JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים בחיי עיר הכלאה assay המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי קצר ככל נוקלאוטידים 50 עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ברמת תא בודד. וזמינותו, אשר יכול להתבצע באופן ידני או אוטומטי, באפשרותך לאפשר ויזואליזציה של גרסאות splice, רצפים קצרים מוטציות בתוך ההקשר רקמות.

Abstract

מכיוון דיוק רפואה תלויה מאוד איתור מדויק של סמנים ביולוגיים, יש צורך להגדיל לטכנולוגיות מתוקננת וחזק המודדים RNA סמנים ביולוגיים בחיי עיר בדגימות קליניות. בעוד לטחון-bind מבחני כמו RNAseq ולאפשר RT-PCR כמותי מדידות ביטוי גנים רגישה מאוד, הם גם דורשים החילוץ-RNA, ובכך למנוע ניתוח ערך הביטוי בתוך ההקשר רקמות מורפולוגי. בחיי עיר הכלאה (איש) וזמינותו המתוארים כאן יכול לזהות רצפים היעד RNA קצר ככל נוקלאוטידים 50 ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד וברמת תא בודד. זה וזמינותו משלים וזמינותו המסחרית שפותחו בעבר ומאפשרת זיהוי רגיש וספציפי בחיי עיר של גרסאות splice, מטרות קצרות מוטציות נקודה בתוך הרקמה. ב פרוטוקול זה, הגששים נועדו למטרה צמתי אקסון ייחודי עבור שתי גרסאות splice חשוב מבחינה רפואית, EGFRvIII ו- METΔ14. זיהוי המטרה קצר רצפים הודגם על ידי זיהוי ספציפי של רצפים CDR3 של T-cell קולטנים α וβ בקו Jurkat T-cell. גם היא. התועלת הזה assay איש על ההבחנה של רצפי RNA היעד ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד (הנקודה מוטציות) באמצעות הפריט החזותי של וריאציות נוקלאוטיד יחיד EGFR L858R G12A קראס בשורות תאים באמצעות צביעת אוטומטיות פלטפורמות. לסיכום, הפרוטוקול מראה assay RNA איש מיוחדים, המאפשרת זיהוי גרסאות splice רצפים קצרים, מוטציות בחיי עיר לביצועים ידנית ו- stainers אוטומטי.

Introduction

תפוקה גבוהה transcriptomic טכנולוגיות כגון מיקרו-מערכים ורצף RNA הדור הבא (RNAseq) השתפרו בצורה אקספוננציאלית הגילוי של סמנים ביולוגיים RNA עם אבחון prognostic, ניבוי ערך קליני למחלות שונות כולל סרטן1,2. כדי לקדם את השימוש אלה סמנים ברפואה דיוק, אין גבוה הצורך טכנולוגיות מתוקננת וחזק שיכול למדוד סמנים ביולוגיים RNA בתוך ההקשר רקמות של דגימות קליניות. בעוד נרחב נוסדה לטחון-bind מבחני כמו RNAseq ו- RT-PCR כמותי לאפשר מדידות ביטוי גנים רגישה מאוד, הרקמה הנדרשת המגון ובידוד RNA לרמוז אובדן היחודיות סוג התא ' ויוו , מידע מורפולוגי3. קונבנציונלי בחיי עיר RNA לזיהוי מתודולוגיות חוסר רגישות וספציפיות נדרש למדוד בצורה אמינה סמנים ביולוגיים RNA נדיר ולהבעת נמוך בתוך ההקשר רקמות4.

וזמינותו הכלאה (איש) מסחרי בחיי עיר (למשל., וזמינותו RNAscope) היא טכנולוגיה אחת יש תיקל אלה אתגרים ומאפשר גם הפריט החזותי מאוד רגיש וספציפי של מולקולות RNA יחיד מ- 300 נוקלאוטידים בתוך ההקשר מורפולוגי רקמות. סוג זה של assay משתמש עיצוב בדיקה oligonucleotide ייחודי של 6 – 20 זוגות בדיקה כפולה-Z כ בשילוב עם הגברה האות מתקדם מבוסס-הכלאה5.

מחקר זה מתאר assay RNA איש מיוחדים, BaseScope, משלימים לטכנולוגיה מסחרי בעבר מעוצב שיכול לזהות רצפים היעד RNA קצר ככל נוקלאוטידים 50 ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד. זה וזמינותו מטפל המורכבות הסבוך של transcriptome, חלה על זיהוי מדויק של צמתי אקסון, יעד קצר רצפים מוטציות נקודה בהקשר רקמות (טבלה 1) באמצעות זוג כפול-Z בדיקה קטנה כמו אחד. דו ח זה מדגים הפרוטוקול המלא assay והשימוש בו הגילוי של גרסאות splice, רצפי CDR3 T-cell קולטן שיבוטים, והתא נוקלאוטיד יחיד מוטציות בגן FFPE קווים ורקמות הגידול.

Protocol

הדגימות גידול אנושי השתמשו במחקר זה היו deidentified, רכשה ממקורות מסחריים בהתאם להנחיות אתית המקומי עבור מחקר אנושי.

1. לדוגמה, ציוד ריאגנט הכנה

  1. הכנת הדוגמא FFPE
    1. רקמות
      1. מיד לאחר ניתוח, לתקן את הרקמות (לחתוך קוביות של 3-4 מ מ עובי) בפורמלין 10% באגירה נייטרלי (NBF) עבור 16 – 32 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
        הערה: קיבוע זמן משתנה בהתאם גודל וסוג הרקמות.
      2. לשטוף את הדגימה עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), מייבשים באמצעות סדרה סטנדרטי אתנול (EtOH) (70% EtOH 30-60 דקות, 80% EtOH למשך 30-60 דקות, 90% EtOH 30-60 דקות, 95% EtOH למשך 30-60 דקות, 3 x 100% EtOH 30-60 דקות) ואחריו קסילן.
      3. להטביע את הדגימה פרפין באמצעות הליכים סטנדרטיים6 ולחיתוך הבלוקים פרפין לפי הצורך כדי להסיר עודפי פרפין.
        הערה: גודל בלוק ישתנה בהתאם לגודל דגימת רקמה, אבל גודל טיפוסי הוא 0.75 x 0.75 ס מ2 או קטנים יותר.
    2. שורות תאים
      1. לאסוף, גלולה תאים לפי השיטות המומלצות עבור שורת תאים מסוים.
      2. לתקן תאים בפורמלין 10% ב- RT במשך 24 שעות ביממה על מסובב.
      3. להכין תאים כמו גלולה ב עיבוד prewarmed ג'ל (למשל., Histogel). לאפשר בגדר לגבש על-ידי הצבת בגדר ג'ל-cell על חתיכת מצלמות-מיקרוסקופים על קרח, ולתת לו לשבת במשך 2-3 דקות Submerge בגדר ג'ל-תא ב- 1 x PBS.
      4. מייבשים, להטביע את כדורי תא כפי שמתואר בשלב 1.1.1.
    3. סעיף הכנה
      1. חתך הרקמה/התאים מוטבע למקטעים 5 ± 1 μm באמצעות מיקרוטום של הר הסעיפים בשקופיות זכוכית דבק electrostatically, מילה נהדרת אותם בן לילה-RT.
        הערה: השקופיות אחסנה-RT לייבוש עד 3 חודשים.
      2. מניחים את השקופיות במעמד שקופית ואופים השקופיות רקמות הנטען בתנור אוויר במחזור ב 60 ° C עבור 1 h לפני ביצוע וזמינותו.
        הערה: השתמש השקופיות באופן מיידי או לאחסן אותם ב RT עם desiccants עד 1 לשבוע. אחסון ממושך עלול לגרום השפלה RNA.
  2. הכנת ציוד
    1. הגדר את התנור הכלאה 40 ° C. ביסודיות הרטיבו את הנייר humidifying להסיר כל שיורית dH2O. הכנס הנייר במגש בקרת לחות ו הכנס את המגש לתנור הכלאה כדי prewarm במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.
  3. ריאגנט הכנה
    1. מילוי 2 ניקוי הסוכן מנות עם 200 מ של קסילן ולמלא שתי מנות מכתימים עם 200 מ של 100% EtOH, אשר ישמש עבור deparaffinization של סעיפים.
    2. להכין 200 מ של x 1 זמינים מסחרית היעד אחזור ריאגנט על-ידי הוספת 180 מ"ל של dH2O 20 מיליליטר 10 x יעד אחזור מגיב. מקום שני בעלי שקופית באניה. למלא אחד מחזיק שקופיות עם 200 מ ל 1 x יעד אחזור ריאגנט ולמלא מחזיק שקופיות אחרות עם 200 מ של dH2O. חום שני פתרונות לרתיחה באמצעות סיר-הלחץ.
    3. מאגר שטיפת חמים x 50 עד 40 ° צלזיוס במשך 10 – 20 דק להכין 3 L מאגר שטיפת 1 x על ידי דילול 60 מ של prewarmed x 50 שטיפת מאגר עם L 2.94 של dH2O.
    4. בשכונה fume, להכין Hematoxylin של 50% גיל counterstaining פתרון על-ידי הוספת 100 מ של Hematoxylin של גיל 100 מ של dH2O. בשכונה fume, להכין ריאגנט הכחלת (0.02% (w/v) אמוניה מים) על-ידי הוספת מ 1.43 ל 28 – 30% אמוניה מימית 250 מ של dH2O.
    5. Prewarm היעד הגששים ב 40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני בדיקה הכלאה ולהביא את ריאגנטים הגברה (AMP 0-6) RT.

2. RNA בחיי עיר הכלאה Assay

  1. Deparaffinization והתייבשות
    1. לאחר האפייה כפי שמתואר בשלב 1.1.3.2 (אופציונלי לנקודת עצירה 1), deparaffinize בסעיפים קסילן במשך חמש דקות עם עצבנות. Deparaffinize שוב ב קסילן טריים במשך 5 דק Dehydrate 100% EtOH למשך 2 דקות עם עצבנות, חזור שוב בעוד טריים 100% EtOH למשך 2 דקות.
    2. האוויר יבש השקופיות עבור 5 דקות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור אוויר במחזור או ב RT עד שהם לגמרי יבש (נקודת עצירה אופציונלי 2).
  2. לדוגמה בשוטף ובשיפוץ
    1. דגירה את המקטעים ~ 4 טיפות מי חמצן מוכנים לשימוש עבור 10 דקות ב RT כדי להרוות את הפעילות peroxidase אנדוגני. Decant הפתרון מהשקופיות ולשטוף אותם פעמיים עם dH2O.
    2. דגירה הסעיפים עם 200 מ ל מהתרכובת אחזור היעד למשך 15-30 דקות ב 100 ° C בבאניה.
      הערה: זמן הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הרקמה. ב פרוטוקול זה, אחזור המטרה בוצעה למשך 15 דקות עבור דגימות הגידול והן תא כדורי.
    3. Decant הפתרון מהשקופיות, לשטוף פעמיים עם dH2O, טובלים ב-100% EtOH במשך 3 דקות, ויבש יבש השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור אוויר במחזור או ב- RT עד לחלוטין.
    4. צייר מחסום הידרופובי סביב הסעיף באמצעות עט הידרופוביות, כ 0.75 x 0.75 ס מ2.
      הערה: לא מומלץ לצייר מכשול קטן. עבור מקטעים גדולים יותר, מכשול גדול יותר יהיה צורך להיגרר.
    5. תן המכשול יבש לחלוטין עבור 1 דקות, או להשאיר למשך הלילה RT (נקודת עצירה אופציונלי 3).
    6. למקם את השקופיות בעל שקופית והנח המחזיק שקופית במגש בקרת לחות. הוסף ~ 4 טיפות פרוטאז השלישי לכל שקופית, דגירה אותם למשך 15-30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה לעיכול חלבון.
      הערה: זמן הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הרקמה. ב פרוטוקול זה, פרוטאז עיכול בוצעה עבור 30 דקות עבור דגימות הגידול ו- 15 דקות עבור תא כדורי.
    7. Decant הפתרון מהשקופיות ולשטוף אותם פעמיים עם dH2O.
  3. בדיקה הכלאה
    1. הוסף ~ 4 טיפות של הפתרון המתאים המכשיר מוכן לשימוש כדי לכסות את כל האגף. אם באמצעות מקטעים גדולים יותר, להוסיף ~ 5-6 טיפות.
    2. Hybridize של זונדי 2 h ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. Decant הפתרון מהשקופיות ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה בשלב זה.
  4. הגברה של האות
    1. דגירה הסעיפים ~ 4 טיפות של המגבר 0 לכל שקופית ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה במשך 30 דקות Decant הפתרון ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל x 1 שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה בשלב זה.
    2. דגירה הסעיפים ~ 4 טיפות של 1 אמפר לכל שקופית ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה במשך 15 דקות Decant הפתרון ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה.
    3. דגירה הסעיפים ~ 4 טיפות של 2 אמפר לכל שקופית ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה במשך 30 דקות Decant הפתרון ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה.
    4. דגירה הסעיפים ~ 4 טיפות של המגבר 3 לכל שקופית ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה במשך 30 דקות Decant הפתרון ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה.
    5. דגירה הסעיפים ~ 4 טיפות של 4 אמפר לכל שקופית ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה במשך 15 דקות Decant הפתרון ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה.
    6. דגירה הסעיפים ~ 4 טיפות של 5 אמפר לכל שקופית ב RT במשך 30 דקות Decant הפתרון ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה.
    7. דגירה הסעיפים ~ 4 טיפות של 6 אמפר לכל שקופית ב RT במשך 15 דקות Decant הפתרון ולשטוף את השקופיות ב- 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב RT עם עצבנות מפעם לפעם. חזור על הפעולות כביסה.
  5. אות זיהוי
    1. הכינו את הצבע האדום מהר עובד פתרון. עבור שקופית אחת עם מחסום2 0.75 x 0.75 ס מ, להוסיף 2 μL של צבע אדום-B מהר μL 120 הצום אדום-A לתוך צינור לערבב היטב.
      הערה: בהתאם לגודל של הידרופובי המכשול, מספר השקופיות, כרכים של הפתרון עובד מהר אדום ישתנו.
    2. Decant את הנוזל העודף מהשקופיות ולהוסיף את הצבע האדום מהר עובד פתרון על השקופיות. דגירה השקופיות 10 דקות ב RT במגש עם כיסוי כדי למנוע חשיפה קלה.
      הערה: השתמש מהר האדום עובד פתרון בתוך 5 דקות של הכנה, אינם חושפים אותו לקרני השמש או אור UV.
    3. Decant הפתרון מהר אדום ולשטוף את השקופיות פעמיים עם מי ברז. מקם את השקופיות חזרה בארון תקשורת שקופית.
  6. Counterstaining
    1. Counterstain הסעיפים רקמות עם פתרון Hematoxylin של גיל 50% למשך 2 דקות בשטיפת RT. השקופיות עם מים מהברז, חזור על פעולה זו מספר פעמים עד השקופיות ברורות, בעוד הסעיפים להישאר סגול. טובלים את השקופיות למים אמוניה 0.02% על הכחלת (לטבול 2-3 פעמים). להחליף את המים אמוניה עם ברז מים ולשטוף את השקופיות 3 – 5 פעמים.
  7. שקופית הרכבה
    1. יבש השקופיות בתנור אוויר במחזור ב 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות או ב- RT עד לגמרי יבש. במקום 1-2 טיפות של ריאגנט גובר על כל שקופית ומקום coverslips מעל כל מקטע. הימנע כל לכידה של בועות אוויר. האוויר יבש השקופיות לפחות 5 דקות.
      הערה: המצע מהר אדום הוא רגיש אלכוהול. לא מייבשים את השקופיות באלכוהול.
  8. ויזואליזציה
    1. לבחון את השקופיות תחת מיקרוסקופ רגיל brightfield.

תוצאות

בחיי עיר הכלאה assay זרימת העבודה:
זרימת העבודה מתואר באיור 1, מורכב מארבעה חלקים: permeabilization של תאים או רקמות עם היעד אחזור ופתרונות פרוטאז, הכלאה של הגששים אל המטרה RNA, אות הגברה, והדמיה של האות. האות ניתן גם ניתן לכמת באמצעות מערכות תוכנה הדמיה דיגיטלית או בצורה כמותית למחצה מבוסס על מספר נקודות בכל תא. ההליך הידני המתואר באיור 2 יש גם היה מלא אוטומטית במערכות מסחריות מכתים אוטומטית.

צביעת נציג לזיהוי צומת אקסון (variant אחוי EGFRvIII): EGFRvIII הוא וריאציה של קולטן גורם הגדילה באפידרמיס שעולה ממחיקה גנומית בתוך מסגרת של exons 2-7, שמוביל איתות oncogenic צורונים פעילים7 . וזמינותו שימש לזיהוי מצב EGFRvIII בדגימות גידול גליובלסטומה (GBM) FFPE. הגששים כפול-Z יחיד תוכננו כדי להתפרס על צמתי אקסון כדי לזהות גם WT, מוטציה, או שני תעתיקים (איור 3 א). הגששים WT EGFR להקיף את צמתי של exons 1 ו-2 (E1/E2) או exons 7 ו-8 (E7/E8), ואילו הגששים ספציפי EGFRvIII span לצומת של exons 1 ו- 8 (E1/E8). בדיקה נפוצה המתפרס על הצומת בין exons 8 ו- 9 (E8/E9) שימש גם לזהות EGFR הכולל (תעתיקים WT וגם EGFRvIII). כל הגששים נהגו ואז לקבוע מצב EGFR בדגימות FFPE GBM. שתי הדוגמאות נציג שמוצג באיור 3B נלקחו ממחקר גדול יותר. מצב EGFR אושר ע י שיטה עצמאית, RT-PCR. שני רגשים WT אותר אות שתי דגימות, המציין כי בשתי הדגימות להביע EGFR WT (איור 3B). עם זאת, המכשיר מוטציה הראה רק אות זיהוי בדוגמת EGFRvIII +, המאשר כי דוגמה זו היא אכן חיובי עבור הגרסה EGFRvIII (איור 3B, לוחות שמאלה). לעומת זאת, המכשיר מוטציה לא זיהה אות EGFRvIII-המדגם (איור 3B, לוחות נכון). יחדיו, תוצאות אלו ממחישות כי וזמינותו צומת אקסון יכול לזהות מצב EGFRvIII בדגימות הגידול GBM FFPE.

נציג צביעת עבור מטרות קצרות:
CDR3, או האזור הקובע משלימים 3, הוא תחום מאוד משתנה ב- T-cell קולטנים. בדרך כלל, רצף CDR3 קצרות למדי; לדוגמה, CDR3 α וβ רצפי מהקו Jurkat T-cell הם נוקלאוטידים 51 ו-48 אורך, בהתאמה (איור 4A). כדי לזהות את רצפי CDR ספציפיים הביע בתאים Jurkat, antisense זונדי CDR3 α וβ באים לידי ביטוי בקו Jurkat T-cell נוצרו, בנוסף תחושה זונדי CDR3 α וβ לשמש שלילי שליטה רגשים. כל הגששים נבדקו ואז בתאים Jurkat FFPE איך מכינים עם וזמינותו. צביעת חזקים נצפתה עם תחושה אנטי זונדי בשני CDR3 α וβ בתאים Jurkat, ואילו החוש רגשים זוהה ללא השדר הקטן (איור 4B). תוצאות אלה מדגימים את היכולת של וזמינותו יעד קצר כדי להבחין בין רצפים CDR מאוד משתנה אבל קצר עבור T-cell קולטן שיבוטים.

נציג צביעת עבור נקודת מוטציה EGFR L858R:
נקודת מוטציה הגששים פותחו כדי לזהות שינויים נוקלאוטיד יחיד, קטן שהתוספות או המחיקות (INDELs) על רקע הגידול. איור 5A מדגים את היכולת בחיי עיר גילוי של המוטציה נקודת EGFR L858R (2573T > G). שני רגשים תוכננו: אחד כדי לזהות את L858R מוטציה EGFR רצף, ועוד אחד כדי לזהות את רצף EGFR L858 WT. שתי הבדיקות נבדקו בשתי שורות, מוכנים FFPE תא: H2229, אשר רק מבטאת EGFR L858 WT; H1975, אשר הוא משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים בשביל המוטציה EGFR L858R. החללית מוטציה L858R אותר אות רק את שורת התאים H1975 אך לא את שורת התאים H2229. עם זאת, המכשיר WT זיהה אות בשתי השורות התא. באופן דומה, איור 5B מדמיין בחיי עיר זיהוי המוטציה נקודת קראס G12A (35 G > C). שני רגשים היו נועד לזהות את רצפי MT קראס G12A ו- WT G12 קראס, נבדק לאחר מכן על הקו תא HuT78 (אשר רק מבטאת קראס G12 WT) לבין הקו תא SW116 (שהיא משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים בשביל המוטציה קראס G12A). בעוד החללית קראס G12 WT אותר אות בשתי השורות תא, החללית קראס G12A זוהה רק אות קו תא SW116. נתונים אלה יחדיו, להפגין את היכולת הטכנית של וזמינותו נקודת מוטציה באיתור נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים בהקשר של תאים ורקמות.

נציג צביעת עבור וזמינותו אוטומטיות ב באתרו :
מבחני אוטומטית לאפשר מספר רב יותר של דוגמאות לפעול בצורה מהימנה יותר, מזעור הבין-המשתמש השתנות, הפעם תרגולים, הפקת תוצאות לשחזור באופן עקבי. לכן, פותחה גרסה אוטומטית של וזמינותו. להפגין מכתים אוטומטית עם זה וזמינותו, זיהוי של variant אחוי METΔ14 נבדק. וריאנט זה הוא התוצאה של אקסון 14 ב הגן MET מדלגת pre-mRNA שחבור, מה שמוביל הפעלה מכוננת וטרנספורמציה oncogenic של8,הקולטן MET9. במיוחד לזהות את הווריאציה METΔ14, תוכננו שני רגשים צומת אקסון: אחת המתפרסת על הצומת בין exons 13 ו- 15 (E13/E15) כדי לזהות את התעתיק וריאנט METΔ14 ואחרת המתפרס על הצומת בין exons 14 ו- 15 (E14/E15) כדי לזהות את WT נפגשו תעתיק (איור 6A). שתי הבדיקות נבדקו ואז ב-2 שורות תא FFPE, מוכנים: H596, אשר מבטאת את הווריאציה METΔ14, ו A549, אשר מבטאת את הגן WT נפגשו. שני רגשים הראה דפוסי ביטוי שבחירה, עם החללית E13/E15 מזהה רק אות התאים H596, החללית E14/E15 רק גילוי אותות בתאים A549 (דמויות 6B ו- 6 C). לבסוף, רגש dapB הראה אין אות, המציין אין אות רקע (דמויות 6B ו ג 6). בסך הכל, נתונים אלה מדגים זיהוי ספציפי של ה MET וריאנט METΔ14 בחיי עיר ניצול וזמינותו BaseScope אוטומטית.

figure-results-5358
איור 1 : זרימת העבודה assay. זרימת העבודה מורכב 4 שלבים עיקריים: רעלני כדי permeabilize תאים או רקמות, בדיקה הכלאה למטרה RNA, אות הגברה, אות זיהוי על ידי החזותיים במיקרוסקופ brightfield או פלורסנט. ניתן לכמת והנקודות הבודדות באמצעות פלטפורמה ניתוח תמונה דיגיטלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5961
איור 2 : איור של פרוטוקול assay ידנית. הבדיקה כולה יכולה להסתיים ב- 9 ח' רעלני פעמים עשויים להשתנות בהתאם לסוג הרקמה, ולכן רצוי להיעזר בנספח א' במדריך למשתמש בשביל לרקמות רעלני המלצות בנוגע זמן הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6502
איור 3 : להחליפן בתמונות של אקסון צומת זיהוי. (א) מוצג כאן הן הארגון אקסון תעתיקים EGFR WT ו EGFRvIII שרטוט המתאר הגששים צומת כפול-Z אקסון הנפרשים על פני הצומת כדי לזהות EGFR WT או EGFRvIII. (B) אקסון צומת assay בוצעה על שתי דגימות גליובלסטומה FFPE באמצעות את הגששים המפורטים ב (א), כמו גם dapB בקרת החללית, POLR2A ובדיקה שליטה שלילי, חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7217
איור 4 : להחליפן בתמונות של יעד קצר רצף זיהוי. (א) מוצג כאן הן סדרות CDR3 בתאים Jurkat. הרצף בשחור הוא רצף נפוצות איגוף, הרצף באדום הוא ייחודי CDR3α או CDR3β. יעד קצר כפול-Z בודד רצף הגששים תוכננו נגד רצפי אלה. (B) וזמינותו יעד קצר בוצעה על תאים Jurkat מוכנים כמו גלולה תא FFPE באמצעות אנטי תחושה או תחושה הגששים פילוח של רצפי (א), ו dapB שימש פקד שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7945
איור 5 : להחליפן בתמונות של זיהוי נקודת מוטציה. (א) הבדיקה בוצעה H2229 תאים (homozygous עבור EGFR L858) ותאים H1975. משפחתית דוסון ולא משפחתית (. הטרוזיגוטיים בשביל המוטציה EGFR L858R) מוכנים כמו גלולה תא FFPE באמצעות מוטציה נקודה אחת כפול-Z הגששים פילוח של EGFR L858 WT רצף או EGFR L858R רצף מוטציה. (B) וזמינותו נקודת מוטציה בוצעה HuT78 תאים (homozygous עבור G12A קראס) ותאים SW116. משפחתית דוסון ולא משפחתית (. הטרוזיגוטיים בשביל המוטציה קראס G12A) מוכנים כמו גלולה תא FFPE באמצעות מוטציה נקודה אחת כפול-Z הגששים מיקוד הרצף קראס G12 WT או רצף G12A קראס מוטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8882
איור 6 : להחליפן בתמונות של צביעת אוטומטית עם וזמינותו צומת אקסון. (א) מוצג כאן הינו הארגון אקסון תעתיקים פגש WT ו- METΔ14, שרטוט המתאר הגששים צומת יחיד כפול-Z אקסון הנפרשים על פני הצומת כדי לזהות פגש WT או METΔ14. (B) ו- (ג) וזמינותו צומת אקסון אוטומטיות בוצעה H596 תאים (ביטוי METΔ14) ותאים A549 (המבטא פגשו WT) מוכנים כמו גלולה תא FFPE באמצעות את הגששים המפורטים ב (א), כמו גם שליטה שלילי בדיקה dapB. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אקסון צומתרצף קצרנקודת מוטציה
אחוי משתנה/isoformרצפים בין 50 ו 300 ntנקודת מוטציה
RNA מעגלי (circRNA)רצפים הומולוגיים מאודויאסין קצר
ג'ין פיוז'ןרצף CDR3 TCR שיבוטיםג'ין עריכה
נוקאאוט גנטי (KO)Pre-miRNA
RNA קטנים nucleolar (snoRNA)
ג'ין עריכה

טבלה 1: יישומים של בחיי עיר assay. ישנם 3 קטגוריות עיקריות עבור יישומים של assay הזה: אקסון צומת היעד קצר רצף, נקודת מוטציה. רשום בכל עמודה הם כמה דוגמאות יישומים ספציפיים עבור כל קטגוריה.

Discussion

בדו ח זה, פרוטוקול assay איש הרומן ויישומיה נדונו בפירוט. וזמינותו מאפשר פריט חזותי ישיר של צמתי אקסון, רצפים קצרים-יעד, מאוד הומולוגי מוטציות נקודה בהקשר של רקמות. וזמינותו המבוסס על טכנולוגיית RNAscope5 ולכן מסוגל גילוי מולקולה בודדת. עם זאת, בשל מערכת הגברה מתקדמת, האות ניתן להבחין עם הגששים המכיל זוג כפול-Z מעט ככל אחד או באורך תבנית היעד של נוקלאוטידים רק 50. כי הגששים עשוי להיות קצר ככל כפול-Z יחיד באורך, זה מאפשר איתור של צמתי אקסון, רצפים קצרים-יעד, מאוד הומולוגי מוטציות נקודה (טבלה 1).

לביצועים מוצלחת של וזמינותו, ישנן מספר המלצות טכניות. קודם כל, להיות קבועה רקמות בפורמלין טריים 10% באגירה נייטרלי (NBF) בטמפרטורת החדר במשך 16-32 h10. Underfixation (< 16 h) או overfixation (> 32 h) יפגום ביכולת ביצוע וזמינותו ועשויה מיטוב נוספות. שנית, כדי להבטיח בקרה אופטימלית של טמפרטורה ולחות, אשר נדרשים עבור הגברה הכלאה ושידור בדיקה חזקים, השקופית עיבוד תנור ומערכת הכלאה אמור לשמש עבור פרוטוקול צעדים 2.3 ל 5 (פרוטאז pretreatment, בדיקה הכלאה הגברה אות, אות זיהוי). מאגרי שיורית השלישי, עודף צריכה להיות יצק כראוי לפני כל שלב לאורך כל הפרוטוקול (אבל לא עד כדי כך הסעיפים רקמות לייבש). אם השקופיות יתייבשו, האות לא ספציפית משמעותי יפתחו. רביעית, בהתאם לסוג הרקמה, אופטימיזציה pretreatment ייתכן שיהיה צורך. שימוש פרוטאז של שגוי או ביצוע עבור אורך זמן שיוצרת עלולה לגרום בתחת - או over - digestion, תהיה השפעה שלילית על האות. לבסוף, חשוב תמיד להפעיל פקדי חיוביות ושליליות עם הגששים הבדיקה. בקרה שלילית הגששים ודא כי אין אות רקע ולהבטיח בקרה חיובית הגששים וזמינותו נעשתה כראוי איכות ה-RNA במדגם האופטימלי עבור פענוח תוצאות בדיקה הבדיקה. אם אין שום אות עם החללית בקרה חיובית, ואז איכות ה-RNA במדגם סביר שיוצרת אות לא ניתן לראות עם החללית הבדיקה.

בנוסף וזמינותו ידני, היכולת לבצע את הבדיקה על stainers אוטומטית היה גם הפגינו (איור 6). Assay איש אוטומטית זו מניבה יחס אות לרעש גבוה והוא ישים אותם יישומים כפי שמוצג בטבלה 1; עם זאת, היתרונות של assay אוטומטיות כוללים סטנדרטיזציה של תנאי assay, וצמצום של הבין-המשתמש השתנות, הפעם תרגולים, הקצבה להקרנה תפוקה גבוהה של דגימות רקמה באופן אמין.

בעוד אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו- PCR לרביעיית לאפשר גילוי של גרסאות אחוי (במיוחד EGFRvIII), FFPE דגימות קליניות, טכניקות אלה יכולה לחסור יחודיות הכרחי, לא מציעים תובנה הרזולוציה המרחבית של splice ביטוי משתנה, בהתאמה11,12. יתרון מפתח של וזמינותו של פרוטוקול זה הוא שלה ויזואליזציה מאוד רגיש וספציפי של צמתי splice תוך שמירה על ההקשר רקמות מורפולוגי. כאן, היכולת של וזמינותו בדיוק המטרה צמתי אקסון ייחודי עבור מספר גרסאות splice, כולל EGFRvIII, METΔ14, היה והפגינו (דמויות 3 ו-6). בנוסף, וזמינותו הוכח לזהות את הווריאציה splice AR-V7 סרטן הערמונית, מספר איזופורמים של ErbB4 במוח, ואישור של נוקאאוט של RNA Cdr1as מעגלי ב13,143,מוח העכבר.

גילוי רצף מטרה קצרים מאת assay איש זה מאפשר הדמיה של רצפי RNA קצר ככל נוקלאוטידים 50 אורך, כפי שמתואר על ידי הגילוי של רצפים CDR3 שמקורם תאים Jurkat (איור 3). וזמינותו יכול גם לזהות רצפי הגן כי הם מאוד הומולוגיים או בני משפחה אחרים או מינים, כפי שהראה Revêchon et al., שנהג וזמינותו יעד קצר כדי לזהות progerin האנושית שבאה לידי ביטוי העכבר רקמת השומן התת עורית לבן15. בנוסף, RNA קטנים nucleolar (snoRNA) CRISPR בתיווך גנים ועריכה של קודמן-microRNA ניתן שזוהו בחיי עיר עם יעד קצר וזמינותו. לאחרונה, פו. ואח בשילוב הזה assay איש עם IHC לזיהוי מדויק תאים ברשתית לבטא את mir125b טרום-miRNA16.

מוטציה פרופיל בגידולים חיוני ללמוד את ההתקדמות של גידולים ולפיתוח טיפולים ממוקדים. בזמן יצירת פרופיל המוטציה יכולה להיות מושגת באמצעות רצף תפוקה גבוהה, טכנולוגיה זו אינה יכולה לטפל באופן מלא intratumoral הטרוגניות או קישור שינויים גנטיים עם מורפולוגיה הסלולר17,18. זיהוי מוטציות נקודה שימוש assay איש זה מאפשר הבחנה של רצפי RNA היעד ברזולוציה בסיס יחיד, כמו מאומת על ידי הגילוי של וריאציות נוקלאוטיד יחיד EGFR L858R G12A קראס בשורות תאים (איור 5). יתר על כן, בייקר. et al. להשתמש וזמינותו מוטציה נקודת היעד מוטציות מרובות oncogenes BRAF קראס, PIK3CA סרטן המעי הגס18. הם היו מסוגלים לזהות ולמפות במרחב subclones מוטציה נדירה של תאים סרטניים, בסופו של דבר מציג כיצד הם תורמים אינטרה-גידול הטרוגניות.

לסיכום, פותחה assay מיוחדים איש ה-RNA. מתודולוגיה זו מאפשרת הגילוי של גרסאות splice רצפים קצרים, מוטציות ב באתרו. זה רגיש, ספציפית, הניתנת לכימות, וישימה ביצועים על ידי שיטות ידנית והן על stainers אוטומטית.

Disclosures

כל המחברים מועסקים על ידי מתקדם תא דיאגנוסטיקה בע מ

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)ACD310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid)ACD310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017ACD310017
HybEZ Humidifying PaperACD310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) Vector Laboratory H-4000
SuperFrost Plus Slides (required) Fisher Scientific 12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF) MLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin waxMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
MicrotomeMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I American Master Tech Scientific/MLS HXGHE1LTMLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene Fisher Scientific/MLSX3P-1GALMLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack American Master Tech Scientific/MLSLWSRA24MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes American Master Tech Scientific/MLSLWT4457EAMLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant American Master Tech Scientific/MLSLWT4456EAMLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH) American Master Tech Scientific/MLSALREACSMLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required)Vector Labs H-5000
Cover Glass, 24 mm x 50 mmFisher Scientific/MLS 12-545-FMLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30%Sigma-Aldrich/MLS320145-500mLMLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L)MLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer//
Digital thermometerMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °CMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1,000 μLMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled waterMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes)MLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hoodMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinderMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
ParafilmMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paperMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
MicrocentrifugeMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessoriesMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °CMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
FormaldehydeMLS/MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
HistogelFisher Scientific/MLS22-110-678
BaseScope Reagent Kit - REDAdvanced Cell Diagnostics322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2Advanced Cell Diagnostics701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8Advanced Cell Diagnostics701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8Advanced Cell Diagnostics701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9Advanced Cell Diagnostics701731
BaseScope Hs-MET-E14E15Advanced Cell Diagnostics701811
BaseScope Hs-MET-E13E15Advanced Cell Diagnostics701801
BaseScope Hs-KRAS-G12AAdvanced Cell Diagnostics705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WTAdvanced Cell Diagnostics705531
BaseScope Hs-EGFR-L858RAdvanced Cell Diagnostics705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WTAdvanced Cell Diagnostics705461
BaseScope Control Probe Pack HumanAdvanced Cell Diagnostics322975

References

  1. Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
  2. Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
  3. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
  4. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
  5. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  6. Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016)
  7. An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , (2018).
  8. Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
  9. Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
  10. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
  12. Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
  13. Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , (2017).
  14. Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , (2017).
  15. Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
  16. Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
  17. Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
  18. Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138RNAFFPE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved