Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación

Resumen

Aquí, describimos un análisis en situ el hibridación que permite la detección sensible y específica de secuencias tan cortas como 50 nucleótidos con resolución del solo-nucleótido en el nivel unicelular. El ensayo, que se puede realizar manual o automáticamente, puede habilitar la visualización de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en el contexto del tejido.

Resumen

Porque medicina de precisión depende de la precisa detección de biomarcadores, existe una creciente necesidad de tecnologías estandarizadas y robustas que miden RNA biomarcadores en situ en las muestras clínicas. Mientras los ensayos de rutina y atar como RNAseq y RT-PCR cuantitativa permiten mediciones de expresión génica altamente sensibles, también requieren extracción de RNA y así evitar análisis valiosa expresión dentro del contexto morfológico del tejido. El ensayo de hibridación (ISH) en situ descrito aquí puede detectar secuencias de RNA Diana tan cortos como 50 nucleótidos en resolución del solo-nucleótido y en el nivel unicelular. Este ensayo es complementario para el análisis comercial previamente desarrollado y permite la detección sensible y específica en situ de variantes de empalme, metas cortas y mutaciones puntuales dentro del tejido. En este protocolo, las puntas de prueba fueron diseñadas para uniones exón único para dos variantes de empalme clínicamente importantes, EGFRvIII y METΔ14 de destino. La detección de secuencias diana pocos fue demostrada por la detección específica de secuencias CDR3 del T-cell los receptores α y β en la línea de células Jurkat T. También se muestra es la utilidad de este análisis de la ISH para la distinción de secuencias de ARN Diana en la resolución del solo-nucleótido (mutaciones puntuales) a través de la visualización de L858R de EGFR y KRAS G12A variaciones del solo-nucleótido en líneas celulares usando tinción automatizada plataformas. En Resumen, el protocolo muestra un ensayo de ARN ISH especializado que permite la detección de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en situ para funcionamiento manual y en teñidores automáticos.

Introducción

Tecnologías de alto rendimiento transcriptómicos como microarrays y la secuenciación de próxima generación RNA (RNAseq) han mejorado exponencialmente el descubrimiento de biomarcadores de RNA con valor clínico diagnóstico, pronóstico y predictivo de varias enfermedades incluyendo cáncer^1,2. Para avanzar en el uso de estos biomarcadores en la medicina de precisión, hay una alta necesidad de tecnologías estandarizadas y robustas que puede medir biomarcadores de RNA en el contexto del tejido de las muestras clínicas. Mientras que ampliamente establecido ensayos de rutina y atar como RNAseq y RT-PCR cuantitativa permiten mediciones de expresión génica altamente sensible, la homogeneización del tejido requerido y el aislamiento de RNA implican la pérdida de en vivo especificidad de tipo celular y información morfológica³. Metodologías de detección convencional en situ RNA carecen de la sensibilidad y especificidad necesaria para medir fiablemente biomarcadores RNA raras o baja expresión dentro del contexto de tejido⁴.

Un ensayo comercial en situ hibridación (ISH) (e.g., el ensayo de RNAscope) es una tecnología que ha abordado estos retos y también permite la visualización altamente sensible y específica de solo moléculas de ARN superiores a 300 nucleótidos en el contexto morfológico del tejido. Este tipo de análisis utiliza un diseño de la sonda de oligonucleótidos única de aproximadamente 6 – 20 pares de doble Z sonda combinada con una amplificación de señal avanzada basada en hibridación⁵.

Este estudio describe un análisis especializado de ARN ISH, BaseScope, complementaria a la tecnología comercial previamente diseñada que permite detectar secuencias de RNA Diana tan cortos como 50 nucleótidos en la resolución de un solo nucleótido. Este ensayo aborda las intrincadas complejidades del transcriptoma y es aplicable para la detección exacta de uniones exón, secuencias diana corta y mutaciones puntuales en el contexto del tejido (tabla 1) utilizando una sonda doble Z. Este informe demuestra el protocolo completo y su uso en la detección de variantes de empalme, secuencias CDR3 de clones de células T del receptor, y mutaciones del solo-nucleótido en FFPE líneas y tejidos de tumor de la célula.

Protocolo

Las muestras de tumores humanos utilizadas en este estudio fueron deidentified y adquiridas de fuentes comerciales con arreglo a las normas éticas locales para la investigación en humanos.

1. muestra, equipo y preparación de los reactivos

1. Preparación de la muestra FFPE
   1. Tejidos
      1. Inmediatamente después de la disección, fijar el tejido (cortado en bloques de 3 – 4 mm de espesor) en tampón neutro formalina al 10% (NBF) de 16-32 h a temperatura ambiente (RT).
         Nota: Tiempo de fijación varía dependiendo del tamaño y tipo de tejido.
      2. Lavar la muestra con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y deshidratar mediante una serie estándar de etanol (EtOH) (70% EtOH durante 30 – 60 min, 80% EtOH durante 30-60 min., 90% EtOH durante 30 – 60 min, 95% EtOH durante 30 – 60 min, 3 x 100% de EtOH 30-60 min) seguido de xileno.
      3. Embeber la muestra en parafina utilizando procedimientos estándar⁶ y cortar los bloques de parafina según sea necesario para eliminar la parafina sobrante.
         Nota: Tamaño de bloque variará dependiendo del tamaño de la muestra de tejido, pero un tamaño típico es de 0.75 x 0.75 pulgadas² o más pequeño.
   2. Líneas celulares
      1. Recoger y pelotilla células según los métodos recomendados para la línea celular específica.
      2. Fijar las células en formol 10% a temperatura ambiente por 24 h en un rotador.
      3. Preparar las células como una pelotilla en gel procesamiento de precalentado (por ej., Histogel). Permite la pelotilla a solidificar colocando el precipitado de células de gel en un trozo de parafilm en hielo y dejar reposar 2-3 min sumerja el precipitado de células de gel en PBS 1 x.
      4. Deshidratar e incrustar los pellets de células como se describe en el paso 1.1.1.
   3. Sección Preparación
      1. Cortar las células del tejido/incrustadas en 5 secciones de 1 μm ± usando un micrótomo, Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio adhesivo electrostático y les deje secar al aire durante la noche a TA.
         Nota: Las diapositivas pueden almacenarse a temperatura ambiente bajo desecación hasta 3 meses.
      2. Colocar los portaobjetos en una parrilla y hornee los portaobjetos de tejido montado en un horno de aire circulante a 60 ° C por 1 h antes de realizar el ensayo.
         Nota: Utilice las diapositivas inmediatamente o almacenar a temperatura ambiente con desecantes hasta 1 semana. Un almacenamiento prolongado puede resultar en la degradación del RNA.
2. Preparación de equipo
   1. Programar el horno de hibridación a 40 ° C. Completamente moje el papel humidificación quitar cualquier residual de dH₂O. Inserte el papel en la bandeja de control de humedad e Introduzca la bandeja en el horno de hibridación se precaliente durante al menos 30 minutos antes de su uso.
3. Preparación del reactivo
   1. Llenar dos claro platos agente con 200 mL de xileno y llenar dos platos tinción con 200 mL de 100% EtOH, que se utilizará para parafina secciones.
   2. Preparar 200 mL de reactivo de recuperación 1 x disponible en el mercado objetivo mediante la adición de 180 mL de dH₂O 20 ml de reactivo de recuperación de destino de x 10. Colocar dos soportes de diapositivas en un vapor. Llenar un sostenedor de la diapositiva con 200 mL de 1 x reactivo de recuperación de destino y llenar el otro soporte de diapositiva con 200 mL de dH₂calor o ambas soluciones a hervir con el vapor.
   3. Precalentado de tampón de lavado x 50 caliente a 40 ° C durante 10-20 minutos preparar 3 L 1 x de tampón de lavado diluyendo 60 mL de tampón de lavado x 50 con 2,94 L de dH₂O.
   4. En una campana de humos, preparar hematoxilina de Gill 50% solución de contratinción añadiendo 100 mL de hematoxilina de Gill y 100 mL de dH₂O. En la capilla del humo, preparar el reactivo de azulado (agua de amoníaco 0,02% (p/v)) agregando 1,43 mL de hidróxido de amonio 28-30% a 250 mL de dH₂O.
   5. Precaliente sondas blanco a 40 ° C durante 10 minutos antes de la hibridación de la sonda y traer los reactivos de amplificación (AMP 0-6) a RT.

2. ARN In Situ ensayo de hibridación

1. Parafina y deshidratación
   1. Después de la cocción tal como se describe en el paso 1.1.3.2 (opcional punto 1), Desparafinizar las secciones en xileno durante 5 minutos con agitación. Desparafinizar otra vez en xileno fresco por 5 min deshidratar en 100% EtOH por 2 min con agitación y repita otra vez en fresco 100% EtOH por 2 min.
   2. Aire seco el portaobjetos durante 5 minutos a 60 ° C en un horno de aire circulante o a temperatura ambiente hasta que estén completamente secos (parada opcional punto 2).
2. Pretratamientos de la muestra
   1. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de peróxido de hidrógeno listo para su uso por 10 min a temperatura ambiente para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Decantar la solución de las correderas y enjuague dos veces con dH₂O.
   2. Incubar las secciones con 200 mL del reactivo de recuperación objetivo para 15-30 min a 100 ° C en un vapor.
      Nota: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de tejido. En este protocolo, recuperación del destino se realizó durante 15 min para muestras tumorales y gránulos de la célula.
   3. Decantar la solución de las diapositivas, enjuagar dos veces con dH₂O, la inmersión en un 100% EtOH por 3 minutos y seca las diapositivas a 60 ° C en un horno de aire circulante o a temperatura ambiente hasta totalmente seco.
   4. Dibujar una barrera hidrofóbica alrededor de la sección utilizando un lápiz hidrofóbico, aproximadamente 0.75 x 0.75 pulgadas².
      Nota: No se recomienda establecer una barrera más pequeña. Para secciones más grandes, una barrera más grande tendrá que ser dibujado.
   5. Deje que la barrera secar completamente durante 1 min, o dejar toda la noche a temperatura ambiente (punto opcional 3).
   6. Coloque los portaobjetos en un porta diapositivas y coloque el soporte de la diapositiva en la bandeja de control de humedad. Añadir ~ 4 gotas de proteasa III a cada diapositiva e Incube por 15-30 min a 40 ° C en el horno de hibridación para la digestión de proteínas.
      Nota: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de tejido. En este protocolo, digestión de proteasa fue realizada por 30 minutos para las muestras del tumor y 15 min para las pelotillas de la célula.
   7. Decantar la solución de las correderas y enjuague dos veces con dH₂O.
3. Sonda de hibridación
   1. Añadir ~ 4 gotas de la solución de sonda listo para su uso adecuado para cubrir toda la sección. Si usando secciones más grandes, añadir ~ 5-6 gotas.
   2. Hibridar las sondas por 2 h a 40 ° C en el horno de hibridación. Decantar la solución de las correderas y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado en este paso.
4. Amplificación de la señal
   1. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de AMP 0 por diapositiva a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado en este paso.
   2. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 1 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.
   3. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 2 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.
   4. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 3 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.
   5. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 4 amperios por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.
   6. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 5 AMP por porta a temperatura ambiente durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.
   7. Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 6 AMP por porta a temperatura ambiente por 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.
5. Detección de señal
   1. Preparar el tinte rojo rápido de la solución. Para una diapositiva con una barrera de² de 0.75 x 0.75 pulgadas, añadir 2 μL de colorante rápido rojo B a 120 μL de rápido rojo-A en un tubo y mezcle bien.
      Nota: Dependiendo del tamaño de la barrera hidrofóbica y el número de diapositivas, volúmenes de la solución de trabajo Fast Red variará.
   2. Decantar el exceso de líquido de las diapositivas y añadir el colorante Fast Red solución a las diapositivas. Incube los portaobjetos durante 10 min a temperatura ambiente en la bandeja con una cubierta para evitar la exposición a la luz.
      Nota: Use el Fast Red solución dentro de 5 minutos de preparación y no lo exponga a luz solar directa o luz ultravioleta.
   3. Decantar la solución Fast Red y enjuague los portaobjetos dos veces con agua del grifo. Vuelva a colocar los portaobjetos en una parrilla.
6. Contratinción
   1. Contratinción las secciones de tejido con solución de hematoxilina de Gill 50% por 2 min en RT. Wash los portaobjetos con agua y repetir este proceso varias veces hasta que las diapositivas son claras, mientras que las secciones permanecen púrpura. Sumerja los portaobjetos en agua de amoníaco 0,02% para azulado (dip 2 a 3 veces). Reemplace el agua de amoníaco con agua del grifo y lavar las diapositivas 3 a 5 veces.
7. Deslice el montaje
   1. Seco el portaobjetos en un horno de aire circulante a 60 ° C durante 15 minutos o a temperatura ambiente hasta totalmente seco. Coloque 1-2 gotas de reactivo de montaje en cada cubreobjetos portaobjetos y coloque sobre cada sección. Evitar cualquier captura de burbujas de aire. Secar los portaobjetos durante al menos 5 minutos.
      Nota: El substrato de Fast Red es sensible al alcohol. Deshidratar el portaobjetos en el alcohol.
8. Visualización
   1. Observe los portaobjetos en un microscopio de campo luminoso estándar.

Resultados

En situ hibridación análisis flujo de trabajo:
El flujo de trabajo se representa en la figura 1 y consiste en cuatro partes: permeabilización de células o tejidos con destino recuperación y soluciones de la proteasa, hibridación de las sondas en el destino del RNA, señal de amplificación y la visualización de la señal. La señal también puede ser cuantificada usando sistemas de software de imagen digital o de manera semicuantitativa basado en el número de puntos por la célula. El procedimiento manual que se describe en la figura 2 también ha sido totalmente automática en sistemas comerciales de tinción automática.

Representante de tinción para la detección de empalme del exón (EGFRvIII empalme variante): EGFRvIII es una variante del receptor del factor de crecimiento epidérmico que surge de una canceladura genomic en el marco de los exones 2 a 7, constitutivamente activa señalización oncogénica⁷ . El análisis fue utilizado para identificar estado de EGFRvIII en muestras tumorales FFPE glioblastoma (GBM). Sondas de doble Z solo fueron diseñadas para abarcar las uniones exón con el fin de detectar cualquier peso, mutante, o ambas transcripciones (Figura 3A). Las sondas de EGFR WT abarcan a las uniones de exones 1 y 2 (E1/E2) o de los exones 7 y 8 (E7/E8), mientras que las sondas específicas de la EGFRvIII abarcan al empalme de los exones 1 y 8 (E1/E8). Una punta de prueba común que se extiende por la Unión de los exones 8 y 9 (E8/E9) también fue utilizado para detectar EGFR total (WT y EGFRvIII transcripciones). Todas las sondas entonces fueron utilizadas para determinar el estado EGFR en muestras de FFPE GBM. Los dos ejemplos representativos que se muestra en la figura 3B se tomaron de un estudio más amplio. Estado EGFR fue confirmada por un método independiente, RT-PCR. Ambas sondas WT detectan señal en ambas muestras, lo que indica que las dos muestras expresan EGFR WT (figura 3B). Sin embargo, la sonda mutante mostró sólo detección de señal en la EGFRvIII + muestra, confirmando que esta muestra es de hecho positiva para la variante de EGFRvIII (figura 3B, paneles de la izquierda). Por el contrario, la sonda mutante no detecta señal de la EGFRvIII-muestra (figura 3B, paneles de la derecha). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el análisis de empalme del exón puede identificar EGFRvIII estado en muestras tumorales de GBM FFPE.

Representante de coloración para metas corto:
Los CDR3, o región determinante complementario 3, es un dominio altamente variable en receptores de célula T. Por lo general, la secuencia de CDR3 son bastante corto; por ejemplo, las secuencias CDR3 α y β de la línea de células Jurkat T son 51 y 48 nucleótidos de longitud, respectivamente (Figura 4A). Para identificar las secuencias específicas de CDR expresadas en células Jurkat, sondas antisentidas para CDR3 se generaron α y β que se expresan en la línea de células Jurkat T, además de sentido sondas para CDR3 α y β para servir como control negativo sondas. Todas las sondas entonces fueron probadas en células Jurkat FFPE-preparado con el ensayo. Se observó coloración robusta con sondas anti-sentido para ambos CDR3 α y β en las células de Jurkat, mientras que las sondas sentido no detecta poca a ninguna señal (Figura 4B). Estos resultados demuestran la capacidad de discernir entre secuencias de CDR altamente variable, pero corto para los clones de células T del receptor del ensayo corto blanco.

Representante para punto de mutación L858R de EGFR:
Puntas de prueba de mutación de punto fueron desarrollados para detectar variaciones de un solo nucleótido y pequeñas inserciones o deleciones (INDELs) dentro del tumor. Figura 5A se muestra la capacidad para en situ detección de la mutación de punto L858R de EGFR (2573T > G). Dos puntas de prueba fueron diseñados: uno para detectar la L858R transformado secuencia EGFR y otro para detectar la secuencia de EGFR L858 WT. Ambas sondas fueron probados en dos líneas celulares FFPE-preparado: H2229, que sólo expresa EGFR L858 WT; y H1975, que es heterozigótico para la mutación L858R de EGFR. La sonda mutante L858R detectado señal sólo en la línea celular de H1975 pero no en la línea celular de H2229. Sin embargo, la sonda WT había detectado señal en ambas líneas celulares. Asimismo, figura 5B visualiza en situ detección de la mutación de punto G12A KRAS (35 G > C). Dos puntas de prueba fueron diseñados para detectar las secuencias KRAS G12A MT y KRAS WT de G12 y entonces probados en la línea celular de HuT78 (que sólo expresa KRAS WT de G12) y la línea de celular SW116 (que es heterozigótica para la mutación KRAS G12A). Mientras que la punta de prueba de KRAS WT de G12 detecta señal en ambas líneas celulares, la punta de prueba de KRAS G12A solo detectó señal en la línea de celular SW116. Tomados en conjunto, estos datos demuestran la capacidad técnica de la prueba de mutación de punto en la detección de polimorfismos de nucleótido único en el contexto de la célula y tejido.

Representante para el análisis automatizado en situ :
Ensayos automatizados permiten un mayor número de muestras a ejecutar más confiablemente, minimizando la variabilidad inter-usuario y tiempo de práctica y generar resultados consistentemente reproducibles. Por lo tanto, se desarrolló una versión automatizada de la prueba. Para demostrar de tinción automatizado con este análisis, la detección de la variante de empalme METΔ14 fue examinada. Esta variante es el resultado del exón 14 en el gen MET ser omitido durante el pre-ARNm splicing, que conduce a la activación constitutiva y transformación oncogénica de la MET del receptor^8,9. Para detectar específicamente la variante de METΔ14, se diseñaron dos sondas de empalme del exón: uno que abarca la Unión de los exones 13 y 15 (E13/E15) para detectar la transcripción de la variante de METΔ14 y otro que abarca la Unión de los exones 14 y 15 (E14/E15) para detectar la WT se reunió transcripción (figura 6A). Ambas sondas fueron probados entonces en 2 líneas celulares FFPE-preparado: H596, que expresa la variante METΔ14, y A549, que expresa el gen WT se reunió. Ambas sondas mostraron patrones de expresión mutuamente exclusiva, con la sonda E13/E15 sólo detección de señal en las células H596 y la sonda de E14/E15 sólo detección de señal en las células A549 (figuras 6B y 6C). Por último, la sonda para dapB no demostró ninguna señal, ninguna señal de fondo (figuras 6B y 6C). En general, estos datos muestra la detección específica de la MET variante METΔ14 en situ utilizando el ensayo automatizado de BaseScope.

Figura 1 : El flujo de trabajo de análisis. El flujo de trabajo consta de 4 pasos principales: pretratamiento para permeabilizar las células o tejido, hibridación de la sonda a destino RNA, la amplificación de la señal y detección de la señal de visualización bajo el microscopio de campo luminoso o fluorescentes. Puntos que se pueden cuantificar utilizando una plataforma de análisis de imagen digital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Ilustración del Protocolo de ensayo manual. El ensayo completo puede completarse en 9 h. pretratamiento los tiempos pueden variar dependiendo del tipo de tejido, por lo que se recomienda consultar el Apéndice A del manual de usuario para recomendaciones de tratamiento previo del tejido en cuanto a tiempo de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Imágenes representativas de la detección de empalme exón. (A) se muestra aquí son la organización de exón para EGFR WT y EGFRvIII transcripciones y un esquema con doble Z exón cruce las puntas de prueba que unen el cruce para detectar el peso de EGFR o EGFRvIII. (B) el exón cruce análisis fue realizado en dos muestras de glioblastoma FFPE usando las puntas de prueba listados en (A), así como un dapB sonda control POLR2A y sonda de control negativo, positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Detección de la secuencia de imágenes representativas del objetivo corto. (A) se muestra aquí son secuencias CDR3 en células Jurkat. La secuencia de negro es una secuencia común de flanquea y la secuencia en rojo es única a CDR3α o a CDR3β. Sondas de secuencia de doble Z corto destino fueron diseñadas contra estas secuencias. (B) el ensayo corto blanco fue realizado en células Jurkat preparadas como un precipitado de células FFPE usando sondas anti-sentido o sentido a las secuencias de (A), y dapB fue utilizado como control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Imágenes representativas de la detección de la mutación de punto de. (A) el ensayo fue realizado en H2229 células (homocigóticas para EGFR L858) y H1975 (heterocigotos para la mutación L858R de EGFR) preparado como un precipitado de células FFPE usando puntas de prueba de una mutación de punto doble-Z a la secuencia de EGFR L858 WT o L858R de EGFR secuencia mutada. (B) el ensayo de mutación de punto fue realizada en HuT78 células (homocigóticas para G12A KRAS) y SW116 (heterozigótico para la mutación KRAS G12A) preparado como un precipitado de células FFPE usando puntas de prueba de una mutación de punto doble-Z a la secuencia de KRAS WT de G12 o Secuencia de G12A KRAS mutado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Imágenes representativas de tinción automatizado con el ensayo de empalme exón. (A) se muestra aquí es la organización de exón para transcripciones de WT se reunieron y METΔ14 y un esquema que representa el único exón Z doble cruce las puntas de prueba que unen la ensambladura para la detección de peso conocido o METΔ14. (B) y (C) el análisis de empalme del exón automatizado fue realizado en células A549 (expresando el peso conocido) preparadas como un precipitado de células FFPE usando las puntas de prueba listados en (A) y H596 las células (METΔ14) así como control negativo sonda dapB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Empalme del exón	Secuencia corta	Mutación de punto
Empalme variante/isoforma	Secuencias de entre 50 y 300 nt	Mutación de punto
RNA circular (circRNA)	Secuencias altamente homólogas	Indel corto
Fusión génica	Secuencia de CDR3 para clones TCR	Gen de edición
Nocaut (KO) en el gen	Pre-miRNA
	ARN nucleolar pequeño (snoRNA)
	Gen de edición

Tabla 1: aplicaciones de la en situ análisis. Existen 3 categorías principales para las aplicaciones de este ensayo: ensambladura de exón, secuencia de destino corto y mutación de punto. En cada columna son algunos ejemplos de aplicación específica para cada categoría.

Discusión

En este informe, el protocolo de ensayo novela de ISH y sus aplicaciones fueron discutidos en detalle. El ensayo permite la visualización directa de uniones exón, short blanco y altamente homólogas secuencias y mutaciones puntuales en el contexto del tejido. El ensayo se basa en la tecnología de RNAscope⁵ y por lo tanto es capaz de detectar la molécula sola. Sin embargo, debido a un sistema de amplificación avanzados, la señal puede ser detectada con sondas que contienen tan poco como un par de doble-Z o con una longitud de plantilla de destino de sólo 50 nucleótidos. Porque las puntas de prueba pueden ser tan cortos como un único doble-Z de longitud, esto permite la detección de uniones exón, poco objetivo y altamente homólogas secuencias y mutaciones de punto (tabla 1).

Para el desempeño exitoso de la prueba, hay varias recomendaciones técnicas. En primer lugar, se deben fijar los tejidos en fresco 10% formol tamponado neutro (NBF) a temperatura ambiente durante 16 – 32 h¹⁰. Underfixation (< 16 h) o overfixation (> 32 h) afectará el rendimiento de la prueba y puede requerir optimización adicional. En segundo lugar, para asegurar un control óptimo de temperatura y humedad, que son necesarios para la amplificación de hibridación y la señal de sonda robusta, la diapositiva procesamiento horno sistema e hibridación se debe utilizar para pasos de protocolo 2.3 a 5 (proteasa tratamiento previo, punta de prueba hibridación, amplificación de la señal y detección de señales). Búferes residual de tercera, el exceso deben ser decantados correctamente antes de cada paso en el protocolo (pero no tanto para que las secciones de tejido se sequen). Si el portaobjetos se sequen, desarrollará importante señal no específica. En cuarto lugar, dependiendo del tipo de tejido, optimización tratamiento previo puede ser necesario. Usando la proteasa mal o realizar subóptima durante un tiempo puede resultar en bajo - o sobre - digestion y afectará negativamente a la señal. Por último, es importante para que funcione siempre controles positivos y negativos con las puntas de prueba. Sondas de control negativo aseguran de que no hay ninguna señal de fondo, sondas de control positivo garantizar que el ensayo se ha realizado correctamente y que la calidad del RNA de la muestra es óptima para interpretar los resultados de la sonda de prueba. Si no hay señal con la sonda de control positivo, entonces es probable que la calidad del RNA de la muestra subóptima y una señal no puede ser vista con la sonda de prueba.

Además el análisis manual, la capacidad para realizar el ensayo en teñidores automáticos también fue demostrada (figura 6). Este ensayo automatizado de ISH rinde un alto cociente signal-to-noise y es aplicable para las mismas aplicaciones como se muestra en la tabla 1; sin embargo, beneficios de un análisis automatizado incluyen la estandarización de las condiciones analíticas, minimización de la variabilidad inter-usuario y tiempo de práctica y permiso para el cribado de alto rendimiento de las muestras de tejido de forma fiable.

Inmunohistoquímica (IHQ) y qRT-PCR permiten la detección de variantes de empalme (particularmente EGFRvIII), en las muestras clínicas FFPE, estas técnicas pueden carecer de la especificidad necesaria y no ofrece una visión en la resolución espacial del empalme expresión variante, respectivamente^11,12. Una ventaja clave del análisis de este protocolo es su visualización altamente sensible y específico de uniones de empalme preservando el contexto morfológico del tejido. Aquí, capacidad de análisis objetivo precisamente uniones exón único para diversas variantes de empalme, incluyendo EGFRvIII y METΔ14, fue demostrada (figuras 3 y 6). Además, el ensayo se ha demostrado para detectar la variante de empalme AR V7 en el cáncer de próstata, múltiples isoformas de ErbB4 en el cerebro y la confirmación de octavos de final de la circular Cdr1as de ARN en el ratón cerebro^3,13,14.

Detección de secuencia destino corto por este ensayo ISH permite visualización de secuencias de ARN tan cortas como 50 nucleótidos de longitud, según lo demostrado por la detección de secuencias CDR3 derivado de células Jurkat (figura 3). El ensayo también puede detectar secuencias de genes son altamente homólogas a otros miembros de la familia o especie, como se muestra por Revêchon et al., que utiliza el ensayo corto blanco para detectar progerina humana expresada en ratón subcutáneo tejido adiposo blanco¹⁵. Además, ARN nucleolar pequeño (snoRNA) edición de genes mediada por CRISPR y microRNA precursor pueden ser detectado en situ con el ensayo corto destino. Más recientemente, Fu et al. combinado este ensayo ISH con IHC para identificar células precisa en la retina expresando el pre-miRNA mir125b¹⁶.

Mutación de perfiles en los tumores es fundamental para estudiar la progresión de tumores y para el desarrollo de terapias dirigidas. Mientras que la mutación de perfiles pueden lograrse mediante secuenciación de alto rendimiento, esta tecnología no puede enfrentar completamente intratumoral heterogeneidad o enlace de alteraciones genéticas con morfología celular^17,18. La detección de mutaciones puntuales mediante este ensayo ISH permite la distinción de secuencias de RNA Diana con una resolución de la solo-base, como validada por la detección de variaciones de un solo nucleótido L858R de EGFR y KRAS G12A en líneas celulares (figura 5). Por otra parte, Baker et al. usaron el ensayo de mutación de punto a múltiples mutaciones en los oncogenes PIK3CA, BRAF y KRAS en cáncer colorrectal¹⁸. Fueron capaces de identificar y mapa espacial raras subclones mutantes de células del tumor, en última instancia mostrando cómo contribuyen a la heterogeneidad intra-tumor.

En Resumen, se ha desarrollado un ensayo de ARN ISH especializado. Esta metodología permite la detección de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en situ. Es sensible, específico, cuantificable y adaptable desempeño por métodos manuales y en teñidores automáticos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)	ACD	310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid)	ACD	310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017	ACD	310017
HybEZ Humidifying Paper	ACD	310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)	Vector Laboratory	H-4000
SuperFrost Plus Slides (required)	Fisher Scientific	12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF)	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin wax	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microtome	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I	American Master Tech Scientific/MLS	HXGHE1LT	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene	Fisher Scientific/MLS	X3P-1GAL	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack	American Master Tech Scientific/MLS	LWSRA24	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes	American Master Tech Scientific/MLS	LWT4457EA	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant	American Master Tech Scientific/MLS	LWT4456EA	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH)	American Master Tech Scientific/MLS	ALREACS	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required)	Vector Labs	H-5000
Cover Glass, 24 mm x 50 mm	Fisher Scientific/MLS	12-545-F	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30%	Sigma-Aldrich/MLS	320145-500mL	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L)	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer	/	/
Digital thermometer	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1,000 μL	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled water	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes)	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hood	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinder	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Parafilm	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paper	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microcentrifuge	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessories	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Formaldehyde	MLS	/	MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Histogel	Fisher Scientific/MLS	22-110-678
BaseScope Reagent Kit - RED	Advanced Cell Diagnostics	322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2	Advanced Cell Diagnostics	701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8	Advanced Cell Diagnostics	701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8	Advanced Cell Diagnostics	701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9	Advanced Cell Diagnostics	701731
BaseScope Hs-MET-E14E15	Advanced Cell Diagnostics	701811
BaseScope Hs-MET-E13E15	Advanced Cell Diagnostics	701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A	Advanced Cell Diagnostics	705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT	Advanced Cell Diagnostics	705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R	Advanced Cell Diagnostics	705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT	Advanced Cell Diagnostics	705461
BaseScope Control Probe Pack Human	Advanced Cell Diagnostics	322975