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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un test ottico per vescicole sinaptiche (SV) riciclaggio in colture di neuroni. Combinando questo protocollo con doppia transfezione di esprimere un marcatore presinaptica e la proteina di interesse ci permette di individuare siti presinaptici, loro delle vescicole sinaptiche capacità di riciclaggio e di determinare il ruolo della proteina di interesse.

Abstract

Alle terminazioni nervose presinaptiche attivo, vescicole sinaptiche sono sottoposti a cicli di exo - ed endocitosi. Durante il riciclaggio, i luminal domini delle proteine transmembrana SV diventano esposti alla superficie delle cellule. Una di queste proteine è Synaptotagmin-1 (Syt1). Un anticorpo diretto contro il dominio luminale di Syt1, una volta aggiunto al terreno di coltura, è ripreso durante il ciclo eso-endocitotico. Questo assorbimento è proporzionale alla quantità di SV riciclaggio e possa essere quantificato mediante immunofluorescenza. Qui, uniamo l'assorbimento di anticorpo Syt1 con doppia transfezione delle colture di neuroni ippocampali. Questo ci permette di (1) localizzare siti presinaptici basati sull'espressione del marcatore presinaptica ricombinante Synaptophysin, (2) determinare la loro funzionalità mediante l'assorbimento Syt1 e (3) caratterizzare il targeting e gli effetti di una proteina di interesse, GFP-Rogdi.

Introduzione

Lo studio di riciclo delle vescicole sinaptiche è importante nel determinare come modificare proprietà presinaptici, durante plasticità sinaptica o in risposta alla perturbazione della funzione sinaptica. L'assorbimento dell'anticorpo studiando Synaptotagmin-1 (Syt1) fornisce il metodo di misurazione della quantità di riciclaggio SV. Syt1 è una SV-collegata della proteina che agisce come un sensore di Ca2 + ed è necessario per il rilascio esocitotico di neurotrasmettitore1,2. È una proteina transmembrana con un dominio citoplasmico del C-terminale fuori la SV e un dominio luminale del N-terminale all'interno delle SV3. Durante l'esocitosi, il dominio luminale di Syt1 diventa esposte al mezzo esterno. A questo mezzo esterno, aggiungiamo gli anticorpi diretti contro il dominio citoplasmatico, che diventa interiorizzato durante endocitosi. Questi anticorpi possono essere che sia pre-coniugato con fluorofori o immunostained con anticorpi secondari4,5,6,7. L'intensità di fluorescenza del immunosignal risultante è proporzionale alla quantità di riciclaggio SV. Questo approccio può essere utilizzato per determinare sia costitutiva e indotto da depolarizzazione SV riciclaggio6,8.

Saggi di Syt1 l'assorbimento possono essere eseguite dopo virus-mediata del gene transfer a virtualmente tutte le cellule nel piatto o dopo trasfezione sparse di un piccolo numero di cellule. Il nostro metodo combina il dosaggio con doppia sparsa transfezione dei neuroni hippocampal primari con fosfato di calcio9. Usiamo una proteina ricombinante marcatore conosciuta ad accumularsi in presynapses, lo Synaptophysin fluorescente contrassegnato, per individuare i terminali presinaptici e overexpress nostra proteina d'interesse, Rogdi. Questo ci permette di testare o meno Rogdi obiettivi funzionali sinapsi e colpisce SV riciclaggio. Il gene che codifica per Rogdi originalmente è stato identificato in una schermata per mutanti Drosophila caratterizzate da indebolimento della memoria10. Nell'uomo, le mutazioni nel gene Rogdi provocare una rara e devastante malattia chiamata sindrome di Kohlschütter-Tönz. I pazienti soffrono di malformazioni dello smalto dentale, Sturm epilessia e ritardo psicomotorio; Tuttavia, la localizzazione subcellulare del prodotto del gene è rimasto inafferrabile11. Così, l'analisi di assorbimento Syt1 fornito la prova chiave per la localizzazione di GFP-etichettato Rogdi alle sinapsi funzionali9.

Questa tecnica di assorbimento ha diversi vantaggi. In primo luogo, SV riciclaggio possa essere osservato sia in tempo reale eseguendo dal vivo imaging7,12e dopo fissazione6,9 misurando l'intensità della fluorescenza dell'etichetta Syt1 fluorescenza. Inoltre, sono state sviluppate diverse varianti di anticorpo Syt1. Esistono varianti senza tag che possono essere etichettati con un anticorpo secondario seguendo un protocollo standard immunostaining dopo la fissazione e varianti pre-coniugati con un'etichetta di fluorescenza già fissata. Infine, anticorpo-basato fluorescenza è vantaggioso dovuto la vasta selezione di coloranti secondari o coniugati commercialmente disponibile che può essere utilizzato.

Quando fissaggio e immunostaining i neuroni, è anche possibile macchiare per altre proteine ed eseguire analisi di colocalizzazione. Questo può aiutare a determinare dove si trovano in relazione riciclaggio SVs. L'intensità dell'etichetta fluorescenza è la misura diretta della quantità di SV riciclaggio. Inoltre, gli anticorpi etichetta selettivamente strutture contenenti Syt1, con conseguente elevata specificità e piccolo sfondo fluorescenza4. Protocolli di stimolazione differenti possono essere utilizzati, ad esempio buffer di depolarizzazione o stimolazione elettrica protocolli9,12,13,14. Tuttavia, riciclaggio di SV basale può essere misurata senza stimolare le colture neuronali15.

Il nostro metodo affronta specificamente l'assorbimento dell'anticorpo Syt1 nei neuroni double-trasfettate con anticorpo secondario immunolabeling dopo la fissazione. Tuttavia, ci riferiamo a tutte le varianti ordinariamente usate del dosaggio nella nostra discussione di dare agli spettatori l'opportunità di adattare il protocollo alle esigenze specifiche.

Protocollo

Non con gli animali vivi sono stati condotti studi. Gli esperimenti che coinvolgono animali eutanasizzati per ottenere cell culture sono state approvate dalle autorità locali di protezione animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sotto l'approvazione numero T10/30. Gli esperimenti sono stati condotti con i protocolli approvati.

1. primario delle cellule ippocampali cultura

  1. Preparare la coltura delle cellule dissociate di ippocampo del ratto del giorno embrionale 1916,17. Le cellule sulle lamelle di 12 mm rivestite con polyethyleneimine (PEI) a 24 pozzetti piatti ad una densità di 50.000-60.000 cellule/pozzetto della piastra. Controllare la densità utilizzando una cella ottica di contrasto di fase e camera di conteggio.
  2. I neuroni della coltura per 3 giorni (giorno in vitro (DIV) 3) in una piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
  3. Valutare i coprioggetti per indicatori di salute delle cellule usando la microscopia chiara trasmessa (ad es., fase ottica contrasto ad un ingrandimento di 10-20 X). Verifica per i seguenti indicatori di buona salute: un alone di contrasto di fase chiara, neurites senza strutture in rilievo e nessun soma clustering o neurite impacchettato.

2. transfezione

Nota: Il seguente protocollo si riferisce a una doppio di transfezione per 3 pozzi. Tuttavia, il protocollo funziona meglio quando gli importi sufficienti per 4 pozzetti sono preparati.

  1. Preparare 500 mL di buffer di transfezione (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, glucosio di 15 mM, 42 mM HEPES) in un matraccio di Erlenmeyer.
    1. Sciogliere 8,0 g di NaCl, 0,37 g di KCl, 0,095 g di Na2HPO4, 1,35 g di glucosio e 5,0 g di HEPES in 400 mL di acqua distillata in un matraccio di Erlenmeyer.
    2. Regolare il pH a 6,95 con 1 M NaOH utilizzando un pH-metro.
    3. Regolare il volume con acqua distillata a 500 mL e controllare il pH utilizzando un pH-metro.
    4. Rendere le aliquote di 20-30 mL di buffer di transfezione con i seguenti valori di pH di pipettaggio 1 M NaOH al buffer di transfezione: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7.00, 7.01, 7.02, 7,03, 7.04, 7.05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7.11.
      Nota: Il pH del tampone transfezione è cruciale per l'efficacia di transfezione.
    5. Per verificare che conduce di buffer di transfezione per il maggior numero di cellule trasfettate, test ogni valore pH da 6,96 a 7.11. Utilizzare il metodo di transfezione descritto in 2.2-2.11 e un plasmide convalidato che esprimono GFP. Determinare il numero di cellule trasfettate per vetrino coprioggetto per ogni valore di pH del tampone di transfezione valutare quali buffer funziona meglio.
    6. Aliquotare il buffer con la massima efficienza di trasfezione in provette microcentrifuga 2 mL congelare e conservare i capillari a-20 ° C.
  2. Pre-riscaldare il siero ridotto medie, mezzo di coltura cellulare e acqua distillata a 37 ° C nel bagno d'acqua.
  3. Preparare la miscela di transfezione in una microcentrifuga da 1,5 mL. Lavorare sotto la cappa a flusso laminare per garantire condizioni di lavoro sterile.
    1. Mix 7,5 µ l di cloruro di calcio di 2 M con 4 µ g di ogni DNA privo di endotossina (Synaptophysin-mOrange ed EGFP/GFP-Rogdi). Aggiungere acqua per raggiungere un volume totale di 60 mL in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Aggiungere 60 mL di buffer di transfezione al mix. Per ottenere i migliori risultati, aggiungere goccia a goccia il buffer di transfezione agitando delicatamente il DNA-mix il vortice.
    3. Incubare a temperatura ambiente (TA) per 20 minuti. Evitare di scuotere il tubo di incubazione durante il periodo di incubazione di posizionamento del tubo a fianco della cappa a flusso laminare.
  4. Sotto la cappa a flusso laminare, rimuovere il terreno di coltura cellulare ("medium condizionato") dai pozzi usando una pipetta da 1000 mL e conservarla in un contenitore separato nell'incubatrice.
  5. Aggiungere 500 mL di mezzo di riduttore del siero in ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO2 fino a quando il periodo di incubazione di 20 minuti (punto 2.3.3).
  6. Aggiungere 30 mL di miscela di transfezione in ciascun pozzetto pipettando alcune gocce. Scartare il residuo nella parte inferiore del tubo.
  7. Dopo tutti i pozzi sono stati forniti con mix di transfezione, agitare delicatamente la piastra a 24 pozzetti per assicurare la distribuzione della miscela transfezione in mezzo.
  8. Incubare per 60 minuti a 37 ° C e 5% CO2.
  9. Rimuovere e scartare il mix di transfezione e lavare tre volte con mezzo di coltura cellulare. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura cellulare in ciascun pozzetto e li Incubare per 30 secondi alla RT. rimuovere 750 mL di terreno e aggiungere la stessa quantità di terreno fresco. Ripetere l'operazione tre volte.
    Nota: La fase di lavaggio è critica. Tenere il tempo che ciascun pozzetto non ha nessun mezzo minimo (cioè., rimuovere e sostituire ben-di-bene) e aggiungere il supporto di lavare delicatamente.
  10. Rimuovere e scartare il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 450 mL della condizionata media ben-di-bene.
  11. Lasciate che i neuroni maturi nell'incubatore a 37 ° C e 5% di CO2 -10 DIV.

3. la stimolazione e l'assorbimento di Syt1

Nota: Il seguente protocollo riguarda l'assorbimento 3 pozzi. Per depolarizzazione di qualsiasi altro numero di pozzi, regolare di conseguenza gli importi.

  1. Preparare 50 mL di tampone di depolarizzazione 10 x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10mm MgCl2, 20mm CaCl2, glucosio di 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7.4) in un matraccio di Erlenmeyer.
    Nota: Buffer di depolarizzazione può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. Se una soluzione non depolarizzante è utilizzata anche, preparare un 10 soluzione di x Tyrode composta da 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10mm MgCl2, 20mm CaCl2, 300 mM glucosio, pH di 200 mM HEPES 7.4 al fine di confrontare la stimolazione indotta da riciclo con spontanea riciclaggio. Dopo la diluizione a 1 x, aggiungere 1 µM di tetrodotossina prima dell'uso per bloccare la generazione di potenziali d'azione.
    1. Sciogliere 1,87 g di NaCl, 2,61 g di KCl, 0,1 g di MgCl2-6 H20, 0,15 g di CaCl2-2 H2O e 3,0 g di glucosio-1 H2O e 2,38 g di HEPES in 50 mL di acqua distillata in un matraccio di Erlenmeyer. Regolare il pH con NaOH e filtro sterile la soluzione. Diluire il tampone 01:10 in acqua distillata per ottenere una concentrazione di 1 x.
  2. Preparare 4% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS (pH 7.4) per la fissazione dopo stimolazione.
    1. Per 500 mL di 4% PFA in PBS 1X, sciogliere 20 g di paraformaldeide in 450 mL di acqua distillata H2O.
      Nota: La soluzione di riscaldamento può accelerare la dissoluzione, ma non riscaldare la soluzione oltre i 70 ° C, come il PFA può disintegrarsi.
      Attenzione: PFA è tossico, potenzialmente cancerogene e teratogene. Indossare guanti quando si lavora con PFA, lavorare sotto la cappa ed evitare l'ingestione.
    2. Lasciare raffreddare la soluzione a RT e aggiungere 50 mL della soluzione madre PBS di 10 x. Aggiustare il pH a 7.4 con NaOH/HCl utilizzando un pH-metro.
  3. Pre-riscaldare 600 mL di tampone di depolarizzazione 1x e 10 mL di terreno di coltura cellulare a 37 ° C nel bagno d'acqua.
  4. Aggiungere 1 mL di anticorpo di topo anti-Syt1 (clone 604.2) a 1x buffer di depolarizzazione e vortex per 10 secondi.
  5. Rimuovere e gettare il mezzo di coltura cellulare dalle cellule. Aggiungere 200 mL di miscela depolarizzazione-anticorpo di ogni bene e incubare per 5 minuti a 37 ° C e 5% di CO2 nell'incubatrice.
  6. Rimuovere e scartare il mix di depolarizzazione-anticorpo e lavare tre volte con mezzo di coltura cellulare. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura cellulare ad ogni pozzetto e incubare per 30 secondi alla RT. rimuovere 750 mL di terreno e aggiungere la stessa quantità di terreno fresco. Ripetere tre volte.
  7. Rimuovere e scartare il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 300 mL di 4% PFA in PBS 1X. Incubare per 20 minuti a 4 ° C.
  8. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con PBS 1X.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. immunocitochimica

  1. Preparare 50 mL di tampone bloccante.
    Nota: Blocco buffer può essere mantenuto a-20 ° C per diversi mesi.
    1. Sciogliere 2,5 g di saccarosio e 1 g di albumina di siero bovino (BSA) in 5 mL di soluzione di riserva di PBS x 10. Aggiungere 1,5 mL di soluzione detergente 10%. Mescolare la soluzione fino a quando tutti i componenti siano correttamente sciolti e aggiungere acqua distillata H2O fino a raggiungere un volume finale di 50 mL. Aliquota della soluzione e congelare le aliquote per l'archiviazione.
  2. Diluire l'anticorpo secondario, accoppiati a fluorophore (diretto contro le specie di Syt1-anticorpo primarie) in 200 mL di tampone bloccante in ciascun pozzetto ad una diluizione di 1: 1000.
  3. Rimuovere e gettare il PBS 1x da ogni bene contenente un vetrino coprioggetti.
  4. Aggiungere 200 mL di blocco buffer-anticorpo mix ad ogni pozzetto e incubare per 60 minuti a TA.
    Attenzione: Poiché gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce, tutti i passi avanti in movimento devono essere eseguiti nel buio.
  5. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte per 5 minuti con 1 mL di PBS 1X.
  6. Incorporare i coprioggetti su vetrini da microscopio con il mezzo di inclusione.
    1. Aggiungere una goccia di 7 mL di mezzo il vetrino del microscopio di inclusione. Rimuovere il vetrino coprioggetto dalla piastra a 24 pozzetti sollevandolo con una siringa e afferra con una pinza.
      Attenzione: Le cellule sulla superficie del coprivetrino sono facilmente danneggiate, pinze devono essere maneggiate con cura.
    2. Immergere il vetrino coprioggetto in acqua distillata per rimuovere il PBS ed asciugarla accuratamente toccando un bordo ad un tessuto morbido.
    3. Capovolgere il coprioggetto sull'incorporamento gocciolina medio, in modo che affronta la superficie portando le cellule al microscopio, quindi incorporare le cellule nel mezzo di incorporamento.
  7. Lasciare le diapositive ad asciugare sotto il cofano per 1-2 h (coprirli per evitare l'esposizione alla luce) e memorizzarli in una casella di scorrimento microscopio a 4 ° C.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

5. analisi microscopica

  1. Dopo asciugare i vetrini coprioggetti, metterli sotto il microscopio con l'obiettivo e la fotocamera.
  2. Regolare il tempo di esposizione per ogni canale in modo che alcuni pixel sono sovraesposte per assicurare la massima distribuzione dei valori di grigio.
    Nota: Mentre il tempo di esposizione può variare tra i canali, dovrebbe essere costante per un unico canale garantire la comparabilità tra i coprioggetti.
  3. Acquisizione di immagini multi-canale per 10 regioni di interesse (ROI) per vetrino coprioggetti. Controllare che il ROI contiene axonal processi da un neurone trasfettato controllando la fluorescenza di GFP, che dovrebbe essere punctate.

6. elaborazione statistica

  1. Esportare le immagini come file. TIF. Caricare le immagini in OpenView18 facendo clic su File | Carica il file immagine.
  2. Scegliere l'immagine di Synaptophysin-mOrange come canale 1, l'immagine di Rogdi-GFP/EGFP come canale 2 e l'immagine di fluorescenza Alexa647 come canale 3.
  3. Soglia la ROIs.
    1. Fare clic su analisi | Zona posto sopra puncta. Scegliere i valori di soglia e Delta intensità in modo che all'ispezione visiva, fluorescenza diffusa è esclusa, lasciando solo punctati segnali nell'immagine del canale 1 (che rappresentano lo Synaptophysin-mOrange fluorescenza). Mantenere la stessa soglia di tutte le immagini.
  4. Facendo clic su Esegui ora, trasferire questi ROIs al corrispondente canale 2 (fluorescenza GFP-Rogdi/EGFP) e 3 (Syt1-fluorescenza) di ciascuna area del vetrino coprioggetti.
    Nota: Il ROIs deve essere considerato solo se la cella è doppio-transfettate. In questo metodo, mOrange - e GFP-fluorescenza dovrebbero essere chiaramente visibile.
  5. Salvare i dati nell'editor del registro di analisi facendo clic su dati di Log.
  6. Aprire l'editor del registro di analisi sotto la scheda di Windows e copiare i valori per ciascun canale. Incollare i valori per i canali separati in un foglio di calcolo.
  7. Determinare l'intensità di fluorescenza media del Syt1-canale presso il ROIs in entrambe le condizioni di transfezione (GFP-Rogdi ed EGFP).
  8. Applicare appropriati test statistici quali di Student t-test per determinare le differenze significative.

Risultati

Un risultato atteso di questo approccio è l'individuazione dei circa 50 neuroni trasfettate con doppio al vetrino coprioggetti ad una densità di 50.000 neuroni per pozzetto. L'assone di ogni neurone dovrebbe mostrare più hotspot di etichetta fluorescente Synaptophysin accumulo, che indica i cluster ofSVs. A siti presinaptici funzionali, il segnale lo Synaptophysin ricombinante colocalizza con punctate Syt1 fluorescenza. Verrà co-espressi con ricombinante Synaptophysin mediante transfe...

Discussione

Ci sono tre saggi abitualmente utilizzati per lo studio delle vescicole sinaptiche (SV) riciclaggio. I primi due includono l'uso di un) styryl fluorescente tinture ad esempio FM1-43 (che incorporano nelle membrane, sono presi in organelli durante endocitosi e vengono rilasciati dopo l'esocitosi); e b) etichetta fluorescente proteine ricombinanti SV (che, al momento sovraespressione, incorporano i macchinari riciclaggio proteinico). Se i fluorophores allegata cambiare loro fluorescenza a seconda del pH, essi utilizzabile ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Irmgard Weiss per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal DFG tramite il Cluster di eccellenza per la microscopia a campo del nanometro e fisiologia molecolare del cervello (CNMPB, B1-7, a T.D.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
B27Gibco17504-044
BSASigmaA7030-50g
CaCl2Sigma-AldrichC3306-100g
CoolSNAP HQ2Photometrics
dH2OInvitrogen15230
DABCOMerck8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647Jackson-Immunoresearch715605151antibody
DMEMInvitrogen41966
DPBSGibco14190
Eppendorf tubesEppendorf30120094
multiwell 24 wellFisher Scientific087721H
tube (50 mL)Greiner Bio-One227261
FBS superiorBiochromAGS0615
GlucoseMerck1,083,421,000
HBSSInvitrogen14170
HEPESSigmaH4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)ThermoElectron Corporation
KCLSigma-AldrichP9541-500g
L-GlutaminGibco25030
MgCl2HoneywellM0250-500g
microscope slidesFisher Scientific10144633CF
Microsoft ExcelMicrosoft
Mowiol4-88Calbiochem475904
NaClBioFroxx1394KG001
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NeurobasalInvitrogen21103049
OpenView Experiment Analysis ApplicationFree software, see commentswritten by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x)Roche11666789001
OptimemInvitrogen31985
PenstrepGibco15140-122
PFASigmaP6148-1kg
safety hoodThermoElectronSerial No. 40649111
SucroseneoFroxx1104kg001
Synaptotagmin1Synaptic Systems105311mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100Merck1,086,031,000
Vortex Genius 3 IKA3340001
Water bathGFL1004
Zeiss Observer. Z1 Zeiss

Riferimenti

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