Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

Résumé

Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.

Résumé

À terminaisons nerveuses présynaptiques actives, les vésicules synaptiques subissent des cycles d’exo - et l’endocytose. Lors du recyclage, les domaines luminales de protéines transmembranaires SV deviennent exposés à la surface cellulaire. Une de ces protéines est synaptotagmine-1 (Syt1). Un anticorps dirigé contre le domaine luminal de Syt1, une fois ajoutée au milieu de culture, est repris pendant le cycle exo-endocytose. Cette absorption est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV et peut être quantifiée par immunofluorescence. Ici, nous combinons l’absorption anticorps Syt1 avec double transfection des neurones hippocampal cultivés. Cela permet de nous (1) localiser les sites présynaptiques basées sur l’expression du marqueur présynaptique recombinant synaptophysine, (2) déterminer leurs fonctionnalités à l’aide de l’absorption Syt1 et (3) caractérisent le ciblage et les effets d’une protéine d’intérêt, GFP-Rogdi.

Introduction

Étudier le recyclage de la vésicule synaptique est importante pour déterminer comment les propriétés présynaptiques changent, soit au cours de la plasticité synaptique, ou en réponse à la perturbation de la fonction synaptique. Étudier la synaptotagmine-1 (Syt1) absorption anticorps fournit une méthode de mesure de la quantité de recyclage de la SV. SYT1 est une protéine associée aux SV qui agit comme un capteur de Ca^{2 +} et est nécessaire pour la libération du neurotransmetteur^1,2exocytotique. C’est une protéine transmembranaire avec un domaine cytoplasmique C-terminal en dehors de la SV et un domaine luminal N-terminal à l’intérieur de la SV³. Au cours de l’exocytose, le domaine luminal de Syt1 devient exposé au milieu externe. Dans ce milieu externe, nous ajoutons des anticorps dirigés contre le domaine cytoplasmique, qui devient intériorisé au cours de l’endocytose. Ces anticorps peuvent être que soit des conjugués avec fluorophores ou immunomarquage avec anticorps secondaires^4,5,6,7. L’intensité de la fluorescence de l’immunosignal qui en résulte est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV. Cette approche peut servir à déterminer la SV constitutive et induite par une dépolarisation recyclage^6,8.

Essais de captation SYT1 peuvent être effectuées après le transfert de gène induite par le virus à presque toutes les cellules dans le plat ou après transfection clairsemée d’un petit nombre de cellules. Notre méthode allie l’analyse clairsemée double transfection des neurones de l’hippocampe primaires à l’aide de phosphate de calcium⁹. Nous utilisons une protéine recombinante marqueur connue pour s’accumuler à presynapses, synaptophysine fluorescent étiqueté, pour localiser les terminaisons présynaptiques et surexpriment notre protéine d’intérêt, Rogdi. Cela nous permet de tester si oui ou non Rogdi objectifs fonctionnels synapses et affecte SV recyclage. Le gène codant pour la Rogdi a été initialement identifié dans un écran pour des mutants de Drosophila caractérisées par des troubles de la mémoire¹⁰. Chez l’homme, des mutations du gène Rogdi causent une maladie rare et dévastatrice appelée syndrome de Kohlschütter-Tönz. Les patients souffrent de malformations de l’émail dentaire, l’épilepsie pharmacorésistantes et des retards psychomoteurs ; Cependant, la localisation subcellulaire du produit du gène est resté insaisissable¹¹. Ainsi, l’essai d’absorption Syt1 fourni des éléments de preuve fondamentaux pour la localisation de GFP-étiquetée Rogdi à synapses fonctionnelles⁹.

Cette technique d’absorption a plusieurs avantages. Tout d’abord, SV recyclage peut être observée aussi bien en temps réel en effectuant le live d’imagerie^7,12et après fixation^6,9 en mesurant l’intensité de la fluorescence de l’étiquette de fluorescence Syt1. En outre, plusieurs variantes d’anticorps Syt1 ont été développés. Il y a des variantes sans étiquette qui peuvent être marqués avec un anticorps secondaire suite à un protocole standard immunostaining après fixation et variantes des conjugués avec une étiquette de fluorescence déjà fixée. Enfin, la fluorescence à base d’anticorps est avantageuse en raison de la grande sélection de disponible dans le commerce secondaires ou conjugués des colorants qui peuvent être utilisés.

Lorsque fixation et immunostaining les neurones, il est également possible souiller des protéines supplémentaires et effectuer des analyses de colocalisation. Cela peut aider à déterminer où ils se trouvent en ce qui concerne le recyclage SVs. L’intensité de l’étiquette de fluorescence est la mesure directe de la quantité de SV recyclage. En outre, les anticorps étiquette sélectivement les structures contenant Syt1, ayant pour résultat une spécificité élevée et peu de fluorescence de fond⁴. Protocoles de stimulation différents permet également, tels que les tampons de dépolarisation ou protocoles de stimulation électrique^9,12,13,14. Toutefois, les basales SV recyclage peut être mesurée sans stimuler les cultures de neurones¹⁵.

Notre méthode s’adresse spécifiquement Syt1 absorption d’anticorps dans les neurones double transfectées avec l’anticorps secondaire immunomarquage après fixation. Cependant, nous nous référons à toutes les variantes utilisées systématiquement du dosage dans notre discussion pour donner aux téléspectateurs l’occasion d’adapter le protocole à des besoins spécifiques.

Protocole

Aucune étude avec des animaux vivants ont été menées. Expériences impliquant des animaux euthanasiés pour obtenir cell cultures ont été approuvées par les autorités locales de protection animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sous le numéro T10/30. Les expériences ont été menées avec les protocoles approuvés.

1. Culture de cellules hippocampiques primaire

1. Préparer la culture de cellules dissociées de l’hippocampe du rat le jour embryonnaire 19^16,17. Plaque de cellules de lamelles de 12 mm recouvert de POLYÉTHYLÈNEIMINE (PEI) dans les plats de 24 puits à une densité de 50 000-60 000 cellules par puits. Vérifier la densité à l’aide d’une cellule de comptage optique de contraste de phase et de la chambre.
2. Les neurones de la culture pendant 3 jours (jour in vitro (DIV) 3) dans une plaque 24 puits dans l’incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
3. Évaluer les lamelles couvre-objet pour les indicateurs de la santé de cellules au microscope photonique transmissible (p. ex., phase contraste optique à un grossissement de X 10-20). Vérifier les indicateurs suivants d’une bonne santé : un halo de contraste de phase claire, neurites sans structures perlés et aucun soma clustering ou le groupage des neurites.

2. la transfection

Remarque : Le protocole suivant fait référence à une double-transfection pour 3 puits. Toutefois, le protocole fonctionne mieux lorsque les quantités suffisantes pour 4 puits sont préparées.

1. Préparer 500 mL de tampon de transfection (274 mM NaCl, KCl, 1,4 mM Na₂HPO₄, glucose de 15 mM, 42 mM HEPES 10 mM) dans un erlenmeyer.
   1. Dissoudre 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na₂HPO₄, 1,35 g de glucose et 5,0 g de HEPES dans 400 mL d’eau distillée dans une fiole d’Erlenmeyer.
   2. Ajuster le pH à 6,95 avec 1 NaOH M, à l’aide d’un pH-mètre.
   3. Réglez le volume d’eau distillée à 500 mL et vérifier le pH à l’aide d’un pH-mètre.
   4. Faire 20-30 ml de tampon de transfection avec les valeurs suivantes de pH par pipetage 1 M NaOH dans le tampon de transfection : 6,96 6,97, 6,98, 6,99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      Nota : Le pH de la mémoire tampon de transfection est crucial pour l’efficacité de transfection.
   5. Pour tester ce qui conduit de tampon de transfection pour le plus grand nombre de cellules transfectées, tester chaque valeur de pH de 6.96 à 7.11. Utilisez la méthode de transfection décrite dans 2.2-2.11 et un plasmide validé exprimant la GFP. Déterminer le nombre de cellules transfectées par lamelle couvre-objet pour chaque valeur de pH tampon de transfection évaluer quel tampon fonctionne le mieux.
   6. Aliquoter le tampon avec la plus grande efficacité de transfection dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL congeler et stocker les tubes à-20 ° C.
2. Réchauffez le sérum réduit milieu, milieu de culture cellulaire et l’eau distillée à 37 ° C dans un bain-marie.
3. Préparer le mélange de transfection dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Travailler sous la hotte à flux laminaire pour assurer des conditions de travail stérile.
   1. Mix 7,5 µL de chlorure de calcium 2 M avec 4 µg de chaque ADN exempte d’endotoxine (synaptophysine-mOrange et mGFP/GFP-Rogdi). Ajouter de l’eau pour atteindre un volume total de 60 mL dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
   2. Ajouter 60 mL de tampon de transfection au mélange. Pour obtenir les meilleurs résultats, ajouter le tampon de transfection goutte à goutte et en agitant le mélange en ADN doucement sur le vortex.
   3. Incuber à température ambiante (RT) pendant 20 minutes. Éviter de secouer le tube d’incubation durant le temps d’incubation en plaçant le tube à côté de la hotte à flux laminaire.
4. Sous la hotte à flux laminaire, retirer le milieu de culture cellulaire (« milieu conditionné ») provenant des puits à l’aide d’une pipette de 1000 mL et les entreposer dans un récipient séparé dans l’incubateur.
5. Ajouter 500 mL de milieu de sérum réduit dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂ jusqu'à ce que la période d’incubation de 20 minutes (étape 2.3.3).
6. Ajouter 30 mL de mélange de transfection dans chaque puits en pipettant également, quelques gouttes. Jeter les résidus au fond du tube.
7. Après que tous les puits ont été fournis avec mélange de transfection, secouez légèrement la plaque 24 puits afin d’assurer la distribution de la combinaison de transfection dans le milieu.
8. Incuber les puits pendant 60 minutes à 37 ° C et 5 % de CO₂.
9. Retirer et jeter le mélange de transfection et laver trois fois avec un milieu de culture cellulaire. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et incuber eux pendant 30 secondes à RT. supprimer 750 mL de milieu et ajouter la même quantité de milieu frais. Répétez ceci trois fois.
   Remarque : L’étape de lavage est essentielle. Garder le temps que chaque puits n’a aucun moyen au minimum (i.e., enlever et remplacer les puits par puits) et ajouter le support de laver doucement.
10. Retirer et jeter le milieu de culture cellulaire et ajouter 450 mL de la conditionnée moyen puits par puits.
11. Laissez les neurones matures dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂ à DIV 10.

3. la stimulation et l’absorption Syt1

Remarque : Le protocole suivant concerne la captation 3 puits. Pour la dépolarisation de n’importe quel autre nombre de puits, ajuster les quantités en conséquence.

1. Préparer 50 mL de tampon de dépolarisation 10 x (640 mM NaCl, KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂, glucose de 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7,4 700 mM) dans un erlenmeyer.
   Remarque : Le tampon de dépolarisation peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Si une solution non dépolarisants sert aussi, préparer un 10 solution de x Tyrode composée de 1290 mM NaCl, KCl, 10 mM MgCl₂, 50 mM 20 mM CaCl₂, 300 mM de Glucose, 200 millimètres HEPES pH 7,4 afin de comparer induite par stimulation recyclage avec spontanée le recyclage. Après dilution à 1 x, ajoutez 1 µM de tétrodotoxine avant de l’utiliser pour bloquer la génération de potentiels d’action.
   1. Dissoudre 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0,1 g de MgCl₂-6 H₂0, 0,15 g de CaCl₂-2 H₂O et 3,0 g de glucose-1 H₂O et 2,38 g de HEPES dans 50 mL d’eau distillée dans une fiole d’Erlenmeyer. Ajuster le pH avec NaOH et stérile-filtrer la solution. Diluer le tampon 01:10 dans l’eau distillée pour obtenir une concentration de 1 x.
2. Préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x (pH 7,4) pour la fixation après stimulation.
   1. Pour 500 mL de 4 % PFA dans du PBS 1 x, dissoudre 20 g de paraformaldéhyde à 450 mL de distillée H₂O.
      Remarque : La solution de chauffage peut accélérer la dissolution, mais ne pas chauffer la solution au-dessus de 70 ° C, comme l’IFP peut se désintégrer.
      ATTENTION : PFA est toxique, potentiellement cancérigène et tératogène. Portez des gants lorsque vous manipulez la PFA, travailler sous la hotte et éviter l’ingestion.
   2. Laisser refroidir les solution a RT et ajouter 50 mL de solution mère de PBS x 10. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH/HCl à l’aide d’un pH-mètre.
3. Réchauffez 600 mL de 1 x tampon de dépolarisation et 10 mL de milieu de culture cellulaire à 37 ° C dans un bain-marie.
4. Ajouter 1 mL d’anticorps de souris anti-Syt1 (clone 604.2) 1 x tampon de dépolarisation et vortex pendant 10 secondes.
5. Retirer et jeter le milieu de culture cellulaire des cellules. Ajouter 200 mL du mélange dépolarisation-anticorps à chaque puits et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans l’incubateur.
6. Retirer et jeter le mélange de dépolarisation-anticorps et laver trois fois avec un milieu de culture cellulaire. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et incuber pendant 30 secondes à RT. supprimer 750 mL de milieu et ajouter la même quantité de milieu frais. Répéter trois fois.
7. Retirez et jetez le milieu de culture cellulaire et ajouter 300 mL de 4 % PFA dans du PBS 1 x. Incuber pendant 20 minutes à 4 ° C.
8. Laver trois fois pendant 5 minutes chacun avec du PBS 1 x.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

4. immunocytochimie

1. Préparer 50 mL de tampon de blocage.
   Remarque : Tampon de blocage peut être conservé à-20 ° C pendant plusieurs mois.
   1. Dissoudre 2,5 g de saccharose et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 5 mL de solution mère de PBS x 10. Ajouter 1,5 mL de solution détergente 10 %. Agiter la solution jusqu'à ce que tous les composants ont bien dissous et ajouter distillée H₂O jusqu'à atteindre un volume de 50 mL. Partie aliquote de la solution et geler les aliquotes pour le stockage.
2. Diluer l’anticorps secondaire, couplé à un fluorophore (dirigés contre les principales espèces Syt1-anticorps) dans 200 mL de tampon de blocage dans chaque puits à une dilution de 1/1000.
3. Retirer et jeter le PBS 1 x de chaque cupule contenant un lamelle couvre-objet.
4. Ajouter 200 mL de blocage mélange tampon-anticorps dans chaque puits et incuber pendant 60 minutes à température ambiante.
   ATTENTION : Parce que les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière, aller de l’avant toutes les mesures doivent être effectuées dans l’obscurité.
5. Après incubation, laver les cellules trois fois pendant 5 minutes avec 1 mL de PBS 1 x.
6. Incorporer les lamelles sur lames de microscope avec le milieu d’enrobage.
   1. Ajouter une goutte de 7 mL d’enrobage moyen sur la lame de microscope. Retirer la lamelle de la plaque 24 puits en soulevant avec une seringue et il saisir avec une pince.
      ATTENTION : Cellules à la surface de la lamelle sont facilement endommagés, donc forceps doivent être manipulés avec soin.
   2. Tremper le couvre-objet dans l’eau distillée pour enlever les PBS et séchez-le soigneusement en appuyant sur un bord de des tissus mous.
   3. Mettez le couvre-objet sur l’encastrement gouttelettes moyennes, afin que la surface portant les cellules fait face à la lame de microscope, intégrant ainsi les cellules dans le milieu d’enrobage.
7. Laissez les diapositives à sécher sous la hotte pendant 1-2 h (couvrir afin d’éviter l’exposition à la lumière) et stockez-les dans une boîte de glissière de microscope à 4 ° C.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

5. analyse microscopique

1. Après que les lamelles sèchent, les placer sous le microscope avec l’objectif et la caméra.
2. Ajuster la durée d’exposition pour chaque canal afin que quelques pixels sont surexposés afin d’assurer une répartition maximale des valeurs de gris.
   Remarque : La durée d’exposition peut varier entre les canaux, il doit être constante pour une voie assurer la comparabilité entre les lamelles.
3. Acquisition d’images de multi-canal pour les 10 régions d’intérêt (ROIs) par lamelle couvre-objet. Vérifiez que le ROI contienne des processus axones d’un neurone transfectée en cochant GFP-fluorescence, qui devrait être ponctuée.

6. analyse statistique

1. Exporter les images sous forme de fichiers .tif. Charger les images dans OpenView¹⁸ en cliquant sur fichier | Charger le fichier image.
2. Choisissez l’image synaptophysine-mOrange Channel 1, l’image Rogdi-GFP/mGFP tant que canal 2 et l’image de fluorescence Alexa647 Channel 3.
3. Seuil des ROIs.
   1. Cliquez sur analyse | Zone de la Place au cours de l’examen. Choisissez les valeurs seuil et l’intensité de la Delta afin que lors de l’inspection visuelle, fluorescence diffuse est exclu, laissant seulement ponctuées signaux dans l’image du canal 1 (représentant synaptophysine-mOrange fluorescence). Garder le même seuil pour toutes les images.
4. Transférer ces ROIs sur le canal correspondant 2 (fluorescence GFP-Rogdi/mGFP) et 3 (Syt1-fluorescence) de chaque zone de la lamelle couvre-objet en cliquant sur Exécuter maintenant.
   Remarque : La ROIs ne doit être envisagée que si la cellule est double transfectées. Dans cette méthode, mOrange - et GFP-fluorescence doivent être clairement visible.
5. Enregistrer les données dans l’éditeur de journal d’analyse en cliquant sur les données du journal.
6. Ouvrez l’éditeur de journal d’analyse sous l’onglet Windows et copier les valeurs pour chaque canal. Collez les valeurs pour les canaux distincts dans une feuille de calcul.
7. Déterminer l’intensité de fluorescence moyenne du Syt1-chenal au ROIs dans les deux conditions de transfection (GFP-Rogdi et mGFP).
8. Appliquer les tests statistiques appropriés tels que de Student test t pour déterminer des différences significatives.

Résultats

Un résultat attendu de cette approche est localiser approximativement 50 double transfectées neurones par lamelle à une densité de 50 000 neurones par puits. L’axone de chaque neurone est censé montrer plusieurs points d’accès de fluorescent-étiquetées synaptophysine accumulation, indiquant les clusters nhsp. À des sites fonctionnels présynaptiques, le signal de synaptophysine recombinant putative ponctuée Syt1 fluorescence. À l’aide de transfection double, soit GFP-Rogd...

Discussion

Il y a trois tests couramment utilisées pour étudier les vésicules synaptiques (SV) recyclage. Les deux premiers comprennent l’utilisation d’un) styryl fluorescente colorants comme FM1-43 (qui incorporent dans les membranes et sont repris dans les organites au cours de l’endocytose sont libérés après exocytose) ; et b) fluorescent tag protéines recombinantes de SV (qui, à la surexpression, incorporent dans la machinerie protéique de recyclage). Si les fluorophores attachés changer leur fluorescence selon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
B27	Gibco	17504-044
BSA	Sigma	A7030-50g
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306-100g
CoolSNAP HQ2	Photometrics
dH2O	Invitrogen	15230
DABCO	Merck	8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647	Jackson-Immunoresearch	715605151	antibody
DMEM	Invitrogen	41966
DPBS	Gibco	14190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120094
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
tube (50 mL)	Greiner Bio-One	227261
FBS superior	BiochromAG	S0615
Glucose	Merck	1,083,421,000
HBSS	Invitrogen	14170
HEPES	Sigma	H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)	ThermoElectron Corporation
KCL	Sigma-Aldrich	P9541-500g
L-Glutamin	Gibco	25030
MgCl2	Honeywell	M0250-500g
microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Microsoft Excel	Microsoft
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
Neurobasal	Invitrogen	21103049
OpenView Experiment Analysis Application	Free software, see comments		written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x)	Roche	11666789001
Optimem	Invitrogen	31985
Penstrep	Gibco	15140-122
PFA	Sigma	P6148-1kg
safety hood	ThermoElectron		Serial No. 40649111
Sucrose	neoFroxx	1104kg001
Synaptotagmin1	Synaptic Systems	105311	mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Water bath	GFL	1004
Zeiss Observer. Z1	Zeiss