Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

Resumen

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Resumen

En las terminales nerviosas presinápticas activo vesículas sinápticas se someten a ciclos de exo y endocitosis. Durante el reciclaje, el luminales dominios de proteínas transmembranales SV verse expuestos en la superficie celular. Una de estas proteínas es Synaptotagmin-1 (Syt1). Un anticuerpo dirigido contra el dominio luminal de Syt1, una vez añadido al medio de cultivo, se toma durante el ciclo exo-endocytotic. Esta absorción es proporcional a la cantidad de SV reciclaje y puede cuantificarse a través de inmunofluorescencia. Aquí combinamos Syt1 absorción de anticuerpos con doble transfección de neuronas hippocampal cultivadas. Esto nos permite (1) localizar sitios presinápticos en la expresión de marcadores presinápticos recombinante Synaptophysin, (2) determinar su funcionalidad mediante absorción de Syt1 y (3) caracterizar la focalización y efectos de una proteína de interés, GFP-Rogdi.

Introducción

Estudio de vesícula sináptica reciclaje es importante para determinar cómo cambian propiedades presinápticos, en plasticidad sináptica o en respuesta a la perturbación de la función sináptica. Estudio de Synaptotagmin-1 (Syt1) anticuerpos absorción proporciona un método para medir la cantidad de reciclaje de SV. Syt1 es una SV-proteína que actúa como un sensor de Ca^{2 +} y es necesario exocitóticas liberación del neurotransmisor^1,2. Es una proteína transmembrana con un dominio citoplásmico c-terminal fuera de la SV y un dominio luminal del N-terminal dentro del SV³. Durante la exocitosis, el dominio luminal de Syt1 queda expuesto al medio externo. A este medio externo, añadimos anticuerpos dirigidos contra el dominio citoplásmico, que se convierte en interiorizado durante la endocitosis. Estos anticuerpos pueden ser que ya sea previamente conjugado con fluoróforos o immunostained con anticuerpos secundarios^4,5,6,7. La intensidad de fluorescencia de la immunosignal resultante es proporcional a la cantidad de reciclaje de SV. Este enfoque puede utilizarse para determinar SV constitutiva e inducidas por despolarización reciclaje^6,8.

Ensayos de absorción de Syt1 pueden realizarse después de transferencia génica mediada por virus a prácticamente todas las células en el plato o escasa de la transfección de un pequeño número de células. Nuestro método combina el ensayo con escasa doble transfección de neuronas hippocampal primarias utilizando fosfato de calcio⁹. Utilizamos una proteína recombinante marcador sabida que se acumulan en presynapses, fluorescencia etiquetada Synaptophysin, localizar los terminales presinápticos y sobreexpresan la proteína de interés, Rogdi. Esto nos permite probar si o no Rogdi objetivos funcionales sinapsis y afecta a SV de reciclaje. La codificación Rogdi del gene fue identificado originalmente en una pantalla para mutantes de Drosophila caracterizados por alteración de la memoria¹⁰. En los seres humanos, mutaciones en el gene de Rogdi causan una enfermedad devastadora y rara llamada síndrome de Kohlschütter Tönz. Los pacientes sufren de malformaciones de esmalte dental, epilepsia farmacorresistente y retraso psicomotor; sin embargo, la localización subcelular del producto del gen seguía siendo evasiva¹¹. Así, el ensayo de absorción de Syt1 proporcionó evidencia clave para la localización de GFP con la etiqueta Rogdi en sinapsis funcional⁹.

Esta técnica de absorción tiene varios beneficios. En primer lugar, SV reciclaje puede observarse tanto en tiempo real realizando en proyección de imagen de^7,12y después de fijación^6,9 midiendo la intensidad de fluorescencia de la etiqueta de Syt1 fluorescencia. Además, se han desarrollado diversas variantes de anticuerpos Syt1. Hay variantes sin etiquetar que pueden ser etiquetadas con un anticuerpo secundario siguiendo un protocolo estándar immunostaining después de la fijación y variantes previamente conjugadas con una etiqueta de fluorescencia ya fijada. Finalmente, basados en anticuerpos de fluorescencia es ventajosa debido a la gran variedad de tintes secundarios o conjugados comercialmente disponibles que se pueden utilizar.

Cuando la fijación y el immunostaining las neuronas, también es posible teñir proteínas adicionales y realizar análisis de colocalización. Esto puede ayudar a determinar dónde se ubican en lo referente a reciclaje SVs. La intensidad de la etiqueta de la fluorescencia es la medida directa de la cantidad de SV de reciclaje. Además, los anticuerpos selectivamente etiqueta de Syt1 que contiene estructuras, dando por resultado alta especificidad y poca fluorescencia de fondo⁴. Diferentes protocolos de estimulación pueden usarse, como buffers de despolarización o estimulación eléctrica protocolos^9,12,13,14. Sin embargo, el reciclaje de SV básico puede medirse sin estimular los cultivos neuronales¹⁵.

Nuestro método dirige específicamente Syt1 absorción de anticuerpo en las neuronas transfectadas doble con inmunomarcación de anticuerpo secundario después de la fijación. Sin embargo, nos referimos a todas las variantes usadas rutinariamente el ensayo en nuestra discusión para dar a los espectadores una oportunidad para adaptar el protocolo a necesidades específicas.

Protocolo

No se llevaron a cabo ningún estudio con animales vivos. T10/30 el número de experimentos con animales sacrificaron para obtener culturas fueron aprobadas por las autoridades locales de protección animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) bajo la aprobación de la célula. Los experimentos se realizaron con los protocolos aprobados.

1. primario de la célula hipocampal cultura

1. Preparar el cultivo de células disociadas del hipocampo de rata en el día embrionario 19^16,17. Las células sobre cubreobjetos de 12 mm recubierto con polietilamina (PEI) en platos de 24 pozos a una densidad de 50.000-60.000 células/pocillo de la placa. Comprobar la densidad usando una celda óptica de contraste de fase y cámara de conteo.
2. Las neuronas de la cultura durante 3 días (día en vitro (DIV) 3) en un plato 24-well en la incubadora a 37 ° C con 5% CO₂.
3. Evaluar el cubreobjetos para indicadores de salud de la célula mediante microscopía de luz transmitida (por ejemplo, fase contraste la óptica en un aumento de 10-20 X). Busque los siguientes indicadores de buena salud: un halo de contraste de fase clara, neuritas sin estructuras de cuentas y no soma clustering o neurita liar.

2. transfección

Nota: El siguiente protocolo se refiere a una doble transfección para pozos de 3. Sin embargo, el protocolo funciona mejor cuando se preparan cantidades suficientes para pozos de 4.

1. Preparar 500 mL de tampón de transfección (274 mM NaCl, 10 mM de KCl, 1,4 Na₂HPO₄, glucosa de 15 mM, 42 mM HEPES) en un matraz Erlenmeyer.
   1. Disolver 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na₂HPO₄, 1,35 g de glucosa y 5,0 g de HEPES en 400 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer.
   2. Ajustar el pH a 6.95 con 1 NaOH M usando un medidor de pH.
   3. Ajuste el volumen con agua destilada a 500 mL y verificar el pH con un medidor de pH.
   4. Tomar alícuotas de 20-30 mL de tampón de la transfección con los siguientes valores de pH por pipeteo 1 M NaOH al buffer de transfección: 6,96 6.97 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      Nota: El pH del buffer de la transfección es crucial para la eficacia de transfección.
   5. Para probar que la transfección tampón conduce a la mayor cantidad de células transfected, prueba cada valor de pH de 6,96 a 7.11. Utilice el método de transfección descrito en 2.2 2.11 y un plásmido validado expresando GFP. Determinar el número de células transfected por cubreobjetos para cada valor de pH de buffer de transfección evaluar qué tampón funciona mejor.
   6. Alícuota del búfer con la más alta eficiencia de transfección en tubos de microcentrífuga de 2 mL congelar y almacenar los tubos a-20 ° C.
2. Caliente previamente el suero reducido medio, medio de cultivo celular y agua destilada a 37 ° C en el baño de agua.
3. Preparar la mezcla de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Trabajar bajo campana de flujo laminar para garantizar condiciones de trabajo estéril.
   1. Mezcla 7,5 μl de cloruro de calcio de 2 M con 4 μg de cada ADN libre de endotoxinas (Synaptophysin mOrange y mGFP/GFP-Rogdi). Añadir agua hasta alcanzar un volumen total de 60 mL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Añadir 60 mL de tampón de transfección a la mezcla. Para obtener los mejores resultados, añadir el tampón de transfección gota a gota agitando suavemente la mezcla de ADN en el vórtice.
   3. Incubar a temperatura ambiente (RT) por 20 minutos. Evitar la agitación del tubo de incubación durante el tiempo de incubación colocando el tubo al lado de la campana de flujo laminar.
4. Bajo la campana de flujo laminar, eliminar el medio de cultivo celular "(medio condicionado del) de los pozos utilizando una pipeta de 1000 mL y almacenar en un recipiente separado en la incubadora.
5. Añadir 500 mL de medio de reducido suero a cada pozo. Incube las células a 37 ° C y 5% de CO₂ hasta que termine el período de incubación de 20 minutos (paso 2.3.3).
6. Añadir 30 mL de mezcla de transfección a cada pocillo mediante pipeteo varias gotas. Deseche los residuos en la parte inferior del tubo.
7. Después de han sido suministrados todos los pozos con mezcla de transfección, agitar suavemente la placa de 24 pocillos para garantizar la distribución de la mezcla de la transfección en el medio.
8. Incubar los pocillos durante 60 minutos a 37 ° C y 5% CO₂.
9. Retire y deseche la mezcla de transfección y lavar tres veces con medio de cultivo celular. Añadir 1 mL de medio de cultivo celular en cada pocillo e Incube por 30 segundos en RT. quitar 750 mL de medio y añadir la misma cantidad de medio fresco. Repita esta operación tres veces.
   Nota: El paso de lavado es fundamental. Mantener el tiempo que cada bien no tiene ningún medio como mínimo (es decir., quitar y reemplazar pozo por pozo) y añadir suavemente el medio de lavado.
10. Retire y deseche el medio de cultivo celular y añadir 450 mL de acondicionado medio bien-por-pozo.
11. Que las neuronas maduras en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO₂ a 10 DIV.

3. estimulación y captación de Syt1

Nota: El siguiente protocolo aplica la absorción a 3 pozos. Por despolarización de cualquier otro número de pozos, ajuste las cantidades según corresponda.

1. Preparar 50 mL de tampón de despolarización 10 x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM de MgCl₂, 20 mM CaCl₂, glucosa de 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7,4) en un matraz Erlenmeyer.
   Nota: El buffer de despolarización puede conservarse a 4 ° C durante varias semanas. Si una solución no despolarizantes también se utiliza, preparar un 10 solución de x Tyrode de 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂, 300 mM de glucosa, pH de 200 mM HEPES 7.4 con el fin de comparar la estimulación inducida por reciclaje con espontánea reciclaje. Después de la dilución a 1 x, agregue 1 μm del Tetrodotoxin antes de usar para bloquear la generación del potencial de acción.
   1. 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0.1 g de MgCl₂-6 H₂0, 0.15 g de CaCl₂-2 H₂O y 3,0 g de glucosa 1 H₂O y 2,38 g de HEPES en 50 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer se disuelven. Ajustar el pH con NaOH y filtro estéril la solución. Diluir el buffer 1:10 en agua destilada hasta alcanzar una concentración de 1 x.
2. Preparar 4% paraformaldehido (PFA) de 1 x PBS (pH 7.4) para la fijación después de la estimulación.
   1. Para 500 mL 4% PFA en PBS 1 x, disolver 20 g de paraformaldehído en 450 mL de agua destilada H₂O.
      Nota: La solución de la calefacción puede acelerar la disolución, pero no caliente la solución sobre 70 ° C, como las PDA pueden desintegrarse.
      PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, potencialmente carcinogénico y teratogénico. Use guantes cuando trabaje con PFA, trabajar bajo campana extractora y evitar la ingestión.
   2. Deje que la solución se enfríe a RT y añadir 50 mL de solución stock de 10 x PBS. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH/HCl con un medidor de pH.
3. Caliente previamente 600 mL de 1 x de buffer de despolarización y 10 mL de medio de cultivo celular a 37 ° C en el baño de agua.
4. Añadir 1 mL de anticuerpo de ratón anti-Syt1 (clon 604.2) a la 1 x buffer de despolarización y de vortex durante 10 segundos.
5. Retire y deseche el medio de cultivo celular de las células. Añadir 200 mL de la mezcla de despolarización-anticuerpo cada pozo e incubar durante 5 minutos a 37 ° C y 5% de CO₂ en la incubadora.
6. Retire y deseche la mezcla de despolarización-anticuerpo y lavar tres veces con medio de cultivo celular. Añadir 1 mL de medio de cultivo celular en cada pocillo e incube durante 30 segundos en RT. quitar 750 mL de medio y añadir la misma cantidad de medio fresco. Repetir tres veces.
7. Retire y deseche el medio de cultivo celular y agregar 300 mL de 4% PFA en PBS 1 x. Incubar 20 minutos a 4 ° C.
8. Lavado tres veces 5 minutos cada uno con PBS 1 x.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.

4. inmunocitoquímica

1. Preparar 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo.
   Nota: Bloqueo de búfer puede conservarse a-20 ° C durante varios meses.
   1. Disolver 2,5 g de sacarosa y 1 g de albúmina de suero bovino (BSA) en 5 mL de solución stock de 10 x PBS. Añadir 1,5 mL de solución detergente 10%. Agitar la solución hasta que todos los componentes se disuelvan bien y añadir agua destilada H₂O hasta un volumen final de 50 mL. Alícuota de la solución y la congelación de las alícuotas para el almacenamiento.
2. Diluir el anticuerpo secundario, fluoróforo acoplado (dirigido contra la especie de Syt1-anticuerpo primaria) en 200 mL de solución amortiguadora de bloqueo en cada pozo, a una dilución de 1: 1000.
3. Retire y deseche el PBS 1 x de cada uno bueno con un cubreobjetos.
4. Añadir 200 mL de mezcla de tampón-anticuerpo para cada pozo de bloqueo e incubar 60 minutos a TA.
   PRECAUCIÓN: Debido a los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz, todos los pasos de avance deben realizarse en la oscuridad.
5. Después de la incubación, lavar las células 3 veces durante 5 minutos con 1 mL de PBS 1 x.
6. Incrustar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con el medio de inclusión.
   1. Añada una gota de 7 mL de incrustación medio sobre el portaobjetos. Quite el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos levantando con una jeringa y agarrar con pinzas.
      PRECAUCIÓN: Las células en la superficie del cubreobjetos se dañan fácilmente, para que fórceps deben manejarse con cuidado.
   2. El cubreobjetos de la inmersión en agua destilada para eliminar el PBS y secar cuidadosamente por tocar un borde a un tejido suave.
   3. Voltear el cubreobjetos sobre la gota media incrustación, por lo que la superficie que las células enfrenta el portaobjetos, incorporación de tal modo las células en el medio de inclusión.
7. Deja los portaobjetos se seca bajo el capó para 1-2 h (cubierta para evitar la exposición a la luz) y guardarlos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 ° C.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.

5. microscópico análisis

1. Después de secan el cubreobjetos, colocarlos bajo el microscopio con el objetivo y la cámara.
2. Ajuste el tiempo de exposición para cada canal de modo que algunos píxeles sobreexpuestas para una máxima distribución de valores de gris.
   Nota: Mientras que el tiempo de exposición puede variar entre los canales, debe ser constante para un canal asegurar la comparabilidad entre el cubreobjetos.
3. Adquisición de imágenes de varios canales para 10 regiones de interés (ROIs) por cubreobjetos. Compruebe que el ROI contiene procesos axonales de una neurona transfected comprobando que la fluorescencia de GFP, que debe ser punteada.

6. estadístico análisis

1. Exportar las imágenes como archivos de .tif. Cargar las imágenes en OpenView¹⁸ haciendo clic en archivo | Cargar archivo de imagen.
2. Elegir la imagen de Synaptophysin mOrange como canal 1, la imagen de Rogdi-GFP/mGFP como canal 2 y la imagen de fluorescencia Alexa647 como canal 3.
3. Umbral de los ROIs.
   1. Haga clic en análisis | Área de lugar sobre el orificio. Elija valores umbral e intensidad del Delta que en la inspección visual, se excluye la fluorescencia difusa, dejando sólo punteada las señales en la imagen del canal 1 (representación Synaptophysin mOrange fluorescencia). Mantener el umbral mismo de todas las imágenes.
4. Transferir estos ROIs en el correspondiente canal 2 (fluorescencia de GFP-Rogdi/mGFP) y 3 (Syt1-fluorescencia) de cada área del cubreobjetos haciendo clic en Ejecutar ahora.
   Nota: El ROI sólo debe considerar si la celda está transfected doble. En este método, mOrange y GFP fluorescencia debe ser claramente visible.
5. Guardar los datos en el editor de registro de análisis haciendo clic en los datos de registro.
6. Abra el editor de registro de análisis en la pestaña de Windows y copiar los valores para cada canal. Pegar los valores de los canales separados en una hoja de cálculo.
7. Determinar la intensidad de fluorescencia media del canal Syt1 en ROIs en ambas condiciones de transfección (GFP-Rogdi y mGFP).
8. Aplicar las pruebas estadísticas apropiadas como Student t-test para determinar diferencias significativas.

Resultados

Un resultado previsto de este enfoque es localizar aproximadamente 50 doble-transfected las neuronas por cubreobjetos en densidades de 50.000 neuronas por pozo. El axón de cada neurona se espera para mostrar múltiples zonas interactivas de acumulación Synaptophysin fluorescencia etiquetada, indicando grupos ofSVs. En los sitios presinápticos funcionales, la señal de Synaptophysin recombinante colocalizes con fluorescencia Syt1 punteada. Doble transfección, GFP-Rogdi como la proteín...

Discusión

Hay tres ensayos utilizados habitualmente para el estudio de vesícula sináptica (SV) reciclaje. Los dos primeros incluyen el uso de un) styryl fluorescente tintes como el FM1-43 (que incorporan en las membranas, se toman en orgánulos durante la endocitosis y se liberan después de exocitosis); y b) con la etiqueta fluorescente proteínas recombinantes de SV (que, a la sobreexpresión, incorporan a la maquinaria proteica de reciclaje). Si los fluoróforos acoplados cambian su fluorescencia dependiendo del pH, puede usa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
B27	Gibco	17504-044
BSA	Sigma	A7030-50g
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306-100g
CoolSNAP HQ2	Photometrics
dH2O	Invitrogen	15230
DABCO	Merck	8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647	Jackson-Immunoresearch	715605151	antibody
DMEM	Invitrogen	41966
DPBS	Gibco	14190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120094
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
tube (50 mL)	Greiner Bio-One	227261
FBS superior	BiochromAG	S0615
Glucose	Merck	1,083,421,000
HBSS	Invitrogen	14170
HEPES	Sigma	H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)	ThermoElectron Corporation
KCL	Sigma-Aldrich	P9541-500g
L-Glutamin	Gibco	25030
MgCl2	Honeywell	M0250-500g
microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Microsoft Excel	Microsoft
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
Neurobasal	Invitrogen	21103049
OpenView Experiment Analysis Application	Free software, see comments		written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x)	Roche	11666789001
Optimem	Invitrogen	31985
Penstrep	Gibco	15140-122
PFA	Sigma	P6148-1kg
safety hood	ThermoElectron		Serial No. 40649111
Sucrose	neoFroxx	1104kg001
Synaptotagmin1	Synaptic Systems	105311	mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Water bath	GFL	1004
Zeiss Observer. Z1	Zeiss