JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.

Özet

İki fotonlu görüntüleme memeli beyinde nöronal devreler vivo çözümlenmesi için güçlü bir araçtır. Ancak, vivo içinde görüntüleme yöntemleri sınırlı sayıda canlı yeni doğan memeliler beyin dokusunun incelenmesi için bulunmaktadır. Burada yaşayan yenidoğan farelerde bireysel kortikal nöronlar görüntüleme için bir protokol özetler. Bu iletişim kuralı aşağıdaki iki yöntemleri içerir: (1 süpernova sistemi gelişmekte olan beyin ve kırılgan yenidoğan kafatası için (2) bir cerrahi işlem kortikal nöronların seyrek ve parlak etiketleme için. Bu iletişim kuralı bireysel kortikal neurites zamansal değişiklikleri gözlem yüksek sinyal gürültü oranı ile yenidoğan aşamaları sırasında sağlar. Etiketli hücre özel gen susturmak ve nakavt Ayrıca süpernova RNA müdahale ve CRISPR/Cas9 gen sistemleri düzenleme ile birleştirerek elde edilebilir. Bu iletişim kuralı böylece, kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir.

Giriş

Serebral korteks nöronal devreler kesin kablolama algı, biliş ve öğrenme ve bellek de dahil olmak üzere daha yüksek beyin fonksiyonları için önemlidir. Kortikal devreleri postnatal geliştirme sırasında dinamik olarak rafine. Çalışmalar histolojik kortikal devre oluşumu kullanarak işlemi ve vitro kültür analizleri araştırdı. Ancak, yaşayan memelilerde devre formasyonu dinamiği çoğunlukla keşfedilmemiş kalmıştır.

İki fotonlu mikroskobu yaygın yetişkin fare beyin1,2nöronal devreler vivo içinde analizleri için kullanılmıştır. Ancak, teknik sorunlar nedeniyle sınırlı sayıda çalışmalar nöronal devre oluşumu yeni doğan farelerde ele sahip. Örneğin, Carrillo vd. beyincik ikinci Doğum sonrası hafta3lifler tırmanma zaman hata görüntüleme yapılır. Portera-Cailliau vd. , akson kortikal katmanına 1 ilk Doğum sonrası hafta4görüntüleme bildirdi. Bu da çalışmanın, katman 4 kortikal nöronlar ve onların dendrites yenidoğan farelerde gözlem için bir protokol özetler. İki yöntemleri içerir, bu iletişim kuralını uygulayarak elde edilen sonuçlar bizim son yayın5' te rapor edilir. Öncelikle, süpernova vektör sistemi5,6 bireysel yenidoğan beyin nöronlarda etiketleme için kullanın. Süpernova sisteminde nöronal etiketleme için kullanılan floresan proteinler değiştirilebilir ve etiketli hücre özel gen nakavt ve düzenleme/nakavt analizleri da mümkündür. İkinci olarak, kırılgan yenidoğan farelerde beyin pencere hazırlanması için bir cerrahi işlem açıklanmaktadır. Birlikte, bu metodolojileri yenidoğan beynindeki bireysel nöronların vivo içinde gözlem izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Deneyler deneyci'nın kurum tarafından reçete hayvan refahı yönergelere uygun olarak yapılmalıdır.

1. hazırlanması Pups görüntüleme için

Not: Pups seyrek etiketli kortikal nöronlar ile süpernova vektörel çizimler5,6/ rahim içinde Elektroporasyon (orijinal) tarafından elde edilebilir. Süpernova sistemi aşağıdaki iki vektörlerinin oluşur: TRE-Cre ve CAG-loxP-STOP-loxP-Gen X-IRES-tTA-WPRE. Bu sistemde, seyrek etiketleme TRE sızıntı üzerinde dayanır. Transfected nöronlar seyrek bir nüfus TRE Cre ve tTA zayıf ifade ediyor. Daha sonra yalnızca bu hücreler, tTA-TRE döngüleri bir olumlu geribildirim tarafından ifade Gen X kolaylaştırılmıştır. Elde etiketleme seyrek ve parlak bireysel nöronlar içinde vivomorfolojik ayrıntılarını görselleştirme sağlar. EKOSEM yordamı ayrıntılarını değil içinde açıklanmıştır onlar beri bu iletişim kuralı, başka bir7,8,9,10,11bölümünde.

  1. Zaman aşımına uğradı-hamile fareler EKOSEM için hazırlayın.
  2. Bir DNA çözüm EKOSEM için hazırlayın. Seyrek RFP ile etiketleme için pK031:TRE içeren bir çözüm kullanın-Cre (5 ng/µL) ve pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) veya pK031:TRE içeren bir çözüm-Cre (5 ng/µL) ve pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
    Not: Çeşitli proteinlerin vektörel çizimler farklı kombinasyonları kullanarak etiketli nöronlarda ifade edilebilir. Ayrıca, çeşitli genler olabilir çaldı aşağı veya özel olarak etiketli hücreleri5,6 ' çaldı-out (Örneğin, vektörel çizimler süpernova sistemi için bir dizi mevcuttur RIKEN BioResource araştırma merkezi ve Addgene).
  3. Kortikal nöronlar etiketlemek için düzenli EKOSEM7,8,9,10,11 gerçekleştirin. Tabakası etiketleme için 4 nöronlar, embriyonik gün-14 embriyo kullanın.
  4. Yavru teslimi ve büyüme için bekleyin.

2. cerrahi

  1. Doğum sonrası gün-5 (P5) yavru İsoflurane gaz (% 1.0) kullanarak anestezi. Anestezi düzeyini denetlemek için bir kuyruk-çimdik testi gerçekleştirin. Yavru fok için çimdik yanıt verirse, isoflurane konsantrasyonu artırmak (%2.0) veya Yanıt kaybolana kadar bekleyin. Isıtma yastığını kullanarak ameliyat sırasında pups vücut ısısını korumak.
  2. Subkutan bir analjezik (carprofen, 5 mg/kg) enjekte et.
  3. Üç kez % 70 etanol ile silerek kafatası kapsayan pups cilt sterilize.
  4. Yaklaşık 20 mm2 / %70 etanol (Şekil 1A) ile sterilize makas kullanarak kafatası kapsayan cilt kaldırın.
  5. Steril forseps ve temiz, steril pamuklu çubukla (Şekil 1A) kullanarak kafatası fasya kaldırın.
  6. Kanamayı durdurmak için yükleme ipuçları kazıma Cilt yüzeyine kullanarak doku yapıştırıcı uygulamak. Bu kafatası açılış daha zor hale getirir çünkü doku yapıştırıcı görüntüleme alanını (Şekil 1B) geçerli değildir.
  7. Yavru bir ısıtma yastığı (37 ° C) yerleştirin ve anesteziden kurtarmak sağlar. Doku yapıştırıcı kurutulmuş ve (yaklaşık 30 dakika) katılaşmış kadar bekleyin.
  8. Gerekirse, daha fazla doku yapıştırıcı uygulamak ve kuru ve kuvvetlendirmek bekleyin.

3. kraniyal pencere hazırlık

  1. İsoflurane (% 1.0-%2.0) kullanarak yavru anestezi ve anestezi seviyesini bir kuyruk-çimdik testi ile kontrol edin.
  2. Dikkatle dura sağlam (1 mm çapında) bırakarak steril bir tıraş bıçağı ile kafatası açın (Şekil 1 c). Jelatin sünger kullanın (steril makas kullanarak yaklaşık < 2 mm3, küçük parçalar halinde kesilmiş ve uygulamanızı Cımbız kullanarak) korteks arabellek12 ' (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glikoz, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 batırılmış ve 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; Oda sıcaklığında) kanamayı durdurmak için. Kafatası açarken, beyin yüzey nemli tutmak için bir korteks arabellek geçerli.
  3. Dural yüzeyindeki bir Jelatin sünger kullanarak herhangi bir arabellek ve kan çıkarmak. İnce tabaka sarı %1.0 (korteks arabellekte çözünmüş) düşük erime noktası özel kullanmanın ipuçları geçerlidir. Bir ısı blok makine kullanarak, özel çözüm 42 ° c sıcaklık uygulama kadar sürdürmek.
    Not: Kan ve arabellek boşaltma kuru Jelatin sünger ile temas dura gelmez dikkat çekici iken kranyotomi tarafındaki gerçekleştirilmelidir. Aksi halde beyin zarı zarar verebilir.
  4. Yuvarlak cam coverslip (No. 1, 3 mm çapında) özel jel tabaka uygulayın. Coverslip ve özel jel katman arasındaki tüm kabarcıklar özel jel aralarında aşırı dökerek kaldırın. Cımbız (Şekil 1 d ve 1E) kullanarak coverslip altından çıkıntılı aşırı jel kaldırın.
  5. Coverslip diş çimento (Şekil 1F) kullanarak güvenli.
  6. Mix çimento tozu ve çimentosu sıvısı. Katılaşmış olur önce sarı ipuçları kullanarak karışımı uygulamak. Bu beyin zarar verebilir çünkü dura üzerine diş çimento geçerli değildir.
  7. Steril bir titanyum eklemek diş çimento kullanarak kafatası kemik üzerinde bar (özel yapım, Şekil 1Gbkz: yaklaşık 30 mg). Titanyum bar ve coverslip (dura yüzeyinde) kolayca esir alma imge paralel olarak hizalayın.
  8. Diş çimento (Şekil 1 H) ile maruz kafatası kapağı.
  9. Yavru fok anesteziden kurtarmak. Diş çimento (1 h) katılaşmış kadar bir ısıtıcı (37 ° C) tutmak.

4. iki fotonlu görüntüleme

Not: Resim 2 vivo içinde Albümdeki iki fotonlu mikroskop kullanarak bir titanyum-Safir lazer ile satın alınan (çapı [1/e2]2ışınla: 1,2 mm).

  1. İki fotonlu lazer dalga boyu ayarlayın. RFP uyarma, kullanım 1.000 nm (450 mW/mm2 ' de derinlik 400 µm) için.
    Not: z-pozisyon ilerlerken lazer güç azaltılmalıdır.
  2. Coverslip % 70 etanol ile yüzeyi silin.
  3. İsoflurane (% 1.5-%2.0) kullanarak yavru anestezi ve kuyruk-çimdik testi kullanılarak anestezi seviyesini kontrol edin.
  4. Yavru fok titanyum çubuk pups kafasına (Şekil 2A ve 2B) kullanarak görüntüleme sahnede Titanyum plaka ekleyin. Öyle ki coverslip Gonyometre sahne alanı'nda (Şekil 2B) kullanarak objektif lens paralel baş ayarlayın. Bir ısıtma yastığı (37 ° C) kullanarak yavru vücut ısısını korumak.
  5. İsoflurane konsantrasyonu % 0.7 - %1.0 ayarlayın.
    Not: Bir çok yüksek isoflurane konsantrasyon yavru fok kaza sonucu ölüm görüntüleme sırasında neden olabilir.
  6. Görüntüleme sahnenin altında iki fotonlu mikroskop (Şekil 2B ve 2 C) objektif lens (20 X, NA 1.0) yerleştirin.
  7. Bir damla su coverslip üzerine uygulayın. Epi-floresan floresan protein etiketli nöronlar içinde belgili tanımlık alan nereye dura maruz bulmak için kullanın.
  8. Z-yığın görüntüleri 1.4-µm aralıklarla elde etmek. Katmanı için 4 nöron görüntüleme-tüm dendritik morfolojisi (Şekil 2B ve 2E) görüntü için 150-300 µm z genişliğini ayarlayın. Kullanım yavaş tarama ve nöronal morfoloji gösterilen net görüntüler elde etmek için Ortalama (genellikle tüm dendritik morfoloji elde etmek için 20 > dk sürer).
    Not: Aşağıdaki parametreleri görüntüleme için tavsiye edilir. Uyarma dalga boyu: 1.000 nm, tarayıcı: galvanometre türü, Dikroik ayna: 690 nm, emisyon filtresi: 575-620 nm bant, dedektör: GaAsP türü ayarı > 100 kazanç, görüntü boyutu > 512 x 512 µm, görüş alanı > 600 x 600 µm, piksel çözünürlük < 1.2 µm.

5. kurtarma ve hemşirelik

  1. Yavru görüntüleme sahne alanı'ndan bağlantısını kesin.
  2. Yavru bir ısıtıcı (37 ° C) yerleştirin ve (15 dk) kurtarmak sağlar.
  3. Yavru bir micropipette 2-h aralıklarla kullanarak ılık süt yem ve yavaşça mide boşaltım izin için teşvik. Yavru fok, vücut ağırlığının ölçerek süt içiyor onaylayın.

6. yeniden görüntüleme

  1. Pup ile isoflurane (% 1.5-%2.0), anestezi ve kuyruk-çimdik testi kullanılarak anestezi seviyesini kontrol edin. Görüntüleme sahne alanı'na ekleyin.
  2. Daha önce görüntülü nöronlar bulun ve bir z-yığın görüntü elde etmek. Nöronlar kimlik onların seyrek süpernova ile etiketleme sayesinde kolay değildir.
  3. Görüntüleme tamamlandı 5.1 6.2 tamamlayana dek. Not: Ağırlık kaybı olmadan 18 s kadar yavru fok görüntüsü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Rakamlar 2D - 2F iki fotonlu hızlandırılmış görüntüleme mevcut protokolü kullanılarak katman 4 kortikal nöronların temsilcisi sonuçları göster. Çözümleme amacıyla nöronlar görüntüleme dönemleri boyunca açık dendritik morfolojisi ile seçin. Dendritik morfolojisi görüntülü nöronların morfolojik analiz yazılımı kullanarak analiz ettik. Temsilcisi dendritik morfoloji yeniden Şekil 2Fiçinde g?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İletişim kuralı kritik adımlar ve sorun giderme:

En kritik Protokolü'nün (iletişim kuralı adım 3.2) kafatası kaldırılması adımdır. Ekleme jilet kez dural kanama ve beynin zarar görmesi neden dura yapışır. Bu kafatasında bir damla korteks arabelleği ekleyerek ve kafatası korteks arabellekte kaldırarak önlenebilir.

Kafatası pencere hazırlık için pencerenin tıkanıklığı açar sonra dura ve cilt kanama. Bu doku önlemek için kullanılan ya ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar T. Sato, M. Kanbayashi ve S. Kouyama kendi teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser ve JSP'ler KAKENHI Grant numaraları JP15K14322 ve JP16H06143, Takeda Bilim Vakfı, Uehara Anıtı Vakfı ve işbirlikçi araştırma projesi, Niigata Üniversitesi beyin Araştırma Enstitüsü 2017-2923 (H.M.) tarafından desteklenmiştir KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 ve JP15H04263 ve Grant-in yenilik alanları "Dinamik düzenleme beyin fonksiyonu tarafından hurda & yapı sistemi," bilimsel araştırma (JP16H06459) üzerinden MEXT (TI).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
pK031. TRE-CreAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from authors
IsofluraneWako099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)Univentor8323101
Vetbond (tissue adhesive)3M084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)Sorenson13810
Gelfoam (gelatin sponge)Pfizer09-0353-01
AgaroseSigmaA9793Low melting point
Round-shaped coverslipMatsunami-Custom made
Unifast 2 (dental cement)GC-
Titanium barAuthors-Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)Zoetis-Injectable
2-photon microscopeZeissLSM7MP
Titanium-sapphire laserSpertra-PhysicsMai-Tai eHPDS
Titanium plateAuthors-Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementProBITPLANE
Goniometer stageThorlabsGN2/M

Referanslar

  1. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
  2. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
  3. Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272(2005).
  5. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  6. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747(2016).
  7. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
  8. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
  11. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  16. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  17. Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
  18. Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
  19. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839(2017).
  20. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 140yeni do aniki fotonlu vivo i inde g r nt lemetek h creli etiketlemeserebral korteksfare

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır