Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Resumo

Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Resumo

Imagem de dois fotões é uma poderosa ferramenta de análise de circuitos neuronais do cérebro de mamíferos na vivo . No entanto, um número limitado de no vivo de imagem métodos existe para examinar o tecido do cérebro de mamíferos recém-nascidos ao vivo. Aqui resumimos um protocolo para imagens individuais neurônios corticais em camundongos neonatais vivos. Este protocolo inclui as seguintes duas metodologias: (1) o sistema de Supernova para esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios corticais no cérebro em desenvolvimento e (2) um procedimento cirúrgico para o crânio neonatal frágil. Este protocolo permite a observação de mudanças temporais de neuritos corticais individuais durante estágios neonatais com uma alta relação sinal-ruído. Silenciamento de genes de células específicas rotuladas e nocaute também podem ser alcançados pela combinação da Supernova com interferência do RNA e gene CRISPR/Cas9 sistemas de edição. Este protocolo pode, assim, ser utilizado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Introdução

A fiação precisa de circuitos neuronais no córtex cerebral é essencial para funções superiores do cérebro incluindo a percepção, cognição e aprendizagem e memória. Circuitos corticais são dinamicamente refinados durante o desenvolvimento pós-natal. Estudos têm investigado o processo de formação de circuito cortical usando histológico e em vitro análises de cultura. No entanto, a dinâmica da formação do circuito em mamíferos viventes manteve-se na maior parte inexplorada.

Microscopia de dois fotões tem sido amplamente utilizada para as análises em vivo dos circuitos neuronais no cérebro do rato adulto^1,2. No entanto, devido a desafios técnicos, somente um número limitado de estudos abordaram a formação do circuito neuronal em ratos recém-nascidos. Por exemplo, Carrillo et al realizaram a lapso de tempo imagem de fibras no cerebelo na segunda semana pós-parto³de escalada. Porteira-Cailliau et al relataram a imagem dos axônios na camada cortical 1 na primeira semana pós-natal⁴. No presente estudo, resumimos um protocolo para a observação de neurônios corticais de camada 4 e suas dendrites em camundongos recém-nascidos. Os resultados obtidos através da aplicação do presente protocolo, que inclui duas metodologias, são relatados em nossa recente publicação⁵. Primeiro, usamos a Supernova vetor sistema^5,6 para rotular os neurônios individuais no cérebro neonatal. No sistema de Supernova, as proteínas fluorescentes usadas para rotular neuronal são knockdown exchangeable e etiquetados célula específica do gene e edição/nocaute análises também são possíveis. Em segundo lugar, descrevemos um procedimento cirúrgico para a preparação de janela cranial em camundongos neonatais frágil. Juntas, essas metodologias permitem a observação na vivo de neurônios individuais no cérebro neonatal.

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Protocolo

Experimentos devem ser realizados de acordo com as normas de bem-estar animal prescritas pela instituição do experimentador.

1. preparação dos filhotes para a imagem latente

Nota: Filhotes com escassamente rotulados neurônios corticais podem ser obtidos por no utero eletroporação (IUE) de Supernova vetores^5,6. O sistema de Supernova consiste dos seguintes dois vetores: TRE-Cre e CAG-loxP-STOP-loxP-Gene X-ires-tTA-WPRE. Neste sistema, rotulagem esparsas depende de escapamento do TRE. Em uma população dispersa de neurônios transfectadas, TRE dirige a fraca expressão da Cre e tTA. Posteriormente, apenas nestas células, a expressão do gene X é facilitada por um feedback positivo dos ciclos de tTA-TRE. O alcançado esparsas e brilhantes rotulagem permite a visualização de detalhes morfológicos de neurônios individuais em vivo. Detalhes do procedimento de IUE não são descritos no presente protocolo, desde que eles foram descritos em outro lugar^7,8,9,10,11.

1. Prepare-se ratos grávidas cronometrado para IUE.
2. Prepare uma solução de DNA para IUE. Para a rotulagem esparsas com RFP, use uma solução contendo pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l) ou uma solução contendo pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l).
   Nota: Várias proteínas podem ser expressos nos neurônios etiquetados usando diferentes combinações de vetores. Além disso, vários genes podem ser batido para baixo ou eliminado especificamente em pilhas etiquetadas^5,6 (por exemplo, uma série de vetores para o sistema de Supernova estão disponíveis de RIKEN BioResource Research Center e de Addgene).
3. Execute regular IUE^7,8,9,10,11 para rotular os neurônios corticais. Para a rotulagem de neurônios da camada 4, use embriões embrionários do dia-14.
4. Espere para o crescimento e a entrega do filhote.

2. cirurgia

1. Anestesia o pós-Natal dia-5 (P5) filhote usando gás de isoflurano (1,0%). Execute um teste de cauda-pitada para verificar o nível de anestesia. Se o filhote responde para o aperto, aumentar a concentração de isoflurano (até 2,0%) ou esperar até que a resposta desaparece. Manter a temperatura do corpo do filhote durante a cirurgia, usando uma almofada de aquecimento.
2. Por via subcutânea injete um analgésico (carprofeno, 5 mg/kg).
3. Esterilize a pele do filhote cobrindo o crânio por limpá-lo com etanol a 70% três vezes.
4. Remova aproximadamente 20 mm² da pele cobrindo o crânio com uma tesoura esterilizada com 70% de etanol (figura 1A).
5. Retire a fáscia do crânio usando Pinças esterilizadas e um cotonete de algodão limpas e esterilizadas (figura 1A).
6. Aplique o adesivo de tecido usando dicas de carregamento à superfície da pele incisão para parar o sangramento. Não aplique adesivo de tecido para a área de imagem (figura 1B) porque isso dificulta a abertura do crânio.
7. Coloque o filhote em uma bolsa de água quente (37 ° C) e deixe-o recuperar da anestesia. Espere até que o adesivo de tecido tem secado e solidificado (cerca de 30 min).
8. Se necessário, aplique mais tecido adesivo e esperar que seque e solidificar.

3. craniana janela preparação

1. Anestesiar o filhote usando isoflurano (1,0% - 2,0%) e verificar o nível de anestesia por um teste de cauda-pitada.
2. Abra cuidadosamente o crânio com uma lâmina de barbear esterilizada, deixando a dura-máter intacta (1 mm de diâmetro) (Figura 1). Use uma esponja de gelatina (cortadas em pedaços pequenos, aproximadamente 2mm <³, usando a tesoura esterilizada e aplicá-las usando uma pinça) embebido no córtex reserva¹² (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L KCl, glicose 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl₂ e 2 mmol/L de MgSO₄; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) para parar o sangramento. Ao abrir o crânio, aplica um buffer de córtex para manter a superfície do cérebro húmido.
3. Remova qualquer buffer e o sangue da superfície dural usando uma esponja gelatinosa. Aplica dicas uma fina camada de 1,0% de agarose de baixo ponto de fusão (dissolvido em tampão de córtex) usando amarelo. Usando uma máquina de bloco de calor, manter a temperatura da solução de agarose a 42° C até o aplicativo.
   Nota: A drenagem do buffer e o sangue deve ser realizada do lado da craniotomia enquanto cuida que a esponja de gelatina seca não entra em contacto com a dura-máter. A não observância pode causar danos a dura-máter.
4. Aplique uma lamela de vidro redonda (n º 1, 3mm de diâmetro) na camada de gel de agarose. Remova todas as bolhas entre a lamínula e a camada de gel de agarose derramando o excesso de gel de agarose entre eles. Remova o excesso de gel salientes debaixo da lamela usando uma pinça (Figura 1 e 1E).
5. Fixe a lamela usando cimento dental (Figura 1F).
6. Misture o pó de cimento e o líquido do cimento. Aplique a mistura usando pontas amarelas antes que torna-se solidificado. Não aplique cimento dental sobre a dura-máter, porque isso pode danificar o cérebro.
7. Anexar um estéril titânio bar (feito, cerca de 30 mg, ver Figura 1) no osso craniano usando cimento dental. Alinhe a barra de titânio e a lamela (na superfície da dura-máter) em paralelo para facilmente capturar imagens.
8. Cobrir o crânio exposto com cimento dental (Figura 1 H).
9. Recupere o filhote de anestesia. Mantê-lo em um aquecedor (37 ° C) até que o cimento dental tem solidificado (1h).

4. dois fotões de imagem

Nota: As imagens na vivo na Figura 2 foram adquiridas usando um microscópio de dois fotões com um laser de titânio-safira (feixe de diâmetro [1/e²]²: 1,2 mm).

1. Defina o comprimento de onda do laser de dois fotões. Para a excitação de RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm² a 400 µ m de profundidade).
   Nota: A potência do laser deve ser reduzida, como o z-posição move para cima.
2. Limpe a superfície da lamela com etanol a 70%.
3. Anestesiar o filhote usando isoflurano (1.5-2.0%) e verificar o nível de anestesia utilizando um teste de cauda-pitada.
4. Anexe o filhote para a placa de titânio no palco de imagens usando uma barra de titânio na cabeça do pup (Figura 2A e 2B). Ajuste a cabeça de tal que a lamela é paralela da lente objetiva usando fase goniômetro (Figura 2B). Manter a temperatura corporal do filhote usando uma almofada de aquecimento (37 ° C).
5. Defina a concentração de isoflurano para 0,7% - 1,0%.
   Nota: Uma concentração de isoflurano muito alta pode causar a morte acidental do filhote durante a imagem latente.
6. Coloque o palco de imagens sob a lente objetiva (20 X, at 1.0), o microscópio de dois fotões (Figura 2B e 2C).
7. Aplique uma gota de água no sentido da lamela. Use o epi-fluorescência para localizar os neurônios rotulado de proteína fluorescentes na área onde foi exposta a dura-máter.
8. Adquira imagens de z-pilha em intervalos de 1,4 µm. Para a camada 4 neurônio de imagem, definir o z-width para 150-300 µm a imagem inteira morfologia dendrítica (Figura 2D e 2E). Uso lento digitalização e em média para obter imagens nítidas, mostrando a morfologia neuronal (geralmente leva > 20 min para adquirir a morfologia dendrítica inteira).
   Nota: Os parâmetros a seguir são recomendados para tratamento de imagens. Comprimento de onda de excitação: 1.000 nm, scanner: tipo galvanômetro, espelho dicroico: 690 nm, emissão filtro: 575-620 nm bandpass, detector: tipo GaAsP, ganho 100 > configuração, imagem tamanho > 512 x 512 µm, campo de visão > 600 x 600 µm, pixel resolução < 1.2 µm.

5. recuperação e enfermagem

1. Desanexe o filhote desde a fase de imagem.
2. Coloque o filhote em um aquecedor (37 ° C) e deixe-o recuperar (15 min).
3. Alimente o filhote leite morno usando uma micropipeta em intervalos de 2-h e estimular suavemente o estômago para permitir a excreção. Confirme que o filhote está a beber leite, medindo o peso do seu corpo.

6. re-imaging

1. Anestesiar o filhote com isoflurano (1.5-2.0%) e verificar o nível de anestesia utilizando um teste de cauda-pitada. Anexá-lo à fase de imagem.
2. Localize os imagens anteriormente neurônios e adquirir uma imagem de z-pilha. A identificação de neurônios é fácil devido à sua rotulagem esparsas com Supernova.
3. Repita as etapas de 5,1-6,2 até imagem é concluída. Nota: O filhote pode ser fotografado até 18 h sem perder peso.
   

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Resultados

Figuras 2D - 2F mostrar resultados representativos da imagem latente de lapso de tempo de dois fotões de neurônios corticais de camada 4 usando o presente protocolo. Para efeitos de análise, selecione os neurônios com morfologia dendrítica claro durante os períodos de imagem. Analisamos a morfologia dendrítica de neurônios imagens usando software de análise morfológica. Reconstrução de morfologia dendrítica representativa é mostrada na

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Discussão

Passos críticos no protocolo e solução de problemas:

O passo mais importante do protocolo é a remoção do crânio (passo 3.2 do protocolo). Mediante a inserção, a lâmina de barbear frequentemente adere a dura-máter, causando sangramento dural e danos ao cérebro. Isto pode ser evitado adicionando uma gota de buffer de córtex no crânio e removendo o crânio no buffer do córtex.

Sangramento da dura e a pele após preparação janela cranial leva a oclusão da...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pK031. TRE-Cre	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from authors
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)	Univentor	8323101
Vetbond (tissue adhesive)	3M	084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)	Sorenson	13810
Gelfoam (gelatin sponge)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Low melting point
Round-shaped coverslip	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (dental cement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-photon microscope	Zeiss	LSM7MP
Titanium-sapphire laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanium plate	Authors	-	Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M