En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Resumen

Presentamos un en vivo imagen de protocolo de la corteza cerebral de ratones neonatales de la proyección de imagen de dos fotones. Este método es adecuado para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, los mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y los cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.

Resumen

Proyección de imagen de dos fotones es una poderosa herramienta para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro mamífero. Sin embargo, un número limitado de en vivo de imágenes métodos existe para examinar el tejido cerebral de los mamíferos recién nacidos vivos. Aquí se resume un protocolo de neuronas corticales individuales en vida ratones neonatales de la proyección de imagen. Este protocolo incluye las siguientes dos metodologías: (1) el sistema de Supernova para rala y brillante etiqueta de neuronas corticales en el cerebro en desarrollo y (2) un procedimiento quirúrgico para el frágil cráneo neonatal. Este protocolo permite la observación de cambios temporales de neurites corticales individuales durante las etapas neonatales con un alto cociente signal-to-noise. Silenciamiento del gen de célula-específica marcada y octavos de final también se logra combinando la Supernova con RNA de interferencia y gene CRISPR/Cas9 sistemas de edición. Este protocolo puede, por lo tanto, utilizarse para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.

Introducción

El cableado exacto de los circuitos neuronales en la corteza cerebral es esencial para funciones más altas del cerebro como percepción, cognición y aprendizaje y la memoria. Circuitos corticales se refinan dinámicamente durante el desarrollo postnatal. Estudios han investigado el proceso de usar el circuito cortical formación histológica y en vitro el análisis de la cultura. Sin embargo, la dinámica de formación de circuito en los mamíferos de vida ha permanecido en su mayoría inexplorada.

Microscopía de dos fotones ha sido ampliamente utilizado para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro de ratón adulto^1,2. Sin embargo, debido a problemas técnicos, sólo un número limitado de estudios ha abordado la formación de circuitos neuronales en ratones recién nacidos. Por ejemplo, Carrillo et al realizar la proyección de imagen de Time-lapse de escalada las fibras en el cerebelo en la segunda semana postnatal³. Portera-Cailliau et al informó la proyección de imagen de los axones corticales capa 1 en la primera semana postnatal⁴. En el presente estudio, se resume un protocolo para la observación de la capa 4 cortical neuronas y sus dendritas en ratones recién nacidos. Resultados obtenidos mediante la aplicación de este protocolo, que incluye dos metodologías, se expresan en nuestra reciente publicación⁵. En primer lugar, utilizamos la Supernova vector sistema^5,6 para el etiquetado de neuronas individuales del cerebro neonatal. En el sistema de la Supernova, las proteínas fluorescentes utilizadas para etiquetar neuronal son caída intercambiable y etiquetada gene célula-específico y análisis de la edición de octavos de final también son posibles. En segundo lugar, se describe un procedimiento quirúrgico para la preparación de ventana craneal en ratones neonatales frágil. Juntos, estas metodologías permiten la observación en vivo de neuronas individuales en el cerebro neonatal.

Protocolo

Los experimentos deben realizarse con arreglo a las directrices de bienestar de los animales prescritas por la institución del experimentador.

1. preparación de cachorros para la proyección de imagen

Nota: Cachorros con las neuronas corticales escasamente marcadas pueden obtenerse en el útero la electroporación (IUE) de Supernova vectores^5,6. El sistema de Supernova consiste en los siguientes dos vectores: TRE-Cre y CAG-loxP-parada-loxP-gen X-ires-tTA-WPRE. En este sistema, escasa de etiquetado se basa en fuga TRE. En una población escasa de neuronas transfected, TRE conduce la expresión débil de Cre y tTA. Posteriormente, sólo en estas células, la expresión del gen X, facilita una regeneración positiva de los ciclos de tTA-TRE. El logrado etiquetado rala y brillante permite la visualización de los detalles morfológicos de las neuronas individuales en vivo. Detalles de la IUE no están descritos en este protocolo ya que han sido descritos en otra parte^7,8,9,10,11.

1. Preparan ratones embarazadas programado para IUE.
2. Preparar una solución de ADN para la IUE. Escasa etiquetado con RFP, utilice una solución que contiene pK031:TRE-Cre (5 ng/μL) y pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 μg/μl) o una solución que contiene pK031:TRE-Cre (5 ng/μL) y pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 μg/μl).
   Nota: Varias proteínas se pueden expresar en las neuronas marcadas usando diferentes combinaciones de vectores. También, varios genes pueden ser derribado o golpeado-hacia fuera específicamente en las células etiquetadas^5,6 (p. ej., una serie de vectores para el sistema de Supernova están disponibles del centro de investigación RIKEN BioResource y de Addgene).
3. Realizar regular IUE^7,8,9,10,11 para etiquetar las neuronas corticales. Para el etiquetado de las neuronas de la capa 4, use embrionarios embriones día 14.
4. Espera para la entrega del cachorro y crecimiento.

2. cirugía

1. Anestesiar el postnatal día 5 (P5) cachorro utilizando gas isoflurano (1.0%). Realice una prueba de cola-pellizco para comprobar el nivel de anestesia. Si el cachorro responde a la presión, aumentar la concentración de isoflurano (hasta 2,0%) o esperar hasta que desaparezca la respuesta. Mantener la temperatura corporal del cachorro durante la cirugía usando una almohadilla térmica.
2. Inyectar por vía subcutánea un analgésico (carprofeno, 5 mg/kg).
3. Esterilizar la piel del cachorro que cubre el cráneo limpiándolo con etanol al 70% tres veces.
4. Quitar aproximadamente² de 20 mm de la piel que cubre el cráneo con unas tijeras esterilizadas con etanol al 70% (figura 1A).
5. Retire la fascia del cráneo usando pinzas esterilizadas y un hisopo de algodón limpio y estéril (figura 1A).
6. Aplique el adhesivo de tejido utilizando puntas de carga a la superficie de la piel incisas a detener el sangrado. No aplique adhesivo tisular para el área de proyección de imagen (figura 1B) porque esto dificulta la apertura del cráneo.
7. Colocar el cachorro sobre una almohadilla de calefacción (37 ° C) y deje que se recupera de la anestesia. Espere hasta que el adhesivo tisular ha secado y solidificado (aproximadamente 30 min).
8. Si es necesario, aplique más Adhesivo tisular y espere que se seque y solidifique.

3. preparación de la ventana craneal

1. Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.0-2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch.
2. Abra cuidadosamente el cráneo con una cuchilla de afeitar esterilizada dejando la duramadre intacta (1 mm de diámetro) (figura 1). Use una esponja de gelatina (cortada en trocitos, aproximadamente < 2 mm³, con unas tijeras esterilizadas y aplicarlas con pinzas) en corteza buffer¹² (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L de KCl, 10 mmol/L glucosa, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl₂ y 2 mmol/L de MgSO₄; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura) para detener el sangrado. Al abrir el cráneo, se aplica un buffer de corteza para mantener húmeda la superficie del cerebro.
3. Quite cualquier buffer y la sangre de la superficie dural con una esponja de gelatina. Se aplica a puntas de capa delgada del 1.0% uso de agarosa de bajo punto de fusión (disuelto en tampón de corteza) amarillo. Usando una máquina del bloque de calor, mantener la temperatura de la solución de agarosa a 42° C hasta la aplicación.
   Nota: El agotamiento del búfer y la sangre debe realizarse desde el lado de la craneotomía y teniendo cuidado de que la esponja de gelatina seca no entren en contacto con la duramadre. No hacerlo puede dañar la duramadre.
4. Se aplica un cubreobjetos de vidrio redondo (no. 1, 3 mm de diámetro) en la capa de gel de agarosa. Eliminar todas las burbujas entre el cubreobjetos y la capa de gel de agarosa vertiendo un exceso de gel de agarosa entre ellos. Retirar el gel sobrante que sobresale por debajo del cubreobjetos con unas pinzas (figura 1 y 1E).
5. Asegure el cubreobjetos con cemento dental (Figura 1F).
6. Mezclar el cemento en polvo y el líquido del cemento. Aplique la mezcla con puntas amarillas antes de llega a ser solidificado. No Aplique cemento dental hacia la dura, ya que esto puede dañar el cerebro.
7. Coloque un estéril titanio barra (por encargo, aproximadamente 30 mg, ver figura 1) en el hueso craneal con cemento dental. Alinee la barra de titanio y el cubreobjetos (en la superficie de la duramadre) en paralelo a capturar fácilmente imágenes.
8. Cubre el cráneo expuesto con cemento dental (figura 1 H).
9. El cachorro se recupera de la anestesia. Mantenerlo en un calentador (37 ° C) hasta que el cemento dental ha solidificado (1 h).

4. dos fotones de imagen

Nota: Las imágenes en vivo en la figura 2 se adquirieron utilizando un microscopio de dos fotones con un laser de titanio zafiro (viga de diámetro [1/e²]²: 1,2 mm).

1. Establecer la longitud de onda de láser de dos fotones. Para la excitación de la RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm² a 400 μm de profundidad).
   Nota: Se debe reducir la potencia del láser como la posición de z se mueve hacia arriba.
2. Limpie la superficie del cubreobjetos con etanol al 70%.
3. Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.5% - 2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch.
4. Fije el cachorro a la placa de titanio en la etapa de proyección de imagen usando una barra de titanio en la cabeza del cachorro (figura 2A y 2B). Ajustar la cabeza de tal manera que el cubreobjetos esté paralelo a la lente del objetivo con la etapa del goniómetro (figura 2B). Mantener la temperatura corporal del cachorro mediante una almohadilla caliente (37 ° C).
5. Establece la concentración de isoflurano en 0,7% - 1.0%.
   Nota: Una concentración de isoflurano muy alta puede causar la muerte accidental de la cría durante la proyección de imagen.
6. Coloque la etapa de proyección de imagen bajo la lente del objetivo (20 X, NA 1.0) del microscopio de dos fotones (figura 2B y 2C).
7. Aplique una gota de agua sobre el cubreobjetos. Uso de epi-fluorescencia para localizar las neuronas marcado con la proteína fluorescentes en la zona donde la duramadre se ha expuesto.
8. Adquirir imágenes z-stack μm 1.4 intervalos. Para capa 4 neurona de la proyección de imagen, fijar el ancho de z a 150-300 μm a la imagen la completa morfología dendrítica (Figura 2D y 2E). Uso lento de exploración y un promedio para obtener imágenes claras que muestran la morfología neuronal (tarda generalmente > 20 minutos para adquirir la completa morfología dendrítica).
   Nota: Se recomiendan los siguientes parámetros para la proyección de imagen. Longitud de onda de excitación: 1.000 nm, escáner: tipo galvanómetro, espejo dicroico: 690 nm, filtro de emisión: 575-620 nm bandpass, detector: tipo de GaAsP, ganancia ajuste > 100, imagen tamaño > 512 x 512 μm, campo de visión > 600 x 600 μm, pixel Resolución < 1.2 μm.

5. recuperación y enfermería

1. Separar el cachorro de la etapa de proyección de imagen.
2. Colocar el cachorro sobre un calentador (37 ° C) y permita que recuperar (15 min).
3. El cachorro la alimentación leche caliente con una micropipeta en intervalos de 2 horas y estimular suavemente el estómago para permitir la excreción. Confirmar que el cachorro es beber leche por la medición de su peso corporal.

6. volver a la proyección de imagen

1. Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.5-2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch. Conéctelo a la etapa de proyección de imagen.
2. Localizar las neuronas anteriormente reflejadas y adquirir una imagen z-stack. La identificación de las neuronas es fácil debido a su escasa etiquetado con Supernova.
3. Repita los pasos 5.1 6.2 hasta que finalice la proyección de imagen. Nota: El cachorro puede ser reflejado hasta 18 h sin perder peso.
   

Resultados

Figuras 2D - 2F mostrar resultados representativos de la imagen de Time-lapse de dos fotones de neuronas corticales de la capa 4 mediante el presente Protocolo. Con el fin de análisis, seleccione las neuronas dendríticas clara morfología a lo largo de los periodos de proyección de imagen. Hemos analizado la morfología dendrítica de neuronas reflejadas utilizando el software de análisis morfológico. Reconstrucción de la morfología dendrítica rep...

Discusión

Pasos críticos en el protocolo y resolución de problemas:

El paso más crítico del protocolo es la extirpación del cráneo (paso 3.2 del Protocolo). Sobre inserción, la hoja de afeitar a menudo se adhiere a la duramadre, provocando hemorragia dural y daño en el cerebro. Esto puede evitarse añadiendo una gota de tampón de corteza en el cráneo y el cráneo en tampón de corteza.

Sangrado de la duramadre y la piel después de preparación de ventana craneal condu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pK031. TRE-Cre	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from authors
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)	Univentor	8323101
Vetbond (tissue adhesive)	3M	084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)	Sorenson	13810
Gelfoam (gelatin sponge)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Low melting point
Round-shaped coverslip	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (dental cement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-photon microscope	Zeiss	LSM7MP
Titanium-sapphire laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanium plate	Authors	-	Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M