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要約

体内の 2 光子イメージング新生児マウスの大脳皮質をイメージングするためのプロトコルを提案します。このメソッドは、皮質ニューロン、神経ダイナミクスと疾患モデルのダイナミクスの変化を制御する分子メカニズムの発達のダイナミクスの分析に適しています。

要約

2 光子イメージングは、哺乳類の脳の神経回路網の生体内解析のための強力なツールです。ただし、ライブの新生児の哺乳類の脳組織を調べるため生体内イメージング方法の限られた数が存在します。ここ生きている新生児マウスで個々 の皮質ニューロンをイメージングするためのプロトコルをまとめたものです。このプロトコルには、次の 2 つの方法が含まれています: (1) 疎と明るい脳の発達と (2) 壊れやすい新生児頭蓋手術で大脳皮質ニューロンの分類のための超新星システム。このプロトコルは、高い信号対雑音比と新生児の段階で個々 の皮質神経突起の経年変化の観察をできます。ラベル付きセル固有遺伝子サイレンシングとノックアウトは、RNA 干渉と編集システム CRISPR/Cas9 遺伝子と超新星を組み合わせることで実現できます。皮質ニューロン、神経ダイナミクスと疾患モデルのダイナミクスの変化を制御する分子メカニズムの発達のダイナミクスを分析するため、このプロトコルを使用したがって、ことができます。

概要

大脳皮質の神経回路網の正確な配線は、知覚、認知、学習、記憶など、脳の高次機能に不可欠です。生後発達期大脳皮質回路が動的に洗練されました。研究は、組織による皮質回路形成のプロセスと文化の in vitro解析を検討しました。しかし、生きている哺乳類の回路形成のダイナミクスが未踏主が残った。

2 光子顕微鏡は、成体マウス脳1,2の神経回路網の体内の分析に広く使用されています。ただし、技術的な課題により研究の限られた数だけは新生仔マウスにおける神経回路形成を対処しています。たとえば、carrillo さんらは、登上線維第 2 生後週3で小脳のタイムラプス イメージングを実行されます。・ ポルテラ Cailliauらは、最初の生後週4の皮質層 1 の軸索のイメージングを報告しました。本研究では大脳皮質ニューロンの層 4 と新生マウスの樹状突起の観察のためのプロトコルをまとめたものです。2 つの方法が含まれています、このプロトコルを適用した結果は、私たちの最近の文書5で報告されます。まず、新生児の脳の個々 のニューロンを分類のため超新星ベクトル システム5,6を使用します。超新星における神経ラベルに使われる蛍光タンパク質が交換とラベル付きセル固有遺伝子ノックダウンと編集/ノックアウト解析も可能です。第二に、我々 は壊れやすい新生児マウス頭蓋ウィンドウ準備のため手術をについて説明します。一緒に、これらの方法論は、新生児脳で個々 のニューロンの生体内観察を許可します。

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プロトコル

実験は、実験者の機関が定める動物福祉指針に従って行わなければなりません。

1. 子犬のイメージングのための準備

注: まばらラベル皮質ニューロンと子犬は子宮に電気穿孔法 (IUE) による超新星ベクトル5,6の取得できます。次の 2 つのベクトルから成っている超新星システム: トレ Cre と CAG-loxP-停止-loxP-遺伝子 X-ires-ったー-WPRE。このシステムでスパース ラベリング トレ漏れに依存しています。Transfected ニューロンのまばらな人口、TRE は Cre と tTA の弱い表現を駆動します。その後、これらの細胞にのみ遺伝子 X の発現は、tTA トレ サイクルの肯定的なフィードバックによって促進されます。達成されたスパースと明るいラベル個々 のニューロンの生体の形態学的詳細の可視化が可能します。井植手順の詳細に記載されていないされているからこのプロトコルは別記7,8,9,10,11。

  1. IUE のタイミング妊娠マウスを準備します。
  2. IUE の DNA 溶液を準備します。スパースは、RFP をラベル付け、pK031:TRE を含むソリューションを使用-Cre (5 ng/μ L) と pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 μ g/μ L) または pK031:TRE を含むソリューション-Cre (5 ng/μ L) と pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 μ g/μ L)。
    注: ベクトルのさまざまな組み合わせを使用してラベル付けされたニューロンの様々 な蛋白質を表現できます。また、様々 な遺伝子をノックダウンまたはできるラベル付きセル5,6具体的にノックアウト (例えば、超新星システムのためのベクトルのシリーズあり理化学研究所生物資源研究センターおよび Addgene から)。
  3. レギュラー井植記念「7,8,9,10,11皮質ニューロンをラベル付けするを実行します。4 層ニューロンのラベリング、萌芽期 14 日胚を使用します。
  4. 子犬配信と成長を待ちます。

2. 手術

  1. イソフルラン (1.0%) ガスを使用して産後の日 5 (P5) 子犬を麻酔します。尾ピンチ麻酔のレベルをチェックするテストを実行します。子犬は、ピンチに応答する場合は、イソフルラン濃度を増加 (最大 2.0%) または応答が消えるまで待ちます。加熱パッドを使用して手術中に子犬の体温を維持します。
  2. 鎮痛剤 (カルプロフェン、5 mg/kg) を皮下注入します。
  3. 3 回 70% エタノールで拭くことによって頭蓋骨を覆う子犬の皮膚を消毒します。
  4. 70% エタノール (図 1 a) 滅菌はさみを使って頭蓋骨を覆う皮膚の約 20 mm2を削除します。
  5. 滅菌鉗子と (図 1 a) 清潔、滅菌綿棒を使用して頭蓋骨の筋膜を削除します。
  6. 出血を止めるため切開皮膚表面にロード ヒントを使用して組織接着剤を適用します。これが頭蓋骨の開口部をより困難になりますので (図 1 b) イメージング領域に組織接着剤は適用されません。
  7. 加熱パッド (37 ° C) に子犬を置き、麻酔から回復することを許可します。組織接着剤が乾燥し、固化 (約 30 分) まで待機します。
  8. 必要に応じてより多くの組織接着剤を適用し、乾燥し、固化するまで待ちます。

3. 頭蓋ウィンドウ準備

  1. イソフルラン (1.0%-2.0%) を使用して子犬の麻酔し、尾ピンチ テストにより麻酔レベルをチェックします。
  2. 慎重に硬膜そのまま (直径 1 mm) を残して殺菌かみそりの刃で頭蓋骨を開く (図 1)。ゼラチン スポンジを使用 (約 < 2 mm3、滅菌はさみを使用して小さな断片に切断し、それらを適用ピンセットを使用して) 皮質バッファー12 (125 ミリ モル/L 塩化ナトリウム、5 ミリ モル/L KCl、10 ミリ モル/L 血糖値、10 ミリ モル/L HEPES、2 ミリ モル/L CaCl 2に浸漬と 2 ミリ モル/L MgSO4;pH 7.4;300 mOsm/L;部屋の温度)、出血を止める。頭蓋骨を開くときは、脳の表面を湿った保つために皮質バッファーを適用します。
  3. ゼラチン スポンジを用いた硬膜表面から血、バッファーを削除します。薄層 1.0% 低融点アガロース (皮質バッファーに溶解) を使用しての黄色のヒントを適用します。熱ブロック マシンを使用して、アプリケーションまで 42 ° C でアガロース溶液の温度を維持します。
    注: バッファーと血の流出は、乾燥ゼラチン スポンジ硬膜に接触しない世話をしながら開頭手術の側から実行する必要があります。そう失敗は、硬膜に損傷があります。
  4. Agarose のゲルの層の上に丸いガラス coverslip (第 1、直径 3 mm) を適用します。それらの間の agarose のゲルの過剰を注ぐことによって、coverslip と agarose のゲルの層の間のすべてのバブルを削除します。(図 1および1E) ピンセットを用いた coverslip の下から突き出た余分なジェルを取り外します。
  5. 歯科用セメント (図 1 階) を用いた coverslip を保護します。
  6. セメント粉とセメント液を混ぜます。それが固化する前に、黄色のヒントを使用して混合物を適用します。脳に損傷を与える可能性がありますので、硬膜上に歯科用セメントは適用されません。
  7. 滅菌チタンを添付 (カスタムメイド、図 1を参照してください約 30 mg) を歯科用セメントを用いた頭蓋骨のバーします。画像を簡単にキャプチャする並行チタン バー (硬膜面上) coverslip に合わせます。
  8. 歯科用セメント (図 1 H) と露出の頭蓋骨をカバーします。
  9. 麻酔から子犬を回復します。ヒーター (37 ° C) 歯科用セメントは (1 h) を固化するまでそれを続けます。

4. 2 光子イメージング

注:図 2の生体内のイメージは買収されたチタン サファイア レーザーを用いた二光子励起顕微鏡 (ビーム径 [1/e2]2: 1.2 mm)。

  1. 2 光子励起波長を設定します。RFP 励起、使用 1,000 nm (450 mW/mm2で深さ 400 μ m)。
    注: レーザー力縮小されるべき z 位置を上に移動します。
  2. 70% のエタノールとカバーガラスの表面を拭いてください。
  3. イソフルラン (1.5%-2.0%) を使用して子犬を麻酔し、尾ピンチ テストを使用して麻酔レベルを確認します。
  4. 子犬を子犬の頭 (図 2 aおよび2 b) にチタン棒を使用して画像の段階でチタン プレートに取り付けます。頭は、coverslip がゴニオ ステージ (図 2 b) を使用して対物レンズに平行になるように調整します。加熱パッド (37 ° C) を使用して子犬の体温を維持します。
  5. 0.7% から 1.0% にイソフルラン麻酔濃度を設定します。
    注: 非常に高いイソフルラン濃度イメージング中に子犬の不慮の死を引き起こす可能性があります。
  6. イメージングの段階 (図 2 bおよび2 C) 2 光子顕微鏡の対物レンズ (20 X、NA 1.0) の下に配置します。
  7. Coverslip の上に水の一滴を適用します。エピ蛍光を使用して、硬膜が露出している領域に蛍光蛋白質標識細胞を探します。
  8. 1.4 μ m 間隔で画像を z スタックを取得します。レイヤーは、イメージング、4 のニューロンは、樹状突起全体の形態 (図 2 Dと2 e) のイメージを 150-300 μ m の z 幅を設定します。使用遅いスキャンと神経細胞形態を示す明確な画像を取得する平均 (それは通常全体の樹枝状形態を取得する > 20 分を取る)。
    注: 次のパラメーターは、画像に適しています。励起波長: 1,000 nm、スキャナー: 検流計タイプ、ダイクロイック ミラー: 690 nm、発光フィルター: 575-620 nm バンドパス、検出器: GaAsP 型設定 > 100 を得るため、画像のサイズ > 512 x 512 μ m、視野 > 600 ピクセル解像度 < 1.2 μ m 600 μ m x。

5. 回復と看護

  1. イメージングの段階から子犬をデタッチします。
  2. ヒーター (37 ° C) に子犬を置き (15 分) を回復できるようにします。
  3. 2 h 間隔でマイクロ ピペットを使用して温めた牛乳子犬をフィードし、排泄できるように胃を優しく刺激します。子犬はその体重を測定することによって牛乳を飲むことを確認します。

6. 再イメージング

  1. イソフルラン (1.5%-2.0%) と子犬を麻酔し、尻尾ピンチ テストを使用して麻酔レベルを確認します。イメージングの段階にそれを接続します。
  2. 以前イメージのニューロンを検索し、z スタックのイメージを取得します。ニューロンの同定は、超新星と疎のラベル付けにより簡単です。
  3. 画像処理が完了するまで、手順 5.1 6.2.注: 子犬は、重量を失うことがなく 18 h までイメージすることができます。

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結果

図 2 D - 現在のプロトコルを使用してレイヤー 4 皮質ニューロンの 2 光子タイムラプス イメージングの2 階ショー代表の結果。、分析目的イメージングの期間を通して明確な樹枝状の形態を持つニューロンを選択します。形態素解析ソフトウェアを使用してイメージのニューロンの樹状突起の形態を分析しました。代表的な樹状突起の形態再?...

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ディスカッション

プロトコルで重要な手順とトラブルシューティングします。

プロトコルの最も重要なステップは、頭蓋骨 (プロトコル手順 3.2) の除去です。挿入、時にかみそりの刃は、しばしば硬膜、硬膜出血と脳に損傷を引き起こすに準拠します。これは、頭蓋骨に皮質バッファーのドロップを追加および皮質バッファーで頭蓋骨を削除して回避できます。

頭蓋ウ?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、佐藤、昌上林や s. 神山をその技術支援ありがちましょう。この作品は日本学術振興会科研費助成番号 JP15K14322 と JP16H06143、武田科学財団、上原記念財団の共同研究プロジェクトの新潟大学脳研究所 2017年-2923 (陛下) とサポートされています。科研費 JP16K14559、JP15H01454 と JP15H04263、イノベーション分野「スクラップ & ビルド システムによる脳機能の動的制御」研究助成金で (JP16H06459) (ti) は、文部科学省から。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
pK031. TRE-CreAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from authors
IsofluraneWako099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)Univentor8323101
Vetbond (tissue adhesive)3M084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)Sorenson13810
Gelfoam (gelatin sponge)Pfizer09-0353-01
AgaroseSigmaA9793Low melting point
Round-shaped coverslipMatsunami-Custom made
Unifast 2 (dental cement)GC-
Titanium barAuthors-Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)Zoetis-Injectable
2-photon microscopeZeissLSM7MP
Titanium-sapphire laserSpertra-PhysicsMai-Tai eHPDS
Titanium plateAuthors-Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementProBITPLANE
Goniometer stageThorlabsGN2/M

参考文献

  1. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
  2. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
  3. Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272(2005).
  5. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  6. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747(2016).
  7. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
  8. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
  11. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  16. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  17. Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
  18. Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
  19. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839(2017).
  20. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

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