Overexpressing 突触前蛋白培养神经元突触囊泡再生的光学检测

摘要

我们描述了一种用于培养神经元的突触囊泡 (SV) 循环的光学检测方法。将该协议与双转染相结合, 以表达突触前标记和感兴趣的蛋白质, 使我们能够定位突触前的部位, 它们的突触囊泡再生能力, 并确定感兴趣的蛋白质的作用。

摘要

在主动突触前神经终端, 突触囊泡经历了外周和吞的循环。在回收过程中, SV 跨膜蛋白的腔域在细胞表面暴露。其中一种蛋白质是 Synaptotagmin-1 (Syt1)。对 Syt1 的腔域进行的抗体, 一旦添加到培养基中, 就会在 endocytotic 周期内被占用。这种吸收量与 SV 循环的数量成正比, 可以通过免疫荧光进行量化。在这里, 我们结合 Syt1 抗体摄取与双转染培养海马神经元。这使我们能够 (1) 根据重组突触前标记突触素的表达来本地化突触前站点, (2) 使用 Syt1 摄取确定它们的功能, (3) 描述了一种感兴趣的蛋白质的靶向性和作用, GFP-Rogdi。

引言

研究突触囊泡回收在确定突触前的性质如何改变, 无论是在突触可塑性或响应突触功能的扰动。研究 Synaptotagmin-1 (Syt1) 抗体摄取提供了一种测量 SV 循环量的方法。Syt1 是一种 SV 相关蛋白, 充当 Ca^{2 +}传感器, 是 exocytotic 释放神经递质^1,2的必要条件。它是一种跨膜蛋白, 具有 C 末端细胞质域外的 sv 和 n-端腔内域的 sv³。在胞吐作用过程中, Syt1 的腔域会暴露于外界介质中。对于这个外在的媒介, 我们增加抗体针对细胞质领域, 在吞期间被内部化。这些抗体可以是预共轭与显影或 immunostained 与二级抗体^4,5,6,7。结果 immunosignal 的荧光强度与 SV 回收量成正比。这种方法可用于确定本构和退极化诱发 SV 循环^6,8。

Syt1 摄取化验可以执行后, 病毒介导的基因转移到几乎所有的细胞在盘子里或经过稀疏转染少量的细胞。本方法将原发海马神经元的稀疏双转染法与磷酸钙⁹结合使用。我们使用一种已知的重组标记蛋白积累在 presynapses, 荧光标记突触素, 找到突触前终端和过度表达 tshr 我们的蛋白质的兴趣, Rogdi。这使我们可以测试是否 Rogdi 目标功能突触和影响 SV 回收。基因编码 Rogdi 最初是在屏幕上发现的果蝇突变体的特点是受损的记忆¹⁰。在人类中, Rogdi 基因突变导致一种罕见的破坏性疾病, 称为 Kohlschütter-Tönz 综合征。患者患有牙釉质畸形、pharmacoresistant 癫痫、精神运动迟缓;然而, 基因产物的亚细胞定位仍然是难以捉摸的¹¹。因此, Syt1 摄取检测为 GFP 标记的 Rogdi 在功能突触⁹的定位提供了关键的证据。

这种吸收技术有几个好处。首先, 通过测量 Syt1 荧光标签的荧光强度, 可以实时观测到^7、12、^6、9的活度成像, 从而实现 SV 循环。此外, 还开发了几种 Syt1 抗体变种。有未加标签的变体, 可以在固定后使用标准染色协议标记为继发抗体, 并附有荧光标签的预共轭变种。最后, 抗体为基础的荧光是有利的, 因为大量选择的商业可用的二级或共轭染料, 可以使用。

当固定和染色神经元时, 也有可能染色额外的蛋白质和进行定位分析。这可以帮助确定它们的位置与回收 SVs 的关系。荧光标签的强度是 SV 回收量的直接度量。此外, 抗体有选择地标记 Syt1-containing 结构, 导致高特异性和小背景荧光⁴。也可以使用不同的刺激协议, 如退极化缓冲器或电刺激协议^9,12,13,14。但是, 在不刺激神经元培养¹⁵的情况下, 可以测量基底 SV 循环。

我们的方法专门解决了双转染神经元的 Syt1 抗体摄取与继发抗体 immunolabeling 固定后。但是, 我们在讨论中提到了所有常规使用的方法变体, 使观众有机会根据具体需要调整该协议。

研究方案

没有研究与活动物进行。有关安乐死动物获得细胞培养的实验得到了当地动物保护当局 (Tierschutzkommission Universitätsmedizin) 的批准, T10/30 批准号。这些实验是通过批准的协议进行的。

1. 初级海马细胞培养

1. 制备大鼠海马的离解细胞培养在胚胎天 19^16,17。将12毫米盖玻片上的细胞涂上聚乙烯亚胺 (裴), 在24井的菜肴中, 密度为 5万-6万细胞/井。使用细胞计数室和相位对比光学检查密度。
2. 培养神经元3天 (天在体外(DIV) 3) 在24井板材在孵化器在37°c 与 5% CO₂。
3. 使用透射光显微镜 (例如,相位对比光学放大 10-20X) 评估细胞健康指标的盖玻片。检查以下健康状况指标: 清晰的相衬晕, 无串珠结构的突起, 无躯体聚类或突起捆绑。

2. 转染

注: 以下协议是指对3口井进行双转染。然而, 当准备足够的4口水井时, 该议定书的效果最好。

1. 在锥形瓶中准备500毫升转染缓冲器 (274 毫米氯化钠, 10 毫米氯化钾, 1.4 毫米 Na₂HPO₄, 15 毫米葡萄糖, 42 毫米 HEPES)。
   1. 溶出8.0 克氯化钠, 0.37 克氯化钾, 0.095 克钠₂HPO₄, 葡萄糖1.35 克, HEPES 5.0 毫升的锥形瓶中的蒸馏水。
   2. 使用 ph 计将 ph 值调整为6.95 和1米氢氧化钠。
   3. 用蒸馏水将容积调整到500毫升, 用 ph 计检查 ph 值。
   4. 使 20-30 毫升整除数的转染缓冲器具有以下 pH 值由吹打1米氢氧化钠到转染缓冲器: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06。
      注: 转染缓冲液的 pH 值对转染效果至关重要。
   5. 要测试哪个转染缓冲器会导致最大数量的被染细胞, 请从6.96 到7.11 测试每个 pH 值。使用 2.2-2.11 中描述的转染方法和一种表达 GFP 的验证质粒。确定每盖玻片转染的缓冲液 pH 值, 以评估哪个缓冲器工作最好。
   6. 整除最高转染效率为2毫升的缓冲离心管冷冻和存储管在-20 摄氏度。
2. 预暖的减少血清培养基, 细胞培养培养基, 蒸馏水到37°c 在水浴。
3. 在1.5 毫升离心管中准备转染组合。在层流罩下工作, 确保无菌工作条件。
   1. 混合7.5 µL 2 米氯化钙与4µg 每个无内毒素的 DNA (突触素 mOrange 和 mGFP/GFP-Rogdi)。在1.5 毫升的离心管中加入水, 达到60毫升的总容积。
   2. 将60毫升的转染缓冲器添加到混合中。为了获得最好的结果, 添加转染缓冲滴, 同时摇动 DNA 混合轻轻地在漩涡。
   3. 室温 (RT) 孵育20分钟。在孵化时间内, 在层流罩旁边放置管, 避免摇晃孵化管。
4. 在层流罩下, 用1000毫升吸管从油井中取出细胞培养介质 ("条件介质"), 并将其存储在孵化器的单独容器中。
5. 每井加500毫升的血清培养基。孵化细胞在37°c 和 5% CO₂ , 直到20分钟潜伏期 (步骤 2.3.3) 结束。
6. 通过吹打几滴, 加入30毫升的转染混合。丢弃管子底部的残渣。
7. 在所有的水井都提供了转染混合, 轻轻摇动24井板, 以确保分配的转染混合在介质中。
8. 在37摄氏度和 5% CO₂上孵化水井60分钟。
9. 去除并丢弃转染混合, 用细胞培养培养基清洗三次。在每一个井中添加1毫升细胞培养培养基, 并在 RT 中孵化30秒. 除去750毫升培养基, 加入相同数量的新鲜培养基。重复这三次。
   注意: 洗涤步骤至关重要。保持每一个井的时间至少没有介质 (i., 拆卸和更换好), 并轻轻地添加洗涤介质。
10. 去除和丢弃细胞培养培养基, 再加450毫升的条件培养基。
11. 让神经细胞成熟在孵化器在37°c 和 5% CO₂到 DIV 10。

3. 刺激和 Syt1 吸收

注: 以下协议适用于3口井的吸收。对于任何其他数量的井的退极化, 相应地调整金额。

1. 在锥形瓶中准备50毫升的10x 退极化缓冲器 (640 毫米氯化钠, 700 毫米氯化钾, 10 毫米氯化镁₂, 20 毫米 CaCl₂, 300 毫米葡萄糖, 200 毫米 HEPES, pH 7.4)。
   注意: 退极化缓冲可以保持在4摄氏度, 几个星期。如果还使用非去极化型解决方案, 请准备一个 10x Tyrode 的解决方案, 包括 1290年 mM 氯化钠, 50 毫米氯化钾, 10 毫米氯化镁₂, 20 毫米 CaCl₂, 300 毫米葡萄糖, 200 毫米 HEPES pH 7.4, 以比较刺激诱导循环与自发回收。稀释至1x 后, 在使用前添加1µM 的河豚毒素以阻止动作电位的产生。
   1. 溶解1.87 克氯化钠, 2.61 克氯化钾, 0.1 克氯化镁₂-6H₂0, 0.15 克 CaCl₂-2H₂o 和3.0 克 glucose-1 H₂o 和 2.38 g HEPES 在50毫升蒸馏水在锥形瓶。用氢氧化钠和无菌过滤溶液来调节 pH 值。稀释1:10 的冷凝水中的缓冲液, 达到1x 浓度。
2. 在 1x PBS (pH 7.4) 中准备4% 多聚甲醛 (粉煤灰), 用于刺激后的固定。
   1. 在 1x PBS 中, 500 毫升4% 粉煤灰, 溶解20克多聚甲醛在450毫升蒸馏 H₂O。
      注: 加热溶液可能加速溶解, 但不加热溶液超过70摄氏度, 因为煤灰可能会解体。
      注意: 粉煤灰是有毒的, 潜在的致癌性和致畸。与煤灰一起工作时戴上手套, 在通风罩下干活, 避免进食。
   2. 让解决方案冷却 RT 和添加50毫升的 10x PBS 股票解决方案。使用 ph 计, 用氢氧化钠/HCl 将 ph 值调整为7.4。
3. 预热600毫升的1x 退极化缓冲器和10毫升的细胞培养培养基到37°c 在水浴。
4. 添加1毫升的小鼠 anti-Syt1 抗体 (克隆 604.2) 到1x 退极化缓冲和漩涡10秒。
5. 从单元格中移除和丢弃单元格培养基。添加200毫升的退极化抗体混合到每个井和孵化5分钟37摄氏度和 5% CO₂在孵化器。
6. 去除和丢弃去极化抗体混合, 用细胞培养培养基清洗三次。在每一个井中加入1毫升细胞培养培养基, 在 RT 中孵育30秒. 除去750毫升培养基, 加入相同数量的新鲜培养基。重复三次。
7. 去除和丢弃细胞培养基, 在 1x PBS 中加入300毫升4% 的粉煤灰。孵育20分钟, 在4摄氏度。
8. 每5分钟洗三次, 每个 1x PBS。
   注意: 协议可以在这里暂停。

4. 免疫细胞化学

1. 准备50毫升的阻塞缓冲器。
   注: 阻塞缓冲器可保持在-20 摄氏度, 数月。
   1. 将2.5 克蔗糖和1克牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在5毫升的 10x PBS 溶液中。添加1.5 毫升10% 洗涤剂库存解决方案。搅拌解决方案, 直到所有的组件已正确溶解, 并添加蒸馏 H₂O, 直到达到最终的体积50毫升。整除解决方案并冻结存储整除数。
2. 稀释二次, 荧光偶联抗体 (针对主要 Syt1-antibody 种) 在每井200毫升的阻塞缓冲液稀释1:1000。
3. 卸下并丢弃包含盖玻片的每个井中的 1x PBS。
4. 在每一个井中加入200毫升的阻断缓冲抗体混合物, 在 RT 中孵化60分钟。
   注意: 由于次级抗体是光敏的, 所有前进的步骤必须在黑暗中执行。
5. 孵化后, 用1毫升 1x PBS 冲洗细胞三次, 5 分钟。
6. 用嵌入介质将盖玻片嵌入显微镜幻灯片中。
   1. 在显微镜滑梯上添加7毫升的嵌入介质。用注射器把盖玻片从24井板上取出, 然后用镊子抓。
      注意: 盖玻片表面的细胞容易受损, 因此必须小心处理镊子。
   2. 将盖玻片浸入蒸馏水中, 去除 PBS, 并通过触摸一个边缘到软组织来仔细干燥。
   3. 将盖玻片翻转到嵌入介质滴上, 使带细胞的表面面对显微镜滑动, 从而将细胞嵌入到嵌入介质中。
7. 将幻灯片放在引擎盖下面晾干 1-2 小时 (覆盖它们以避免曝光), 并将它们存储在显微镜下的滑动盒中, 温度为4摄氏度。
   注意: 协议可以在这里暂停。

5. 微观分析

1. 盖玻片干燥后, 将其置于显微镜下, 目标和摄像头。
2. 调整每个通道的曝光时间, 使少量像素过度曝光, 以确保灰度值的最大分布。
   注意: 虽然通道之间的曝光时间可能不同, 但一个通道应保持恒定, 以确保盖玻片之间的可比性。
3. 获取每盖玻片10个感兴趣区域 (ROIs) 的多通道图像。检查 ROI 是否包含经转染的神经元的轴突过程, 检查 GFP 荧光, 这应该是有点的。

6. 统计分析

1. 将图像导出为. tif 文件。通过单击 "文件", 将图像加载到 OpenView¹⁸中 |加载图像文件。
2. 选择突触素 mOrange 图像作为通道 1, Rogdi GFP/mGFP 图像作为通道 2, Alexa647 荧光图像作为通道3。
3. ROIs 的门槛。
   1. 点击分析|把面积超过 puncta。选择阈值和增量强度值, 以便在目视检查时, 排除漫射荧光, 只留下通道 1 (代表突触素-mOrange 荧光) 图像中的点状信号。对所有图像保持相同的阈值。
4. 通过单击 "立即执行", 将这些 ROIs 转移到相应的通道 2 (GFP-Rogdi/mGFP 荧光) 和每个盖玻片区域的 3 (Syt1-fluorescence)。
   注意: 只有当单元格被双向转染时, 才应考虑 ROIs。在这种方法中, mOrange 和 GFP 荧光应该是清晰可见的。
5. 通过单击 "日志数据" 将数据保存到分析日志编辑器中。
6. 在 " Windows " 选项卡下打开分析日志编辑器, 并复制每个通道的值。将单独通道的值粘贴到电子表格中。
7. 确定 Syt1-channel 在 ROIs 转染条件下的平均荧光强度 (GFP-Rogdi 和 mGFP)。
8. 应用适当的统计测试, 如学生的t 检验, 以确定显著的差异。

结果

这种方法的预期结果是每盖玻片大约有50个双转染神经元, 每一个密度为5万个神经元。每个神经元的轴突将显示荧光标记的突触素堆积的多个热点, 表明簇 ofSVs。在功能突触前部位, 重组突触素信号 colocalizes 有点 Syt1 荧光。使用双转染, 无论是 GFP-Rogdi 作为感兴趣的蛋白质 (图 1) 或 mGFP, 因为该控制与重组突触素共同表达。

讨论

有三项常规用于研究突触囊泡 (SV) 回收。前两项包括使用 a) 荧光苯乙烯染料, 如 FM1-43 (纳入膜, 在吞期间被纳入细胞器, 并在胞吐作用后释放);和 b) 荧光标记重组 SV 蛋白 (在过度表达后, 纳入蛋白质回收机械)。如果附加的显影根据 pH 值改变荧光, 它们可以用来监测 SV 酸性内部和胞外培养基 ph 值的变化。用 GFP 的 pH 敏感变种标记的重组蛋白称为 Phluorins。所讨论的两种分析方法都有以前^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
B27	Gibco	17504-044
BSA	Sigma	A7030-50g
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306-100g
CoolSNAP HQ2	Photometrics
dH2O	Invitrogen	15230
DABCO	Merck	8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647	Jackson-Immunoresearch	715605151	antibody
DMEM	Invitrogen	41966
DPBS	Gibco	14190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120094
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
tube (50 mL)	Greiner Bio-One	227261
FBS superior	BiochromAG	S0615
Glucose	Merck	1,083,421,000
HBSS	Invitrogen	14170
HEPES	Sigma	H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)	ThermoElectron Corporation
KCL	Sigma-Aldrich	P9541-500g
L-Glutamin	Gibco	25030
MgCl2	Honeywell	M0250-500g
microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Microsoft Excel	Microsoft
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
Neurobasal	Invitrogen	21103049
OpenView Experiment Analysis Application	Free software, see comments		written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x)	Roche	11666789001
Optimem	Invitrogen	31985
Penstrep	Gibco	15140-122
PFA	Sigma	P6148-1kg
safety hood	ThermoElectron		Serial No. 40649111
Sucrose	neoFroxx	1104kg001
Synaptotagmin1	Synaptic Systems	105311	mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Water bath	GFL	1004
Zeiss Observer. Z1	Zeiss