JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נציג של ויוו שני הפוטונים הדמיה פרוטוקול הדמיה ההכרויות neonatal עכברים. שיטה זו מתאימה לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים הדינמיקות עצביים ועל שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.

Abstract

שני הפוטונים הדמיה הוא כלי רב עוצמה לניתוח ויוו של מעגלים עצביים במוח של יונקים. עם זאת, מספר מוגבל של ויוו בשיטות הדמיה קיימים לבחינת על רקמת המוח של יונקים היילוד בשידור חי. בזאת אנו מסכמים את פרוטוקול הדמיה נוירונים בודדים בקליפת המוח בעכברים neonatal חי. פרוטוקול זה כולל את מתודולוגיות שני הבאים: (1) מערכת סופרנובה דלילים ובהירים תיוג של נוירונים בקליפת המוח המוח המתפתח, (2) הליך כירורגי על הגולגולת neonatal שביר. פרוטוקול זה מאפשר התבוננות שינויים הטמפורלי של הפרט neurites קורטיקלית בשלבים neonatal עם יחס אות לרעש גבוה. גם ניתן להשיג על ידי שילוב של הסופרנובה עם הפרעה RNA ו CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה מערכות שכותרתו תא ספציפי ג'ין להחרשת, נוק אאוט. פרוטוקול זה, לכן, ניתן להשתמש לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים השולטים על דינמיקה עצביים, וכן שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.

Introduction

החיווט מדויק של מעגלים עצביים בקליפת חיוני עבור תפקודי המוח כולל תפיסה, קוגניציה, למידה וזיכרון. מעגלים בקליפת המוח הם מעודן באופן דינמי במהלך הפיתוח כמחנכת. מחקרים חקרו את תהליך השימוש היווצרות מעגל קורטיקלית היסטולוגית וניתוחים in vitro לקשרי תרבות. עם זאת, הדינמיקה של היווצרות מעגל ביונקים החיים נשאר בעיקר נחקרו.

מיקרוסקופ שני הפוטונים כבר בשימוש נרחב עבור הניתוחים ויוו של מעגלים עצביים העכבר למבוגרים המוח1,2. עם זאת, בשל האתגרים הטכניים, רק מספר מצומצם של מחקרים עסקו מעגלים עצביים היווצרות בעכברים היילוד. לדוגמה, קאריו. ואח לביצוע ההדמיה בצילום מואץ של טיפוס סיבי המוח הקטן של שבוע לאחר הלידה השניה3. . Portera-Cailliau et al. דיווח על ההדמיה של אקסונים בשכבת קורטיקלית 1 שבוע לאחר הלידה הראשונה4. במחקר הנוכחי, אנו מסכמים את פרוטוקול להשגחה של נוירונים בקליפת המוח של שכבה 4, שלהם דנדריטים בעכברים היילוד. התוצאות המתקבלות על-ידי החלת פרוטוקול זה, הכולל שתי מתודולוגיות, מדווחים הפרסום האחרונה שלנו5. ראשית, אנו משתמשים5,6 מערכת וקטור סופרנובה עבור תיוג נוירונים בודדים במוח neonatal. במערכת סופרנובה, החלבונים פלורסנט משמש תיוג עצביים גנים ספציפיים תא להחלפה ומתויגים הינם ניתוחים עריכה/נוק-אאוט הינם אפשריים. שנית, אנו מתארים הליך כירורגי להכנה חלון הגולגולת בעכברים neonatal שביר. יחד, מתודולוגיות אלה מאפשרים התצפית ויוו של נוירונים בודדים במוח neonatal.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים צריכה להתבצע בהתאם להנחיות רווחת שקבע המוסד של הנסיין.

1. הכנת הגורים עבור הדמיה

הערה: הגורים עם נוירונים בקליפת המוח בדלילות שכותרתו ניתן להשיג על ידי אלקטרופורציה בתוך הרחם (הצמיגים) של סופרנובה-וקטורים-5,-6. מערכת סופרנובה מורכב שני וקטורים הבאים: טרה-Cre, חטיבתי-loxP-עצור-loxP-X ג'ין-ires-tTA-WPRE. במערכת זו, תיוג דליל מסתמך על זליגת TRE. אוכלוסיה דלילה של נוירונים transfected, טרה מניע את ביטוי חלש Cre tTA. לאחר מכן, רק בתאים אלה, הביטוי של גנים X בהנחייתם של משוב חיובי של מחזוריות tTA-טרה. מושגת דלילים ובהירים תיוג מאפשר את החזיית פרטי מורפולוגי נוירונים בודדים בתוך vivo. פרטים של ההליך הצמיגים לא המתוארות פרוטוקול זה, מאז הם תיארו במקום אחר7,8,9,10,11.

  1. היכונו עכברים מתוזמן-בהריון. הצמיגים.
  2. להכין פתרון ה-DNA הצמיגים. עבור תיוג דליל עם RFP, להשתמש פתרון המכיל pK031:TRE-Cre (5 ng/µL), pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (µg 1/µL) או פתרון המכיל pK031:TRE-Cre (5 ng/µL), pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (µg 1/µL).
    הערה: חלבונים שונים יכול להתבטא שכותרתו הנוירונים באמצעות צירופים שונים של וקטורים. כמו כן, גנים שונים שניתן הפילו-למטה או הפילו-אאוט בפרט תאים עם תוויות5,6 (למשל, סדרה של וקטורים עבור מערכת סופרנובה זמינים מרכז המחקר BioResource RIKEN, Addgene).
  3. ביצוע רגיל. הצמיגים7,8,9,10,11 לתייג נוירונים בקליפת המוח. עבור תיוג של נוירונים שכבה 4, השתמש מתחלקים היום-14 עוברי.
  4. המתן עד מסירת הגור וצמיחה.

2. ניתוח

  1. עזים ומתנגד הגורים (P5) יום-5 כמחנכת באמצעות גז איזופלוריין (1.0%). לבצע בדיקת הזנב-קמצוץ כדי לבדוק את רמת ההרדמה. אם הכלבלב מגיב בלחץ, להעלות את ריכוז איזופלוריין (עד 2.0%) או להמתין עד התגובה נעלמת. לשמור על חום הגוף של הגור במהלך הניתוח באמצעות כרית החימום.
  2. Subcutaneously להזריק מקבל (carprofen, 5 מ"ג/ק"ג).
  3. לחטא העור של הכלבלב המכסה את הגולגולת שתמחקי את זה עם אתנול 70% שלוש פעמים.
  4. הסר כ 20 מ מ2 של העור המכסה את הגולגולת באמצעות מספריים לעקר עם 70% אתנול (איור 1 א').
  5. הסר fascia של הגולגולת באמצעות מלקחיים סטיריליים ספוגית כותנה נקי, סטרילי (איור 1 א').
  6. החל דבק רקמות באמצעות טעינת טיפים לפני השטח של העור חרות כדי לעצור את הדימום. אל תחיל את רקמת דבק לאזור הדימות (איור 1B), כי זה מקשה על פתיחת הגולגולת.
  7. במקום הכלבלב על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס), לאפשר לו להתאושש מן ההרדמה. המתן עד שהדבק רקמות שהתייבשה פני השטח למוצק (כ- 30 דקות).
  8. במידת הצורך, להחיל יותר דבק רקמות, המתן עד יבש, לחזק.

3. חלון הגולגולת הכנה

  1. עזים ומתנגד הכלבלב באמצעות איזופלוריין (1.0-2.0%), בדוק את רמת הרדמה על ידי מבחן הזנב-קורט.
  2. בזהירות לפתוח את הגולגולת עם סכין גילוח סטיריליים עוזב את דורא שלם (1 מ מ קוטר) (איור 1C). השתמש בספוג ג'לטין (חתוך לחתיכות קטנות, כ < 2 מ מ3, באמצעות מספריים מעוקר, וליישם אותם באמצעות פינצטה) טבולים קליפת מאגר12 (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L אשלגן כלורי, גלוקוז 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, mmol/L 2 CaCl2 , ו- 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; טמפרטורת החדר) כדי לעצור את הדימום. בעת פתיחת הגולגולת, החל חוצץ קליפת כדי לשמור את פני השטח של המוח לחות.
  3. הסר כל מאגר ודם מפני השטח. קרום שימוש בספוג ג'לטין. החל טיפים שכבה דקה של 1.0% באמצעות נקודת ההיתוך הנמוכה agarose (מומס מאגר cortex) צהוב. באמצעות מכונת בלוק חום, לשמור על הטמפרטורה של הפתרון agarose ב 42° C עד היישום.
    הערה: ניקוז של מאגר ודם יש לבצע מהצד של הניתוח תוך דאגה בספוג ג'לטין יבש שאינו בא במגע עם השכבה הקשה של המוח. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום נזק השכבה הקשה של המוח.
  4. החל coverslip של זכוכית עגול (מס ' 1, 3 מ מ קוטר) על השכבה ג'ל agarose. להסיר את כל הבועות בין coverslip את השכבה ג'ל agarose על ידי מזיגת עודף של ג'ל agarose ביניהם. להסיר את הג'ל עודף בולט מתחת coverslip באמצעות פינצטה (איור 1D ו- 1E).
  5. אבטח את coverslip באמצעות מלט שיניים (איור 1F).
  6. מערבבים את אבקת מלט, הנוזל מלט. החל את התערובת בעזרת טיפים צהוב לפני זה פני השטח הופך למוצק. אל תחיל מלט שיניים על גבי דורא, כי זה עלול לגרום נזק למוח.
  7. צירוף של טיטניום סטרילי בר (בהתאמה אישית, כ- 30 מ"ג, ראה איור 1 ג'י) על עצם הגולגולת באמצעות מלט שיניים. יישר את בר טיטניום, את coverslip (על פני השטח של דורה), במקביל בקלות ללכוד תמונות.
  8. מכסים את הגולגולת חשוף עם מלט שיניים (איור 1 H).
  9. לשחזר את הגור מן ההרדמה. שמור אותו על הגל (37 מעלות צלזיוס) עד הבטון שיניים התחזק (1h).

4. שני הפוטונים הדמיה

הערה: התמונות ויוו באיור 2 נרכשו באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים עם לייזר טיטניום-ספיר (קרן קוטר [1/e2]2: 1.2 מ מ).

  1. קבע את אורך הגל של הלייזר שני הפוטונים. עבור RFP עירור, שימוש 1,000 nm (450 מ"מ/mW2 -מיקרומטר 400 של עומק).
    הערה: עוצמת הלייזר צריך להיות מופחת כפי z-עובר למעלה.
  2. נגב את פני השטח של coverslip עם 70% אתנול.
  3. עזים ומתנגד הכלבלב באמצעות איזופלוריין (1.5-2.0%), בדוק את רמת ההרדמה באמצעות מבחן הזנב-קורט.
  4. צרף הכלבלב לצלחת טיטניום על הבמה הדמיה באמצעות בר טיטניום על הראש של הכלבלב (איור 2A ו- 2B). התאם את הראש כך coverslip, הוא מקביל העדשה המטרה באמצעות השלב מד זווית (איור 2B). לשמור על טמפרטורת גוף של הכלבלב באמצעות כרית החימום (37 מעלות צלזיוס).
  5. הגדר את הריכוז איזופלוריין כ- 0.7% - 1.0%.
    הערה: ריכוז גבוה מאוד איזופלוריין עלול לגרום מוות בתאונה של הכלבלב במהלך דימות.
  6. מקם את הבמה דימות תחת עדשת אובייקטיבי (20 X, נה 1.0) מיקרוסקופ שני הפוטונים (איור 2B ו- 2 C).
  7. החל טיפה אחת של מים על גבי coverslip. השתמש epi-זריחה כדי לאתר את הנוירונים התווית על-ידי החלבון הניאון באזור שבו נחשפה השכבה הקשה של המוח.
  8. לרכוש תמונות z-מחסנית במרווחי זמן 1.4-מיקרומטר. שכבה 4 נוירון הדמיה, להגדיר את z-הרוחב 150-300 מיקרומטר לשיקוף המורפולוגיה דנדריטים כולו (איור דו-ממדי , 2E). שימוש איטי סריקה של ממוצע כדי לקבל תמונות ברורות מציג המורפולוגיה עצביים (זה בדרך כלל לוקח > 20 דקות כדי לרכוש המורפולוגיה דנדריטים כולו).
    הערה: הפרמטרים הבאים מומלצים עבור הדמיה. עירור גל: 1,000 ננומטר, סורק: סוג גלוונומטר, ראי ודיקרואיק זוהר: 690 ננומטר, מסנן פליטה: 575-620 bandpass ננומטר, גלאי: סוג חאספ, לקבל הגדרה > 100, תמונה בגודל > 512 x 512 מיקרומטר, שדה ראייה > 600 x 600 מיקרומטר, פיקסל רזולוציה < 1.2 מיקרומטר.

5. החלמה וסיעוד

  1. ניתוק הכלבלב החל משלב הדמיה.
  2. למקם את הגור על הגל (37 מעלות צלזיוס) ולאפשר לשחזר (15 דקות).
  3. להאכיל הגור חלב חם באמצעות micropipette במרווחים של 2-h ולעורר בעדינות את הבטן כדי לאפשר הפרשה. לאשר כי הכלבלב שותה חלב על ידי מדידת משקל הגוף שלו.

6. תמונה חדשה

  1. עזים ומתנגד הכלבלב עם איזופלוריין (1.5-2.0%), ולבדוק את רמת ההרדמה באמצעות מבחן הזנב-קורט. לצרף אותו אל הבמה הדמיה.
  2. לאתר את הנוירונים בעבר שבעורך ולרכוש תמונת z-מחסנית. הזיהוי של נוירונים קל בשל תיוג דליל שלהם עם סופרנובה.
  3. חזור על שלבים 5.1-6.2 עד ההדמיה הושלמה. הערה: הכלבלב יכול לדימות ועד 18 h מבלי לאבד משקל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דמויות 2D - 2F הצג תוצאות נציג שני הפוטונים הדמיה בצילום מואץ של שכבה 4 נוירונים בקליפת המוח משתמש בפרוטוקול הנוכחי. לצורך ניתוח, בחר נוירונים עם מורפולוגיה דנדריטים ברור לאורך כל התקופות הדמיה. ניתחנו את המורפולוגיה דנדריטים של נוירונים הדמיה באמצעות תו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול לפתרון בעיות:

השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הינו של הגולגולת (פרוטוקול שלב 3.2). בשעת ההוספה, גילוח לאנאפוליס לעיתים קרובות השכבה הקשה של המוח, גורם לדימום. קרום נזק למוח. זה ניתן למנוע על-ידי הוספת טיפה של קליפת מאגר על הגולגולת והסרה הגולגולת במאגר בקל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה סאטו ט, מ Kanbayashi ו- Kouyama ס' לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על- ידי JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP15K14322, JP16H06143, קרן המדע טקדה, קרן ההנצחה Uehara ו את שיתופי מחקר פרויקט של נייגאטה אוניברסיטת המוח מחקר מכון 2017-2923 (H.M.) KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, ו JP15H04263, במענק מחקר מדעי בתחומים חדשנות "דינמי ויסות תפקוד המוח על ידי גרוטאות & לבנות מערכת" (JP16H06459) מ- MEXT (רכב מורשה).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pK031. TRE-CreAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from authors
IsofluraneWako099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)Univentor8323101
Vetbond (tissue adhesive)3M084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)Sorenson13810
Gelfoam (gelatin sponge)Pfizer09-0353-01
AgaroseSigmaA9793Low melting point
Round-shaped coverslipMatsunami-Custom made
Unifast 2 (dental cement)GC-
Titanium barAuthors-Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)Zoetis-Injectable
2-photon microscopeZeissLSM7MP
Titanium-sapphire laserSpertra-PhysicsMai-Tai eHPDS
Titanium plateAuthors-Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementProBITPLANE
Goniometer stageThorlabsGN2/M

References

  1. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
  2. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
  3. Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272(2005).
  5. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  6. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747(2016).
  7. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
  8. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
  11. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  16. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  17. Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
  18. Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
  19. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839(2017).
  20. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved