Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet ventrikuläre Kardiomyozyten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode, um optisch Bild Aktionspotentiale, insbesondere ventrikuläre erinnernden induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Kardiomyozyten. Die Methode basiert auf der Projektträger-gesteuerte Ausdruck eines Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins.

Zusammenfassung

Kardiomyozyten generiert aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-CMs) sind ein aufstrebenden Werkzeug in der Herz-Kreislauf-Forschung. Anstatt eine homogene Population von Zellen, repräsentieren die iPSC-CMs von aktuellen Differenzierung Protokolle erzeugt eine Mischung aus Zellen mit ventrikulären-, Vorhofflimmern-, und nodal-ähnlichen Phänotypen, die phänotypische Analysen erschwert. Hier ist eine Methode, um optisch Rekord Aktionspotentiale speziell von ventrikulären-wie iPSC-CMs präsentiert. Erreicht wird dies durch Lentivirale Transduktion mit einem Konstrukt, in dem ein genetisch codierte Spannungsanzeige unter der Kontrolle eines ventrikulären-spezifischen Promotor-Elements ist. Beim iPSC-CMs mit diesem Konstrukt ausgestrahlt werden, drückt sich die Spannungssensor ausschließlich in ventrikuläre-ähnlichen Zellen, Subtyp-spezifische optische Membran möglichen Aufnahmen mit Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Einleitung

Kardiomyozyten (CMs) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitet sind eine aufstrebende Werkzeug zu Molekulare Mechanismen von Herzerkrankungen, um neue Therapien zu untersuchen und zu Bildschirm für kardiale Nebenwirkungen Effekte^{1,2 sezieren ,3}. Von Anfang an wurden Arrhythmogenic Krankheiten wie channelopathien ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung Bereich⁴. Infolgedessen sind Methoden zu untersuchen, elektrische Phänotypen von CMs, wie Herzrhythmusstörungen oder Änderungen der Aktionspotential (AP) Morphologien, das Herzstück dieser Technologie.

Ein wichtiger Aspekt bei der Anwendung der iPSC-CMs ist, dass die aktuellen Protokolle der kardialen Differenzierung nicht zu einer homogenen Bevölkerung der Zellen führen. Stattdessen sind sie eher eine Mischung aus Zellen ähnlich Sinusknoten, Vorhofflimmern, und ventrikuläre CMs auf verschiedenen Ebenen der Reifung^5,6,7,8. Diese Heterogenität kann eine relevante Quelle der experimentellen Variabilität, vor allem, wenn Parameter wie AP-Dauer (APD) untersucht werden, die per se unterscheiden sich zwischen CM Subtypen (z. B.die APD ist kürzer im Vorhofflimmern als in ventrikuläre CMs). Der konventionelle Ansatz zur Lösung dieses Problems ist es, einzelne iPSC-CMs mit der Patch-Clamp-Methode zu untersuchen und um jede Zelle als Knotenpunkt zu klassifizieren-, Vorhofflimmern-, oder ventrikuläre-Like, basierend auf der AP-Morphologie-⁹. Jede nachfolgende Analyse kann dann auf die Zellen aus der CM-Untertyp von Interesse beschränkt werden. Der größte Nachteil dieser Strategie ist die begrenzten Durchsatz und Mangel an Skalierbarkeit. Darüber hinaus erlaubt die invasive Art der Patch-Clamp-Elektrophysiologie nicht die Bildgebung der gleichen Zellen nacheinander über längere Zeiträume.

Hier bieten wir experimentelle Details auf eine Methode¹⁰ entwickelt, um optisch APs Bild in bestimmte Subtypen der iPSC-CMs. Dies überwindet das Problem der Subtyp Heterogenität und dramatisch erhöht den Durchsatz im Vergleich zu herkömmlichen Methoden erlauben die schnelle Phänotypisierung von iPSC-CMs genetische Varianten oder ausgesetzt pharmakologische Agenten.

Überblick über den Subtyp-spezifische optische Bildgebung Ansatz

Ein genetisch codierte Spannungsanzeige (GEVI), deren Fluoreszenzeigenschaften Depolarisation und Repolarisation der Zellmembran zu ändern, wird verwendet, um Änderungen des Membran-Potentials CMS optisch Bild. Die hier angewandte GEVI ist das Spannung-sensing fluoreszierende Protein VSFP-CR¹¹, bestehend aus einer Spannung-sensing transmembrane Domäne verschmolzen zu einem Paar von einer grünen (Klee) und eine rote (mRuby2) fluoreszierendes Protein (Abb. 1A). Aufgrund der Nähe der zwei Fluorophore ergibt sich die Erregung des grün fluoreszierenden Proteins in einem Bruchteil der Anregungsenergie auf das rot fluoreszierende Protein über Förster Resonanz Energietransfer (FRET) übertragen werden. Daher führt die Anregung für das grün fluoreszierende Protein in einer Emission von Grün und rot fluoreszierende Proteine (Abbildung 1A, obere Leiste). Wenn die Zelle erschüttert, tritt eine strukturelle Neuordnung der Spannungssensor, die zu einer Neuausrichtung der beiden fluoreszierende Proteine, Erhöhung der FRET-Effizienz führt. Somit ist noch mehr von der Anregungsenergie vom Grün, das rot fluoreszierende Protein (Abb. 1A, untere Leiste) übertragen. Infolgedessen in einer depolarisiert Zelle grüne Fluoreszenz-Emission ist dunkler, und die rote Fluoreszenz-Emission ist heller als in einer Zelle bei ruhenden Membranpotential (Abbildung 1 b).

Abbildung 1: optische Bildgebung des Membranpotentials mit VSFP-CR. (A) A schematische Darstellung der Aktion die Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins VSFP-CR gezeigt wird. Auf die Depolarisation der Zellmembran übersetzt eine strukturelle Neuordnung in der Spannung-sensing transmembrane Domäne in eine Neuorientierung des grünen (GFP) und rot (RFP) fluoreszierendes Protein, Steigerung der Effizienz der intramolekularen Förster Resonanz Energietransfer (FRET). (B) die Emission-Spektren von VSFP auf Anregung von der GFP in Zellen an die Membran-Ruhepotential (obere Abdeckung) und depolarisiert Zellen (untere Leiste) werden dargestellt. Die spektrale Änderung nach Depolarisation ist zur Verdeutlichung übertrieben dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Veränderungen in der FRET-Effizienz spiegeln die Schwankungen des Membranpotentials sind abgebildet mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgerüstet mit einer Bild-Splitter, die roten und grünen Fluoreszenz Emissionen trennt und projiziert sie auf zwei angrenzenden Gebieten der der Chip einer Kamera sCMOS (Abbildung 2). Mit diesem Set-up kann die Fluoreszenz-Emission bei zwei verschiedenen Wellenlängen Bands gleichzeitig ermöglicht die Berechnung des Verhältnisses der rot-grünen Fluoreszenz entsprechend das Membranpotential in jedem Bild eine Zeitraffer-Serie aufgezeichnet werden.

Abbildung 2: Konfiguration des das Abbildungssystem. Die Hauptkomponenten des imaging-System verwendet, um Bild, das die spektrale Veränderungen der Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins spiegeln die Membran mögliche Veränderungen mit einer hohen zeitlichen Auflösung dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Der Ausdruck der VSFP-CR im CMs wird durch Lentivirale Transduktion erreicht. Interessenbekundung für die CM-Subtyp direkt, enthält die Lentivirus ein Promotor-Element ( MLC2v -Enhancer), das speziell Transkription in ventrikuläre wie iPSC-CMs¹⁰fährt. Wenn das iPSC-CMs, die eine Mischung von Vorhofflimmern-ähnliche, nodal-ähnliche und ventrikuläre-wie Zellen darstellen mit diesem Lentivirus ausgestrahlt werden, wird VSFP-CR nur in den linksventrikulären-ähnliche Zellen ausgedrückt. Da die optische Aktionspotential Bildgebung von fluoreszierenden Sensor abhängt, vertreten die aufgezeichneten Aktionspotentiale ausschließlich den CM-Untertyp von Interesse (Abbildung 3).

Abbildung 3: Projektträger-gesteuerte VSFP Ausdruck für potenzielle Bildgebung Subtyp-spezifischen Membran. (ein) dieses Schema zeigt, wie Cardiomyocyte Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen erreicht werden. (b) iPSC-CMs mit einem VSFP unter der Kontrolle der ventrikulären-spezifische MLC2v-Enhancer infiziert werden angezeigt. Der Ausdruck von der Spannungssensor ist nur in ventrikuläre-ähnlichen CMs in der GFP-Kanal (links) beobachtet. Die Phasenkontrast (Mitte Platte) und Overlay-Bild (Rechte Abbildung) sind ebenfalls vorhanden. Die weiße gepunktete Linien markieren Zellgrenzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protokoll

1. Vorbereitung des iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten für Imaging

Hinweis: Methoden für iPSC Kultur und kardialen Differenzierung vor^12,13,14 veröffentlicht worden und werden hier nicht ausführlich diskutiert. Die Reinigung des iPSC-CMs durch manuelle Mikrodissektion, magnetische Zellseparation oder Laktat-Auswahl wird empfohlen, je nach Differenzierung Protokoll verwendet. Für das folgende Protokoll waren Microdissected Explantaten aus schlagen Bereiche generiert anhand einer Monoschicht Differenzierung Protokoll¹³, am Tag 15 der kardialen Differenzierung und kultiviert bis 30. Tag auf Fibronektin-beschichteten Platten wie beschrieben vor¹⁰.

1. Nehmen Sie die Zelle Kultur Platten aus dem Inkubator und sammeln Sie manuell die kardiale Explantaten in Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 200 µL Pipette. Nach der Sedimentation, Aspirieren die Zellkultur überstand und vorsichtig waschen der Explantate 2 X mit Hank ist ausgewogen Salz Lösung (HBSS).
2. IPSC-CMs zu trennen, durch Zugabe von Kollagenase Typ II (430 U/mL in HBSS) und inkubieren sie bei 37 ° C für 30 Minuten.
3. Nachdem die Sedimentation der verbleibenden großzellige Horste, sammeln des Überstands, der die dissoziierten einzelne iPSC-CMs enthält und fügen Sie diese auf frisches CM Wartung Medium mit einer hohen fetalen bovine (FBS) Serumkonzentration (DMEM-F12, 20 % FBS, 2 mM L-Glutamine, 1: 100 MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin und 0,1 mM β-Mercaptoethanol).
4. Wiederholen Sie die Dissoziation, wenn großzellige Klumpen bleiben. Sammeln single iPSC-CMs durch Zentrifugation und Aufschwemmen sie in CM Medium mit einer niedrigen Konzentration des FBS (2 % FBS).
5. Neu Säen Sie einzelne iPSC-CMs in eine Dichte, so dass die nachfolgende Darstellung der Einzelzellen auf eine 3,5 cm Glasboden Zelle Kultur Microdish, die mit Fibronektin (2 µg/cm²) überzogen wurde. Die Aussaatdichte vor der Aufnahme im Hochdurchsatz-Experimente zu optimieren. In der Regel sind 5 – 10 kardiale Explantaten pro 3,5 cm Schüssel ausreichend; Allerdings hängt dies stark von modellabhängigen Größe und Reinheit.
6. Kultur der einzelnen iPSC-CMs nach ihrer Dissoziation in CM Wartung Speichermedium mit 2 % FBS für mindestens 48 h um eine ausreichende Erholung zu gewährleisten.
   Hinweis: In den nächsten Schritten werden die iPSC-CMs mit einem Lentivirus Codierung der GEVI VSFP-CR unter der Kontrolle einer MLC2v Enhancer¹⁰ um eine ventrikuläre-spezifische GEVI Ausdruck zu erreichen ausgestrahlt. Alternativ kann Lentivirale Konstrukte ermöglichen die GEVI speziell in Knoten oder Vorhofflimmern wie Zellen auszudrücken oder eine unspezifische Konstrukt beherbergen ubiquitär ausgedrückt PGK-Promotor, gebrauchte¹⁰. Lentivirale Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.
   Achtung: Beim Arbeiten mit Lentivirale Partikel sicherstellen Sie, dass die Arbeitsumgebung die angemessene Sicherheitsstufe, die Sicherheitshinweise hat für die Arbeit mit potentiell infektiösen Erregern, und einhalten der notwendigen Sicherheitsvorkehrungen.
7. Bereiten Sie die Infektion Medium durch Mischen Lentivirus¹⁰-mit Zellkultur überstand, der in HEK293 Zellen hergestellt wurde wie vor¹⁵, mit CMs Wartung Medium beschrieben (siehe Punkt 1.3) im Verhältnis 1:1.
8. Fügen Sie Hexadimethrine Bromid an eine Endkonzentration von 8 µg/mL, die Infektion-Effizienz zu erhöhen.
   Hinweis: Aufgrund der hohen Infektion ist Effizienz der iPSC-CMs vorherige Konzentration von Lentivirus durch Ultrazentrifugation normalerweise nicht notwendig.
9. Aspirieren Sie CM Wartung Medium aus dem einzigen iPSC-CMs und ersetzen Sie es mit der Infektion Medium während Schritte 1.7 und 1.8 vorbereitet. Kultur der infizierten einzelne iPSC-CMs Infektion mittelfristig für 12 h bei 37 ° C. Dann Aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es wieder mit CM Wartung Medium.
   Hinweis: Ein Fluoreszenzsignal aus dem GEVI wird 48 Stunden nach der Infektion. Eine Bildgebung der Membran möglichen Aufnahmen, 72 h nach der Infektion zum frühestmöglichen Zeitpunkt, empfiehlt sich eine richtige Signalstärke zu gewährleisten. Einzelne infizierte iPSC-CMs können für mindestens 3 Wochen kultiviert und sequenziell abgebildet werden. Wenn umfangreiche Immunofluoreszenz während einer bildgebenden Sitzung auftritt, gewinnt das Fluoreszenzsignal im Laufe der Zeit.
10. Vor Bildgebung, tauschen die Zellkulturmedium Tyrode Lösung ergänzt mit Ca^{2 +} (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM Glukose, 1,8 mM CaCl₂und 10 mM HEPES; pH 7,35).

2. optische Membran mögliche Aufnahmen

1. Ort der bildgebenden Kammer mit dem iPSC-CMs auf der Bühne von einem umgekehrten Epifluoreszenz Mikroskop ausgestattet mit einen Bild-Splitter, die entsprechenden Filter-Sets und eine Kamera (z.B. eine sCMOS Kamera) in der Lage, Hochgeschwindigkeitsaufnahmen auf hohem Empfindlichkeit.
   Hinweis: Z. B. Anwendung eine 480/40 nm Bandpass-Anregung zu Filtern in Kombination mit einem 500 nm lang-Pass dichroitischen Spiegel im Mikroskop, und 568 nm lang-Pass dichroitischen Spiegel kombiniert mit 520/28 nm und 630/75 nm Emission Bandpassfiltern in der Bild-Splitter. Für Single-Cell Imaging bietet eine hohe Vergrößerung, hoher numerischer Apertur Öl eintauchen Ziel das beste Signal-Rausch-Verhältnis.
2. Wenn elektrische Stimulation erforderlich ist, installieren Sie Tempo Elektroden in der bildgebenden Kammer und verbinden Sie diese mit einem Impuls-Generator.
   Hinweis: Wir verwendet ein Tempo eingelassen, die enthalten zwei Platinelektroden und ausgestattet in die 3,5 cm Glasboden Zelle Kultur Gerichte. Die Zellen befindet sich zwischen den Elektroden wurden abgebildet. Typische Tempo Kennwerte sind rechteckige Impulse von 5 ms Dauer, mit einer Amplitude von 10 V/cm Elektrodenabstand.
3. Optional, verwenden Sie eine beheizte Mikroskoptisch, um eine gleichbleibende Temperatur des iPSC-CMs während Bildgebung oder sogar ein Mikroskop Inkubation Kammer Aufbau zu gewährleisten, wenn langfristige Bildgebung werden soll.
4. Bringen Sie die Zellen, sich zu konzentrieren und platzieren Sie eine Zelle mit dem Ausdruck der GEVI in der Mitte des Feldes anzeigen zu.
   Hinweis: Dies geschieht am einfachsten durch Verwendung der Okulare des Mikroskops mit einem grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder ein rotes fluoreszierendes Protein (RFP) Filter setzen, um mit dem Ausdruck der GEVI Zellen zu identifizieren.
5. Den Strahlengang so eingerichtet dass abgestrahlten Lichts in den Bild-Splitter weitergeleitet wird. Wechseln Sie die Filter-Cube im Mikroskop zu derjenige, der mit den Filtern in der Bild-Splitter kombiniert werden (siehe Tabelle der Materialien).
6. In der Steuerung der Kamera-Software die Übernahme-Einstellungen so eingerichtet dass Hochgeschwindigkeitsaufnahmen (z.B. 100 Bilder pro Sekunde, bei einer Belichtungszeit von 10 ms pro Frame) möglich ist.
   Hinweis: In der Regel, dies beinhaltet das binning Kamerapixel (z.B.8 x 8 Pixel von den Kamerachip sind Makulatur um ein Pixel im Zeitraffer Film zu erzeugen).
7. Richten Sie die Bild-Splitter nach Anweisungen des Herstellers. Die beiden Bilder repräsentieren die zwei verschiedenen Emission Wellenlänge Bands sollten nebeneinander, jeweils einer Hälfte des Bildes.
   Hinweis: Dieser Schritt muss nur 1 X am Anfang jeder bildgebenden Sitzung durchgeführt.
8. Überprüfen Sie und, falls erforderlich, stellen Sie den Fokus des Bildes von der Kamera.
9. Passt die Helligkeit der Beleuchtung Licht, so dass Sättigung der Pixel vermieden wird; Dies kann am einfachsten mithilfe einer Farbpalette in der gesättigten Pixel durch eine einzigartige Farbe dargestellt sind.
   Hinweis: Bei diesen Vorbereitungen vor der Bildgebung, die Exposition der Probe, das Anregungslicht auf das notwendige Maß (d. h.nicht verlassen das Licht auf für Zeiträume längere) begrenzen, Immunofluoreszenz die GEVI zu vermeiden.
10. Richten Sie die Übernahme der Zeitreihe (z.B., 5.000 Bilder mit 100 Bildern pro Sekunde für die Dauer einer Serie von 50 s). Dimmen Sie das Licht im Raum (einschließlich Computer-Monitore) zur Vermeidung von Streulicht die Messung beeinflussen. Wenn die Erregung Lichtblende nicht durch die imaging-Software gesteuert wird, öffnen sie vor dem Starten der Übernahme.
11. Die Übernahme der Bildserie zu starten. Wenn elektrische Stimulation gewünscht wird, starten Sie die Tempo Sequenz zum geeigneten Zeitpunkt, es sei denn, sie automatisch von der Software zur Abbilderstellung eingeleitet wird. Wenn die Anwendung eines pharmakologischen Wirkstoffs gewünscht ist, tun dies entweder manuell (z. B.durch den Agenten in einer zehnfachen Ende Konzentration der Aufnahme Kammer mit 900 µL Puffer, und mischen Sie es vorsichtig mit der Pipette pipettieren 100 µL) oder mithilfe einer konstant-Flow Perfusion System.
12. Nach Abschluss die Übernahme schließen Sie der Erregung Lichtblende bei Bedarf. Speichern Sie die Aufnahme auf die Festplatte.
13. Verlassen die Aufnahmeeinstellungen (d.h., Belichtungszeit, Frame-Rate und Intensität des Lichts) unverändert, führen Sie eine Aufzeichnung der Hintergrundfluoreszenz (wie in Schritt 2.11) über einer Region das Deckglas nicht mit Zellen oder über ein anderes Deckglas auf dem nicht Zellen haben gesät.
    Hinweis: Wenn sequentielle Messungen durchgeführt werden, ohne die Übernahme-Einstellungen zu ändern, ist nur eine Aufzeichnung im Hintergrund Fluoreszenz für diese Messungen erforderlich.
14. Falls gewünscht, durchführen Sie zusätzliche Experimente (Schritte 2.4 – 2.13) auf verschiedenen iPSC-CMs befindet sich auf der gleichen Deckglas. Beachten Sie, dass alle CMs auf dem Deckglas betroffen sein werden, für den Fall, dass ein Medikament angewendet wurde.

3. Analyse

> Hinweis: Abhängig von der imaging-Software verwendet (das ist in der Regel eine proprietäre Software-Paket zur Verfügung gestellt durch den Hersteller der Kamera oder die ganze Fluoreszenz-imaging-System), es kann möglich sein, führen Sie die Analyse der erworbenen Bilder teilweise oder sogar vollständig innerhalb dieses Software-Paket. Jedoch hier ein Workflow der Bildanalyse, die mit ausgeführt werden können Open Source Software open (d. h., die Bild-Analyseplattform ImageJ)¹⁶, die bequem installiert werden kann, verwenden eine Distribution wie Fidschi¹⁷und das R-Paket für statistischen computing¹⁸ werden beschrieben. Kurz, Regionen von Interesse (ROIs), die Zellen oder Hintergrund darstellen ImageJ gezeichnet, und die mittlere Fluoreszenz in diese ROIs im Laufe der Zeit in eine Datei, dann weiter in R oder alternativ mit Tabellenkalkulations-Software analysiert werden, exportiert.

1. In der imaging-Software speichern Sie oder exportieren Sie die erfasste Bild-Zeitreihen (die Aufnahme der Zellen und die entsprechende Aufzeichnung im Hintergrund) in einem Format (z.B.TIF), die von ImageJ gelesen werden kann. Alternativ können Sie das BioFormats-Plugin (https://imagej.net/Bio-Formats), bietet Routinen ermöglicht ImageJ, verschiedene Marken von imaging Systemhersteller proprietäre Dateiformate herauszulesen.
   Hinweis: Die folgenden Schritte davon ausgehen, dass die bildgebenden Intervalle während der Aufnahme sind. Wenn dies nicht der Fall ist, ist es möglicherweise erforderlich, die Timing-Informationen aus der imaging-Software exportieren und in der weiteren Analyse aufnehmen.
2. Öffnen Sie die TIF-Stack enthält die Zellen in ImageJ.
3. Verwenden Sie das Freihand-Auswahl-Werkzeug, um einen ROI über eine fluoreszierende Cardiomyocyte im roten Kanal zeichnen. Stellen Sie sicher, dass der ROI groß genug ist, so dass die Zelle nicht aus der ROI beim Auftraggeber bewegt.
4. Öffnen Sie die ROI-Manager-Plugin ("analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager') und drücken Sie die Schaltfläche "Hinzufügen [t]" diese ROI als ROI1 hinzufügen.
5. Ziehen Sie den ROI über dieselbe Zelle in den grün-Kanal und fügen Sie diese ROI als ROI2.
6. In der "analysieren | Set Messungen Menü, deaktivieren Sie alle Optionen außer "Grauwert zu verstehen".
   Hinweis: Dies muss nur 1 X in einer ImageJ-Sitzung durchgeführt werden.
7. Drücken Sie in der ROI-Manager, der "mehr | Multi-Maßnahme " Taste. Wählen Sie die Optionen "Maßnahme alle Slices" und "Eine Zeile pro Stück" und drücken Sie "OK". Es öffnet sich ein Fenster mit einer Tabelle mit drei Zeilen (die Slice-Nummer und die mittlere Fluoreszenz in repräsentieren die Zelle in den roten Zahlen und in den grünen Kanal, jeweils zwei ROIs).
8. Verwendung "Datei | Speichern unter , die Kalkulationstabelle in eine durch Kommas getrennten Wert (CSV) Datei speichern.
9. Schließen Sie das Fenster mit dem Bild-Stack und die Tabelle ohne die ROI-Manager-Fenster zu schließen. Öffnen Sie die TIF Bildstapels mit Hintergrundmessung.
10. Drücken Sie in der ROI-Manager, der "mehr | Multi-Maßnahme' -Taste. Wählen Sie die Optionen "Maßnahme alle Slices" und "Eine Zeile pro Stück" und drücken Sie "OK".
11. Verwendung "Datei | Speichern unter , die Tabelle mit den Hintergrunddaten in eine andere CSV-Datei zu speichern.
    Hinweis: Die folgenden Berechnungen können mit Tabellenkalkulations-Software erfolgen. Wir nutzten die R Software¹⁸. Eine einfaches Beispiel-Skript, die liest die Zelle und Hintergrund Daten aus den Dateien "cell.csv" und "background.csv" führt die Berechnungen und Grundstücke den zeitlichen Verlauf der Membran mögliches Signal wird als zusätzlicher Code Datei 1bereitgestellt.
12. Berechnen Sie von der Aufzeichnung im Hintergrund die durchschnittliche Intensität in den roten und den grünen Kanal. Ziehen Sie diese Hintergrundsignal aus den Signalen aus der Zelle in den roten und grünen Kanal Hintergrund korrigiert RFP berechnen und GFP Signale bzw. ab.
13. Als Ersatz für das Membranpotential berechnen Sie das Verhältnis RFP/GFP.
    Hinweis: Dieses Verhältnis ist dimensionslos. Alternativ kann es auf seinen ursprünglichen Wert (d.h., ΔR/R₀) normalisiert werden. Wichtig ist, enthält nützlicher Informationen in die zeitlichen Veränderungen nicht in die absoluten Werte der dieses Verhältnis. Aufgrund der unebenen Immunofluoreszenz der GFP und der RFP kann eine Baseline Drift in diesem Verhältnis auftreten. Bei Bedarf kann solch eine Baseline Drift mit dem Bau einer Grundlinie Kurve und Abzug von RFP/GLP-Verhältnis¹⁰berichtigt werden.

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Ergebnisse

In Abbildung 4aist eine repräsentative einzelne iPSC-CM mit den weißen gestrichelten Linien markieren den ROI bei der bildgebenden Analyse in die RFP (linke Seite) und der GFP (Rechte Seite) Kanal gezogen dargestellt. Das Signal aus dem RFP-Kanal zeigt eine regelmäßige Erhöhung in Fluoreszenz Intensität während jedes Aktionspotential (Abbildung 4 b, obere Leiste). Wie in der Einleitung beschrieben, ist dies auf eine zunehm...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine optische Aufnahme von APs aus ein bestimmten Subtyp (z.B. ventrikuläre-wie Zellen) des CMs generiert aus menschlichen iPSCs. Menschlichen iPSC-CMs sind eine aufstrebende Werkzeug, eine Vielzahl von biologischen und medizinischen Probleme anzugehen, und die Differenzierung zu CM-Subtypen ist eine wichtige Quelle für experimentelle Variabilität. Mithilfe von spezifischen Promotor Elemente wird der Ausdruck einer GEVI speziell im CMs repräsentieren den Untertyp des...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ß-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
DMEM-F12 Medium	Invitrogen	21331046
FBS (Fetal Bovine Serum)	Invitrogen	16141079
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140050
GlutaMax-I Supplement	Invitrogen	35050061	alternative L-Glutamine
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Fibronectin bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Collagenase type II	Worthington Biochem	LS004174
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268	enhancing lentiviral infection
3.5 cm glass-bottom microdishes	MatTek corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-14-C
Microscope stand	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI6000B
Microscope objective	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil
sCMOS camera	Andor Technology, Belfast, UK	Zyla V
Microscope filter cube: excitation filter	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	ET480/40X	bandpass 480/40
Microscope filter cube: dichroic mirror	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	T505lpxr	longpass 505 nm
Image splitter	Cairn Research, Faversham, UK	OptoSplit II
Image splitter filter cube: dichroic mirror	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	568LPXR	longpass 568 nm
Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	520/28 BrightLine HC	bandpass 520/28 nm
Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	630/75 ET Bandpass	bandpass 630/75 nm
Pacing inset	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	RC-37FS