Potencial de acción óptica específica de subtipo grabaciones en humanos inducida por cardiomiocitos ventriculares derivadas de células madre pluripotentes

Resumen

Aquí presentamos un método de imagen ópticamente potenciales de la acción, específicamente en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas como ventricular. El método se basa en la expresión de una proteína fluorescente sensible al voltaje impulsado por el promotor.

Resumen

Cardiomiocitos generados a partir de las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSC-CMs) son una herramienta emergente en investigación cardiovascular. En lugar de ser una población homogénea de células, el CMs de iPSC generado por los protocolos actuales de diferenciación representa una mezcla de células con ventricular-, la-y nodal como fenotipos, que complica el análisis fenotípicos. Aquí, se presenta un método para ópticamente registrar potenciales de acción específicamente de ventricular como iPSC-CMs. Esto se logra mediante transducción lentivirales con una construcción en la que un indicador de tensión genéticamente codificado es bajo el control de un elemento promotor ventricular específica. Cuando son transduced iPSC-CMs con este constructo, el sensor de tensión se expresa exclusivamente en células ventriculares, permitiendo grabaciones potencial membrana óptica específica de subtipo usando microscopía de fluorescencia Time-lapse.

Introducción

Cardiomiocitos (CMs) derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son una herramienta emergente para diseccionar los mecanismos moleculares de enfermedades del corazón, para investigar nuevas terapias y pantalla para cardiacas adversas efectos^{1,2 ,3}. Desde el principio, arritmogénica enfermedades como canalopatías han sido un foco importante de esta área de investigación⁴. En consecuencia, los métodos para investigar fenotipos eléctricos de CMs, como arritmias o cambios en la morfología del potencial de acción (AP), son en el corazón de esta tecnología.

Una consideración importante en la aplicación de iPSC-CMs es que los protocolos actuales de diferenciación cardiaca no en una población homogénea de células. En cambio, son más bien una mezcla de células que se asemejan a nodo sinusal, auricular y CMs ventriculares en diferentes niveles de maduración^5,6,7,8. Esta heterogeneidad puede ser una fuente de la variabilidad experimental, sobre todo si investigan parámetros tales como duración del AP (APD), que intrínsecamente diferencian entre los subtipos de CM (por ejemplo, es más corto en el APD atrial que en el ventriculares CMs). El enfoque convencional para solucionar este problema es investigar solo iPSC-CMs utilizando el método de patch clamp y clasificar cada célula como nodal-, la-, o como ventricular, en base a su morfología de AP⁹. Cualquier análisis posterior pueden quedar entonces restringida a las células que representan el subtipo CM de interés. El mayor inconveniente de esta estrategia es su falta de escalabilidad y rendimiento limitado. Por otra parte, la naturaleza invasiva de electrofisiología de la abrazadera del remiendo no permite la proyección de imagen de las mismas células secuencialmente durante períodos de tiempo extendidos.

Aquí, le ofrecemos detalles experimentales en un método¹⁰ desarrollado para ópticamente la imagen APs en subtipos específicos de iPSC-CMs. Esto supera el problema de heterogeneidad de subtipo y aumenta considerablemente el rendimiento en comparación con los métodos convencionales, permitiendo la rápida phenotyping de iPSC-CMs lleva variantes genéticas o ser expuesto a farmacológico agentes.

Resumen del enfoque de proyección de imagen óptico específica de subtipo

Un indicador de tensión genéticamente codificados (GEVI), cuyas propiedades de fluorescencia el cambio en la despolarización y repolarización de la membrana celular, se utiliza a la imagen ópticamente cambios del potencial de membrana de CMs. El GEVI aplicado aquí es la proteína fluorescente detector de tensión VSFP-CR¹¹, que consiste en un dominio de transmembrana detector de tensión unido a un par de una verde (trébol) y una proteína fluorescente roja (mRuby2) (figura 1A). Debido a la cercanía de los dos fluoróforos, la excitación de la proteína verde fluorescente resulta en una fracción de la energía de excitación se transfiere a la proteína fluorescente roja a través de transferencia de energía de Förster Resonancia (FRET). Por lo tanto, la excitación de la proteína verde fluorescente resulta en una emisión desde el verde y el rojo proteínas fluorescentes (figura 1A, panel superior). Cuando la célula se despolarice, un cambio estructural del sensor de voltaje se produce que se traduce en una reorientación de las dos proteínas fluorescentes, aumentando la eficiencia del traste. Así, aún más de la energía de excitación es transferida de la verde a la proteína roja fluorescente (figura 1A, panel inferior). Como resultado, en una celda despolarizada, la emisión de fluorescencia verde es dimmer, y la emisión de fluorescencia roja es más brillante que en una célula en reposo el potencial de membrana (figura 1B).

Figura 1: proyección de imagen óptica de con VSFP-CR. potencial de membrana (A) A esquema que representa la acción de la proteína fluorescente sensible al voltaje que se muestra VSFP-CR. A la despolarización de la membrana celular, un cambio estructural en el dominio transmembrana de detector de tensión se traduce en una reorientación de la verde (GFP) y proteína fluorescente de roja (RFP), aumento de la eficiencia de Förster intramolecular transferencia de energía de resonancia (FRET). Se muestran los espectros (B) la emisión de una VSFP a la excitación de la GFP en células el potencial de membrana de reposo (panel superior) y en células despolarizadas (panel inferior). El cambio espectral sobre la despolarización es exagerado para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los cambios en la eficiencia de traste refleja las fluctuaciones de los potenciales de membrana son imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un separador de la imagen, que separa las emisiones de fluorescencia rojo y verde y proyectos en dos áreas adyacentes del el chip de una cámara sCMOS (figura 2). Con esta configuración, la emisión de fluorescencia en dos bandas de diferentes longitudes de onda puede grabarse simultáneamente, que permite el cálculo de un cociente de la fluorescencia de rojo a verde para reflejar el potencial en cada imagen de una serie de Time-lapse de membrana.

Figura 2: configuración del sistema de proyección de imagen. Los componentes principales del sistema de imagen utilizan para imagen se representan los cambios espectrales de la proteína fluorescente de voltaje-sensibles al reflejo de los cambios de potencial de membrana con una alta resolución temporal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La expresión de VSFP-CR en el CMs se logra mediante transducción lentivirales. A la directa expresión del subtipo CM de interés, los lentivirus contiene un elemento promotor (el reforzador MLC2v ) que específicamente unidades de transcripción en ventricular como iPSC-CMs¹⁰. Cuando el CMs de iPSC que representan una mezcla de células atrial-como, como nodal y ventricular como son transduced con este lentivirus, VSFP-CR se expresa solamente en las células ventriculares. Puesto que la proyección de imagen óptica potencial de acción depende de este sensor fluorescente, los potenciales de acción registrados representan exclusivamente el subtipo CM de interés (figura 3).

Figura 3: expresión de VSFP impulsado por el promotor para la proyección de imagen potencial de membrana específicos de subtipo. (a) este esquema muestra cómo se consiguen grabaciones de potencial de acción óptica específica de subtipo de cardiomiocitos. (b) iPSC-CMs infectados con un VSFP bajo el control del ventriculares específicas MLC2v-enhancer se muestran. La expresión del sensor del voltaje se observa sólo en CMs ventricular como en el canal GFP (panel izquierdo). También se proporcionan el contraste de fase (panel central) y la imagen de superposición (panel derecho). Las líneas blancas punteadas marcan límites de la celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. preparación de cardiomiocitos derivados de iPSC para la proyección de imagen

Nota: Métodos para la diferenciación de la cultura y cardiaco de iPSC se han publicado antes de^12,13,14 y no se discutieron aquí en detalle. La purificación de iPSC-CMs por microdisección manual, separación magnética de células o selección de lactato se recomienda, según el protocolo de diferenciación utilizado. Para el siguiente protocolo, explantes microdissected de batir zonas, generadas usando una capa monomolecular diferenciación protocolo¹³, fueron tomadas el día 15 de una diferenciación cardiaca y cultivados hasta el día 30 en las placas de revestimiento de fibronectina como se describe antes de¹⁰.

1. Tomar la célula placas en la incubadora y recoger manualmente los explantes cardíacos en tubos de microcentrífuga utilizando una pipeta de 200 μl. Después de la sedimentación, aspirar el sobrenadante de cultivo celular y lave suavemente los explantes 2 con madeja de balanceado sal solución (HBSS).
2. Disociar iPSC-CMs por agregar colagenasa tipo II (430 U/mL en HBSS) e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
3. Después de la sedimentación de las restantes células grandes agrupaciones, recoger el sobrenadante que contiene el únicos disociados iPSC-CMs y añadir esto a medio fresco de mantenimiento de CM que contiene una concentración alta de suero bovino fetal (FBS) (DMEM-F12, 20% SFB, 2 mM L-glutamine, MEM de 1: 100 no esenciales aminoácidos, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina y 0.1 mM β-mercaptoetanol).
4. Repita la disociación si quedan grumos de células grandes. Cobrar solo iPSC-CMs por centrifugación y resuspender en medio CM que contiene una baja concentración de FBS (2% FBS).
5. Volver a la semilla sola iPSC-CMs en una densidad que permite la posterior proyección de imagen de células individuales en un 3,5 cm fondo de cristal de la célula cultura microdish que ha sido cubierta con fibronectina (2 μg/cm²). Optimizar la densidad de siembra antes de participar en experimentos de alto rendimiento. Generalmente, 5 – 10 explantes cardíacos por plato 3,5 cm son suficientes; sin embargo, esto mucho depende del tamaño del explante y la pureza.
6. Cultura el iPSC-CMs solo después de su disociación en medio de mantenimiento de CM que contiene 2% FBS durante al menos 48 h para asegurar una recuperación suficiente.
   Nota: En los próximos pasos son transduced iPSC-CMs con un lentivirus GEVI VSFP-CR bajo el control de un potenciador de MLC2v ¹⁰ para lograr una expresión de GEVI ventriculares específicas de codificación. Alternativomente, lentivirales construcciones que permiten para expresar el GEVI específicamente en las células como nodales o auriculares, o un constructo inespecífico que el promotor PGK ubicuo expresada, puede ser usado¹⁰. Lentivirales plásmidos están disponibles bajo petición.
   PRECAUCIÓN: Cuando se trabaja con partículas lentivirales, asegúrese de que el ambiente de trabajo tiene el nivel de bioseguridad adecuado, siga las instrucciones de seguridad para trabajar con agentes potencialmente infecciosos y tomar las precauciones de seguridad necesarias.
7. Preparar el medio de infección mediante la mezcla de los lentivirus¹⁰-con cultivo celular sobrenadante, que se ha producido en las células HEK293, tal como se describe antes del¹⁵, con medio de mantenimiento de CMs (consulte el paso 1.3) en una proporción 1:1.
8. Añadir bromuro de hexadimethrine en una concentración final de 8 μg/mL para aumentar la eficiencia de la infección.
   Nota: Debido a la infección alta eficiencia de concentración previo iPSC-CMs de lentivirus por ultracentrifugación generalmente no es necesario.
9. Aspirar el medio de mantenimiento CM desde el único CMs de iPSC y sustituirla por el medio de infección preparado durante pasos 1.7 y 1.8. Cultura el iPSC-CMs solo infectado en el medio de infección de 12 h a 37 ° C. Luego, aspirar el medio y sustituirla por otra vez medio de mantenimiento CM.
   Nota: Una señal de fluorescencia de la GEVI aparece 48 horas después de la infección. Una proyección de imagen de las grabaciones de potencial de membrana se recomienda, 72 h después de la infección lo antes posible, para asegurar una señal adecuada. IPSC-CMs infectados solo pueden cultivadas durante al menos 3 semanas y reflejadas secuencialmente. Si fotoblanqueo extenso ocurre durante una sesión de imágenes, la señal de fluorescencia se recupera con el tiempo.
10. Antes de la proyección de imagen, cambiar el medio de cultivo celular por la solución de Tyrode suplementado con Ca^{2 +} (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, glucosa 10 mM, 1,8 mM CaCl₂y 10 mM HEPES; pH 7.35).

2. óptico membrana potenciales grabaciones

1. Coloque la cámara imágenes que contiene el iPSC-CMs en el escenario de un microscopio invertido de epifluorescencia equipado con un divisor de imagen, los sistemas de filtro apropiado y una cámara (por ejemplo, una cámara sCMOS) capaz de proyección de imagen de alta velocidad en un alto sensibilidad.
   Nota: por ejemplo, uso una excitación de paso de banda de 480/40 nm filtro combinado con un espejo dicroico de paso largo de nm 500 en el microscopio, y 568 nm largo paso dicroico espejo combinado con 520/28 nm y filtros de emisión de 630/75 nm band-pass en el separador de la imagen. Para la proyección de imagen de unicelular, un objetivo de inmersión de aceite de alta magnificación, alta abertura numérica proporciona la mejor relación señal a ruido.
2. Si se requiere de estimulación eléctrica, instalar electrodos de estimulación en la sala de proyección de imagen y conectar a un generador de estímulo.
   Nota: Utilizamos un recuadro estimulación que contiene dos electrodos de platino y equipadas en los platos de cultivo celular 3,5 cm fondo de cristal. Fueron imágenes de las células situadas entre los electrodos. Parámetros típicos de estimulación son pulsos rectangulares de 5 ms de duración, con una amplitud de 10 V/cm de distancia de electrodo.
3. Utilizar una platina del microscopio climatizada para garantizar una temperatura estable de las iPSC-CMs durante la proyección de imagen, o incluso un microscopio incubación preparación de cámara si la intención de la proyección de imagen a largo plazo.
4. Las células a foco y colocar una célula expresando el GEVI en el centro del campo de visión.
   Nota: Esto se hace mejor mediante el uso de los oculares del microscopio usando una proteína fluorescente verde (GFP) o un rojo proteína fluorescente (RFP) filtro establecido para identificar las células que expresan el GEVI.
5. Establecer la trayectoria óptica para que la luz emitida se encamina al divisor de imagen. Cambiar el cubo de filtro en el microscopio al combinarse con los filtros en el divisor de imagen (véase Tabla de materiales).
6. En el software de control de la cámara, configuración de la adquisición para que la proyección de imagen de alta velocidad (por ejemplo, 100 cuadros por segundo, con un tiempo de exposición de 10 ms por fotograma) es posible.
   Nota: Generalmente, se trata de binning de píxeles de la cámara (p. ej., 8 x 8 píxeles de la viruta de la cámara se clasifica para generar un píxel en la película Time-lapse).
7. Establecer el separador de la imagen según las instrucciones del fabricante. Las dos imágenes que representan a las dos bandas de longitud de onda de emisión diferentes deben ser adyacentes entre sí, cada uno ocupando una mitad de la imagen.
   Nota: Este paso debe ser realizado sólo 1 x al principio de cada sesión de imagen.
8. Comprobar y, si es necesario, ajuste el enfoque de la imagen producida por la cámara.
9. Ajustar el brillo de la luz de la iluminación para que se evite cualquier saturación de los píxeles; Esto puede hacerse fácilmente mediante el uso de una paleta de colores en la que píxeles saturados están representados por un color único.
   Nota: Durante todos estos preparativos antes de la proyección de imagen, limitar la exposición de la muestra a la excitación a la cantidad necesaria (es decir, no deje la luz de largos períodos de tiempo) para evitar el fotoblanqueo del GEVI.
10. Establecer la adquisición de la serie de tiempo (por ejemplo, 5.000 imágenes a 100 fotogramas por segundo durante una serie de 50 s). Atenuar la luz en la habitación (incluidos los monitores de ordenador) para evitar la luz externa que influyen en la medición. Si el obturador de la luz de excitación no es controlado por el software de imágenes, abrir justo antes de iniciar la adquisición.
11. Iniciar la adquisición de la imagen de la serie. Si se desea la estimulación eléctrica, iniciar la secuencia de estimulación en el momento apropiado, a menos que se inicia automáticamente por el software de imágenes. Si se desea la aplicación de un agente farmacológico, ello ya sea manualmente (p. ej., por Pipetear 100 μl del agente en una concentración final diez veces a la cámara de grabación que contiene 900 μl de tampón y mezclar suavemente con la pipeta) o mediante un sistema de perfusión de flujo constante.
12. Cuando la adquisición se haya terminado, cierre el obturador de la luz de excitación si es necesario. Guardar la grabación en el disco duro.
13. Salir de la configuración de grabación (es decir, tiempo de exposición, velocidad de fotogramas e intensidad de luz) sin cambios, realizar una grabación de la fluorescencia de fondo (como en el paso 2.11) sobre una región del cubreobjetos que no contiene células o sobre otro cubreobjetos que en no las células han sido sembradas.
    Nota: Si se realizan mediciones secuenciales sin cambiar la configuración de la adquisición, sólo una grabación de la fluorescencia de fondo es necesaria para todas estas mediciones.
14. Si lo desea, realizar experimentos adicionales (pasos 2.4 – 2.13) en iPSC-CMs diferentes situados en el mismo cubreobjetos. Tenga en cuenta que todos los CMs en el cubreobjetos se verán afectados en caso de que un medicamento se aplicó.

3. Análisis

> Nota: Dependiendo del proyección de imagen software utilizado (que normalmente es un paquete de software propietario suministrado por el fabricante de la cámara o la fluorescencia todo sistema de imagen), es posible realizar el análisis de las imágenes adquiridas en parte o incluso totalmente dentro de este paquete de software. Sin embargo, aquí un flujo de trabajo de análisis de imágenes que se pueden realizar con software de código abierto (es decir, la plataforma de análisis de imagen ImageJ)¹⁶, que puede instalarse convenientemente usando una distribución como Fiji¹⁷y el paquete de R para Computación estadística¹⁸ se describen. Brevemente, las regiones de interés (ROIs) que representa las células o el fondo se dibujan en ImageJ y la fluorescencia media en estos ROIs con el tiempo se exporta a un archivo, entonces, más analizar en R o, alternativamente, con el software de hoja de cálculo.

1. En el software de imágenes, guardar o exportar la serie de tiempo de imagen adquirida (la grabación que contiene las células y la correspondiente grabación de fondo) a un formato (por ejemplo, TIF) que puede ser leído por ImageJ. Como alternativa, utilice el plugin BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), que proporciona rutinas que ImageJ leer formatos de archivo propietarios de diferentes marcas de fabricantes de sistemas de proyección de imagen.
   Nota: Los pasos siguientes se asume que los intervalos de proyección de imagen son las mismas a lo largo de la grabación. Si este no es el caso, puede ser necesario exportar la información de calendario desde el software de imágenes e incluir en el análisis posterior.
2. Abra la pila TIF que contiene las células en ImageJ.
3. Utilice la herramienta Selección a mano alzada para dibujar un ROI sobre un cardiomiocito fluorescente en el canal rojo. Asegúrese de que el ROI es lo suficientemente grande como para que la célula no se mueve del retorno de la inversión y contratación.
4. Abra el plugin manager de ROI ('analizar | Herramientas | Gerente de ROI') y pulse el botón 'Agregar [t]' para agregar esta ROI como ROI1.
5. Arrastre el ROI sobre la misma célula en el canal verde y añada este ROI como ROI2.
6. En el ' analizar | Conjunto de medidas menú, deseleccionar todas las opciones excepto 'Significa valor de gris'.
   Nota: Esto se tiene que hacer sólo 1 x en una sesión de ImageJ.
7. En el administrador de ROI, pulse la ' más | Medida de multi' botón. Seleccionar las opciones 'Mida todos los sectores' y 'Una fila por slice' y pulse 'Aceptar'. Abre una ventana que contiene una hoja de cálculo con tres filas (el número de segmento y la fluorescencia media en el dos ROIs que representan la celda en rojo y en el canal verde, respectivamente).
8. Uso ' archivo | Guardar como para guardar la hoja de cálculo en un archivo de valores separados por comas (CSV).
9. Cierre la ventana con la pila de la imagen y la ventana de hoja de cálculo sin cerrar la ventana del administrador de ROI. Abra la pila TIF que contiene la medida de fondo.
10. En el administrador de ROI, pulse la ' más | Medida de multi' botón. Seleccionar las opciones 'Mida todos los sectores' y 'Una fila por slice' y pulse 'Aceptar'.
11. Uso ' archivo | Guardar como para guardar la hoja de cálculo con los datos del fondo en otro archivo CSV.
    Nota: Los siguientes cálculos se pueden hacer con el software de hoja de cálculo. Se utilizó el software de R¹⁸. Un script de ejemplo sencillo que lee los datos de la célula y el fondo de los archivos "cell.csv" y "background.csv" realiza los cálculos y trazar el curso del tiempo de la señal de potencial de membrana se proporciona como archivo de código complementario 1.
12. De la grabación de fondo, calcular la intensidad promedio en la red y en el canal verde. Reste esta señal de fondo de las señales que representan a la célula en el canal rojo y verde para calcular RFP corrección de fondo y señales de GFP, respectivamente.
13. Como un sustituto para el potencial de membrana, calcular la relación RFP/GFP.
    Nota: Esta relación es adimensional. Alternativamente, puede ser normalizado a su valor inicial (es decir, ΔR/R₀). Importante, información útil se encuentra en los cambios temporales en lugar de los valores absolutos de esta relación. Debido a la desigual fotoblanqueo de la GFP y RFP, puede ocurrir una deriva de la línea de base en esta relación. Si es necesario, tal deriva de la referencia puede corregirse mediante la construcción de una curva de referencia y restando de la RFP/GFP ratio¹⁰.

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Resultados

En la figura 4a, una sola representante iPSC-CM es representado con las líneas punteadas blancas marca el retorno de la inversión elaborado durante el análisis de imágenes en el RFP (lado izquierdo) y el canal GFP (lado derecho). La señal del canal RFP muestra un incremento periódico en intensidad fluorescente durante cada potencial de acción (Figura 4b, panel superior). Como se describe en la introducción, esto es debido...

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Discusión

El método aquí descrito permite una grabación óptica de APs de un subtipo específico (es decir, células ventriculares) de CMs generados a partir de iPSCs humana. CMs de iPSC humanas son una herramienta emergente para abordar una gran variedad de problemas médicos y biológicos, y la diferenciación a diferentes subtipos de CM es una fuente importante de variabilidad experimental. Mediante el uso de elementos específicos del promotor, la expresión de un GEVI se logra específicamente en CMs que represent...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ß-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
DMEM-F12 Medium	Invitrogen	21331046
FBS (Fetal Bovine Serum)	Invitrogen	16141079
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140050
GlutaMax-I Supplement	Invitrogen	35050061	alternative L-Glutamine
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Fibronectin bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Collagenase type II	Worthington Biochem	LS004174
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268	enhancing lentiviral infection
3.5 cm glass-bottom microdishes	MatTek corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-14-C
Microscope stand	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI6000B
Microscope objective	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil
sCMOS camera	Andor Technology, Belfast, UK	Zyla V
Microscope filter cube: excitation filter	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	ET480/40X	bandpass 480/40
Microscope filter cube: dichroic mirror	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	T505lpxr	longpass 505 nm
Image splitter	Cairn Research, Faversham, UK	OptoSplit II
Image splitter filter cube: dichroic mirror	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	568LPXR	longpass 568 nm
Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	520/28 BrightLine HC	bandpass 520/28 nm
Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	630/75 ET Bandpass	bandpass 630/75 nm
Pacing inset	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	RC-37FS