal teinté d’embryons

1. Enrobage de paraffine
   1. Enlever le X-gal coloré des embryons de 4 ° C (étape 3.5) et les laver avec du PBS 1 x 1 mL trois fois pour éliminer l’excès de fixatif.
   2. Chaque embryon transférer une cassette d’histologie avec une pincette.
   3. Placez les cassettes contenant les embryons dans un bécher et déshydrater puis en les passant à travers une série graduée de l’éthanol à température ambiante : éthanol à 70 %, une fois pour 30 min ; éthanol à 96 %, deux fois pour 30 min chacun ; éthanol à 100 %, deux fois pour chaque 30 min.
      Remarque : Les embryons peuvent être stockés dans l’éthanol à 70 % pour un temps indéterminé à 4 ° C jusqu’au début du processus de déshydratation.
   4. Incuber la cassette entière dans l’isopropanol pendant 30 min à température ambiante.
   5. À l’aide de pinces, transférer les cassettes sur un verre creux contenant préchauffé isopropanol de coloration et de laisser dans une étuve à 60 ° C pendant 30 min.
   6. Placer les cassettes dans un verre nouvel coloration creux contenant un mélange d’alcool isopropylique 50 % / 50 % fondu de cire de paraffine et laisser pendant 4 h dans un four à 60 ° C.
   7. Incuber les cassettes avec les embryons avec deux changements de paraffine fondue, 30 min à 60 ° C.
   8. À la fin du cycle de lavage final de paraffine, ouvrir la cassette et transférer chaque embryon dans un tissu séparé enrobage moule pour afficher l’exemple sous un stéréomicroscope.
   9. Remplir le puits de cire de paraffine fondue à 60 ° C. Utilisez des pinces chauffées pour garder la cire fondue et orienter avec soin l’embryon dans le moule.
      Remarque : L’orientation correcte de l’échantillon est une étape cruciale pour le sectionnement de l’embryon dans le plan désiré.
   10. Avant la paraffine se solidifie dans le moule, placez une cassette sans le couvercle sur le dessus du bloc et remplissez-le avec la cire de paraffine fondue. Laissez refroidir le cire restante jusqu'à ce que solidifié du jour au lendemain à la température ambiante.
   11. Une fois la paraffine est complètement solidifiée, retirer le bloc du moule et stocker les blocs de paraffine à 4 ° C ou à température ambiante jusqu'à ce que la section¹⁴.
2. Sectionnement de paraffine
   1. Orienter la lame sur le microtome et mis en place 5-7 µm d’épaisseur. 5.2.2. refroidir le bloc de paraffine sur la glace et la garniture pour produire un cube ou une pyramide.
   2. Et placez le bloc le microtome à l’aide d’une petite quantité de cire fondue.
   3. Orienter le bloc pour une coupe optimale. Section des blocs de paraffine en tranches épaisses de 5 à 7 µm à température ambiante à l’aide de microtome standard.
   4. À l’aide d’un pinceau fin, placer les sections dans un bain d’eau à température ambiante pour manipuler et sélectionnant les tranches.
   5. Ramasser des sections du bain-marie avec une lame de microscope et de les transférer dans un bain d’eau à 42 ° C pour les étirements.
   6. Retirer les sections du bain-marie et placez-les délicatement sur lames de microscope d’adhérence.
   7. Les lames bien dans une étuve à 37 ° C pendant la nuit pour permettre les sections d’adhérer complètement à sec, dans le cas contraire, ils peuvent se perdre pendant la coloration.
      NOTE : Conserver les lames à 4 ° C jusqu’au démarrage des procédures de coloration.
3. Déparaffinage et contre-coloration de Sections de paraffine X-Gal-teinté
   1. Mettre les diapositives sur un plateau lame de microscope dans une étuve à 60 ° C pendant au moins 45 min faire la cire de paraffine plus fluide.
   2. Transférer les lames dans un rack et utiliser le verre plats de coloration pour effectuer les étapes suivantes : plonger le panier dans les cuves de coloration contenant alcools de la baisse des concentrations pour enlèvement complet paraffine et l’hydratation des tissus : isopropanol pendant 5 min à 60 ° C ; isopropanol pendant 3 min ; éthanol à 100 % pendant 2 min ; éthanol à 96 % pendant 1 min ; éthanol à 70 % pendant 1 min à température ambiante.
   3. Rincer les sections dans l’eau distillée deux fois pour s’assurer qu’il n’y a aucun résidu d’alcool.
   4. Contre-coloration sections avec une tache (p. ex. solution nucléaire-Fast Red) pendant 5 min (généralement entre 3-8 min) à température ambiante (Figure 2).
      Remarque : Cette coloration permet de révéler la structure globale du tissu dans les sections.
   5. Après coloration, laver les lames dans l’eau distillée pendant 1 min et vérifier la section coloration sous le microscope.
      Remarque : Si la coloration désirée est trop faible, contre-colorant Articles encore plus longtemps.
   6. Déshydrater des sections dans les séries suivantes avec les concentrations d’éthanol : deux lavages dans l’éthanol à 95 % de 2 min chacun, deux lave dans l’éthanol à 100 % pendant 2 min de chaque, et, pour éviter la dissolution du bleu couleur précipite, juste un lavage rapide dans le xylène.
   7. Supprimer les diapositives de la grille un par un et placez-les sur une feuille de papier. Montage et lamelle chaque glissent ensuite à l’aide d’un milieu de montage permanent synthétique.
      Remarque : Le xylène est un produit inflammable dont les vapeurs sont irritantes et nocives pour la santé humaine et pour les organismes aquatiques. Il doit être manipulé dans une hotte et nécessite l’utilisation d’équipement de protection adéquat.

Résultats

Ici, nous montrons les résultats de l’application du protocole standard pour la réaction histochimique de β-galactosidase en utilisant X-gal comme substrat dans des embryons de souris entière (Figure 1 et Figure 2). En utilisant ce protocole, nous examinons la Membrane type 4-matrice métalloprotéinases (mmp-Mt4) expression à différents stades de développement embryonnaires (E9.5, E11.5 et E12.5) en utilisant des souris...

Discussion

Le gène LacZ d’e. coli a été employé couramment comme reporter dans les études des profils d’expression génique en raison de sa grande sensibilité et de la facilité de détection. Le présent protocole décrit une méthode classique pour la détection des β-gal expression basée sur une réaction enzymatique qui est facile et rapide à jouer aussi bien que bon marché. Cette méthode peut être également appliquée sans modifications majeures dans des embryons de support entier, organes intacts, de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	24137-1L-R
Agarose	SCHARLAU	50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium	VECTOR LABS	H-5501
Synthetic mounting media	MERCK	100579
96% Ethanol	PROLABO	20824365
99.9% Ethanol absolute	SCHARLAU	ET00021000
50% Glutaraldehyde solution	SIGMA-ALDRICH	G6403-100ml
85% Glycerol	MERCK	104094
99.9% Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5516
Magnesium chloride hexahydrate	SIGMA-ALDRICH	63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40)	SIGMA-ALDRICH	542334
Nuclear Fast Red counterstain	SIGMA-ALDRICH	N3020
Paraffin pastilles	MERCK	111609
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets)	SIGMA-ALDRICH	P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate	MERCK	1049840500
Potassium ferrocyanide	MERCK	1049731000
Sodium azide	SIGMA-ALDRICH	S8032
Sodium deoxycholate	SIGMA-ALDRICH	30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	SIGMA-ALDRICH	106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate	SIGMA-ALDRICH	71638
Thymol	SIGMA-ALDRICH	T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)	SIGMA-ALDRICH	10812846001 (Roche)
X-GAL	VENN NOVA	R-0004-1000
Xylene	VWR CHEMICALS	VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm	SAKURA	4566
Rotatory Microtome	Leica	RM2235
Cassettes	Oxford Trade	OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm	VWR	ECN631-1575
Microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	J1820AMNZ
Flotation Water bath	Leica	HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades	Feather	UDM-R35
Paraffin oven	J.R. SELECTA	2000205
Wax Paraffin dispenser	J.R. SELECTA	4000490
Stereomicroscope	Leica	DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL	SIGMA-ALDRICH	T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	SIGMA-ALDRICH	T9661
Orbital shaker	IKA Labortechnik	HS250 BASIC
Stirring Hot Plate	Bibby	HB502
Vortex Shaker	IKA Labortechnik	MS1
Laboratory scale	GRAM	FH-2000
Precision scale	Sartorius	ISO9001
pHmeter	Crison	Basic 20
Optic fiber	Optech	PL2000