Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura

Resumen

Ratones modificados genéticamente son modelos útiles para la investigación de mecanismos del cáncer de próstata. Aquí presentamos un protocolo para identificar y disecar la próstata lóbulos de un mouse del Sistema urogenital, diferenciarlas basados en la histología y aislar y cultura primaria células prostáticas en vitro como esferoides para análisis posteriores.

Resumen

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) sirven como eficaces modelos preclínicos para investigar muchos tipos de cánceres humanos, incluido el cáncer de próstata (PCa). Comprender la anatomía y la histología de la próstata del ratón es importante para el uso eficiente y adecuada caracterización de dichos modelos animales. La próstata del ratón tiene cuatro distintos pares de lóbulos, cada uno con sus propias características. Este artículo muestra el método correcto de disección e identificación de lóbulos próstata mouse para el análisis de la enfermedad. Disección posterior, las células de la próstata pueden ser más culta en vitro para comprensión mecanicista. Desde el ratón próstata células primarias tienden a perder sus características normales cuando cultivo en vitro, esbozamos aquí un método para aislar las células y crecen como cultivos 3D esferoide, que es eficaz para preservar el fisiológico características de las células. Estas culturas 3D pueden utilizarse para analizar la morfología de la célula y los niveles de comportamiento en condiciones fisiológicas cerca, investigando alterado y localizaciones de proteínas clave y vías que intervienen en el desarrollo y la progresión de una enfermedad y mirando respuestas a tratamientos farmacológicos.

Introducción

La comunidad científica ha estado tratando de aclarar el complejo mecanismo de desarrollo de cáncer en humanos por décadas. Considerando que la identificación de potenciales actores y dianas farmacológicas comienza con estudios de tejido y células del paciente, la aplicación traslacional de tales hallazgos a menudo requiere el uso de modelos animales preclínicos. El uso de ratones modificados genéticamente modelos (GEMMs) a cánceres humanos modelo ha aumentado constantemente desde el establecimiento del ratón modelos de humano cánceres consorcio (NCI-MMHCC), una Comisión que pretendía describir y unificar las características del cáncer de ratón modelos para los científicos en todo el mundo^1,2. Modelos de ratón satisfacen la necesidad de estudios mecanísticos en los estudios preclínicos de la mayoría de los tipos de cáncer, para entender el desarrollo, progresión, respuesta a tratamientos y adquirieron resistencia³.

El cáncer de próstata es el cáncer que ocurre más comúnmente en hombres, afectando a más de 160.000 hombres cada año⁴. Formas agresivas de la enfermedad dicen decenas de miles de vidas cada año. Sin embargo, el mecanismo de progresión de la enfermedad es todavía mal entendido. Esto resulta en una grave falta de opciones de tratamiento eficaz para cáncer de próstata avanzado y metastásico, como lo demuestra la alta tasa de mortalidad en pacientes de cáncer de próstata avanzado⁴. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de modelos preclínicos estudiar el cáncer de próstata. Sin embargo, debido a las diferencias inherentes entre el ratón y el humano de la próstata, modelado del cáncer de próstata en GEMMs no ganó popularidad hasta que el sistema de clasificación de Bar Harbor fue introducido en 2004, que se describe cambios histopatológicos en el ratón próstata en manipulación genética, la identificación de cambios neoplásticos y su relación con las etapas de la progresión del cáncer en los seres humanos⁵. Una característica importante de la próstata del ratón que debe tenerse en cuenta al estudiar cualquier modelo de GEMM la próstata es la presencia de cuatro distintos pares de lóbulos: anterior, lateral, ventral y dorsal. Los lóbulos presentan diferencias significativas en la histopatología y gene expresión patrón⁶. Patrón de expresión de la proteína probasin puede variar entre los lóbulos en ratones jóvenes post pubertad⁷, que debe ser considerado ya que Cre de GEMM modelos están diseñados en su mayoría utilizando un promotor basada en probasin llamado Cre4 Pb⁷. Las diferencias espaciales y temporales resultantes en Cre expresión a menudo conducen a diferencias en los plazos de iniciación y progresión del tumor así como las diferencias en cambios neoplásicos entre los lóbulos. Por lo tanto, es importante tener en cuenta esas diferencias mientras estudiaba el desarrollo del tumor en la próstata GEMMs y los lóbulos individuales deben evaluarse por separado para lograr resultados reproducibles. La primera parte de este artículo describe los métodos apropiados para disecar una próstata de ratón, identificar y separar cada lóbulo y reconocer las diferencias histológicas entre los lóbulos.

Mientras que el análisis del crecimiento del tumor y la histopatología puede proporcionar información valiosa en el desarrollo del tumor, no brindan mucha información acerca de los mecanismos moleculares. Para estudiar el mecanismo de desarrollo del tumor y la progresión, a menudo es útil analizar el tumor las células in vitro. Varios métodos se han sugerido sobre los años que implican cultivos de estas células, incluyendo suspensión culturas, culturas 3D⁸ y recientemente, 2D regulares culturas⁹. Mientras que la mayoría de estos métodos resulta en tasas de supervivencia y proliferación celular bien, las culturas 3D proporcionan un entorno más cercano a las condiciones fisiológicas. En 3D o esferoide culturas cultivadas en una matriz extracelular (ECM) de la membrana basal, las células luminales completamente diferenciadas generalmente tienen muy baja tasa de supervivencia; sin embargo, las células basales e intermedias (sobre todo células) son capaces de difundir y producir racimos de célula llamados esferoides¹⁰. Esto hace conveniente para un estudio de cáncer ya que se creen que proceden de las células madre (popularmente conocidas como las células madre cancerosas)¹¹los cánceres epiteliales. La segunda parte de este protocolo describe un método para el cultivo de las células de próstata mouse en culturas 3D. Las esferas resultantes se pueden utilizar para varios tipos de análisis de aguas abajo, incluyendo el estudio de la morfología de organoides y el comportamiento de células vivas imágenes, inmunofluorescencia, tinción de proteínas diferentes y el estudio de las respuestas a la quimioterapia tratamientos.

En general, el objetivo de este protocolo es exponer métodos óptimos para el uso de modelos de ratón en el cáncer de próstata mediante la descripción de las técnicas de disección y anatomía de la próstata del ratón y el procesamiento del tejido para análisis en vitro y esferoide culturas .

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Protocolo

Todos los experimentos de ratón descritos aquí fueron realizados según las directrices descritas en los protocolos institucionales aprobado por el IACUC en SUNY Upstate Medical University.

1. la disección del Sistema Urogenital (UGS)

Nota: El esquema se presenta en la figura 1.

1. Eutanasia a un ratón C57BL/6 macho de 3 meses utilizando el método de eutanasia por inhalación de CO₂ u otra técnica aprobada.
   Nota: Ratones entre las edades de 3 y 12 meses pueden utilizarse con éxito para el experimento. Ratones más viejos (> 6 meses) más probablemente tienen más grasa alrededor de la UGS, que tendrán que ser aclarados. Identificación y separación de los lóbulos a menudo es difícil en menores de 3 meses de ratones. Otras cepas pueden utilizarse para el experimento, así.
2. Coloque el ratón en su parte posterior y fije las patas con alfileres para que quede expuesto el lado ventral del animal.
3. Rociar etanol al 70% en el abdomen del ratón y frótela para limpiarla.
   Nota: Afeitar el pelo del abdomen antes de la disección no es necesaria.
4. Levantar la piel del abdomen, junto con la capa del músculo, con un par de fórceps romos medio y hacer una incisión en forma de Y invertida en el abdomen con unas tijeras.
   1. En primer lugar, haga una incisión recta con un par de tijeras afiladas de justo encima del pene para el esternón (Figura 2a).
   2. Corte de la base de la incisión hacia cada dedo del pie, hasta los muslos (figura 2b). Pliegue la piel a ambos lados y en la parte inferior para ver toda la zona abdominal (figura 2 c-e).
      Nota: El tamaño de corte varía dependiendo en el tamaño y edad del ratón. El tamaño de la incisión recta inicial puede variar de 1,5 a 4 cm, dependiendo del tamaño del ratón.
5. Pasar sobre los otros órganos para exponer el UGS. Levantar y mover los intestinos brown-amarillo (figura 2f). Recoger las almohadillas de grasa abdominales (el tejido esponjoso blanco opaco) con pinzas y colóquelos a los lados (figura 2 g).
   Nota: El UGS consta de vesículas seminales, uretra, próstata, conducto deferente (vas deferens) y vejiga urinaria. Pueden identificarse por el característico par de opacos blanco arcos de medio punto (que son las vesículas seminales), con el saco de vejiga llena de líquido unido a la base. El tejido transparente ubicado justo debajo de las vesículas seminales está la próstata.
6. Localizar el UGS firmemente mantener la vejiga urinaria con el fórceps romos y levante el UGS todo hacia arriba del abdomen del ratón.
   Nota: Si la vejiga está llena, vaciarlo primero con una jeringa pequeña para proporcionar un mejor agarre con el fórceps y reducir el riesgo de ruptura de la vejiga.
7. Continuar jale hacia arriba la vejiga, deslice un par de tijeras por debajo de la vejiga y la próstata hacia la columna vertebral y hacer un corte. Corte a través de las conexiones restantes a la cavidad abdominal (figura 2 h y 2i). Tenga cuidado de no cortar demasiado cerca a la UGS para evitar el corte accidental a través de cualquier tejido de la próstata.
   Nota: Al hacer el corte bajo el UGS, las tijeras deben insertarse hasta la parte posterior del ratón, para que el corte ajusta la columna vertebral, así. Este método resulta en cortar casi todas las conexiones entre el UGS y la cavidad abdominal en un recorte, reducir el tiempo necesario para extraer el tejido de ratón.
8. Quitar el UGS y colocarlo en 2-6 mL (suficiente para cubrir el tejido) de fosfato tampón salino (PBS) o de Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM, glucosa alta) en una placa de Petri (figura 2j y 2 k) de 6 cm y a un microscopio de disección (10 X Ampliación).
   Nota: Cambiar el medio de disección como se requiere en los pasos restantes.

2. disección de la próstata

1. Eliminar toda la grasa de los lados dorsales y ventrales con un par de finas pinzas y tijeras de microdisección (figura 3a). Utilizar instrumentos quirúrgicos similares para el resto del Protocolo de disección.
   Nota: La grasa es a menudo estrechamente entrelazada con el UGS (pueden identificarse por su aspecto esponjoso blanco); por lo tanto, este paso debe realizarse cuidadosamente para evitar recortes accidentalmente de cualquier tejido de la próstata. Puede tomar hasta 10-15 min para eliminar toda la grasa.
2. Mantener y tirar de la vejiga con las pinzas y cortar la base con las tijeras (figura 3b).
3. Coloque el lado ventral del tejido restante hacia arriba. Sostener uno deferens de ductus con pinzas, trazar en la base con unas tijeras, cortarlo (Figura 3C) y repetir en el otro lado. Quitar los deferens de ductus, ahora dejando la próstata (translúcido y verminosa), vesículas seminales (opaco y blanco, semicircular) y de la uretra (tubo de color rosado a rojo y opaco) (Figura 3d y 3e).
4. Inserte las pinzas entre el arco interior de los lóbulos anterior tejido de la próstata y las vesículas seminales. Haga palanca aparte de las vesículas seminales y la próstata y cortar cualquier tejido conectivo como sea necesario (figura 3f). Seguimiento de las vesículas seminales a su base en la uretra y eliminarlos (figura 3 g y 3 h). Tenga cuidado de no pincharlos.
5. Proceda a disecar a los lóbulos individuales de la próstata.

3. anatomía macroscópica de la microdisección del lóbulo de la próstata e Individual (figura 3i-n, figura 4)

1. Voltear el tejido con un par de fórceps romos por lo que el lado dorsal quede hacia arriba, mostrando los lóbulos dorsales, que se asemejan a las alas de una mariposa.
2. Recoger los lóbulos dorsales manteniendo el lóbulo con pinzas y recortes en la base con unas tijeras (figura 3j).
3. Voltear el tejido restante al lado ventral.
4. Recoger los lóbulos laterales, que son pequeños y generalmente envuelve la uretra en el lado que está encajada entre los lóbulos anteriores, ventrales y dorsales (figura 3 k).
5. A continuación, recoger los lóbulos ventrales, que son más grandes que los lóbulos laterales y se encuentran en la uretra ventral (figura 3 l).
6. Por último, los lóbulos anteriores, el más grande de los cuatro, cortando y desechando la uretra (figura 3 m) de la cosecha.
7. Proceso de las piezas de tejido según las necesidades experimentales. Proceda a la sección 4 para histología, o a la sección 5 para la cultura del esferoide.

4. lóbulo identificación y morfología de Hematoxylin y diapositivas eosina-manchadas

1. Fijar el tejido prostático y embed en parafina. Proceder con la coloración de los portaobjetos con hematoxilina y eosina (H & E) para ver e identificar diferencias en próstata lóbulos basados en la histología, con las características descritas por Oliveira et al. ¹² (figura 5).

5. procesamiento del tejido para cultura 3D¹⁰

Nota: Esto se describe en la figura 6.

1. Proceder con los lóbulos enteros próstata o individuales según las necesidades experimentales de cultivo. Transferir el tejido de la próstata a un plato de 10 cm que contienen 2-3 mL de DMEM. Con un bisturí, pique los túbulos próstata como finalmente y uniformemente como sea posible bajo el microscopio de disección.
2. Continúe con los pasos restantes bajo una campana de cultivo de tejidos, bajo condiciones estériles.
3. Transfiera las piezas de tejido junto con el DMEM al tubo de 15 mL y aumentar el volumen a 9 mL de DMEM. Añadir 1 mL de solución stock de 10 x colagenasa para la mezcla de tejidos de DMEM y vortex para mezclar.
   Nota: Solución madre de colagenasa es de 10 mg/mL en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), y la concentración final en el tubo de 15 mL es de 1 mg/mL.
4. Coloque el tubo en un agitador giratorio o rotor por 2 h a 37 ° C, de la colagenasa degradar la matriz extracelular del tubo.
5. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Desechar el sobrenadante y resuspender en 2 mL de caliente 0.05% tripsina-EDTA hender las adhesiones célula-célula y célula-matriz. Transferir el tubo a 37 º C durante 5 minutos.
   Nota: Si son demasiado grandes para mezclar bien los trozos de tejido, corte la punta con una navaja para hacer un agujero más amplio.
7. Dispersar cualquier grumos de tejido por pipeteo con una pipeta P1000 8 - 10 veces y luego repetir con una pipeta de P200.
8. Neutralizar la tripsina con 3 mL de DMEM completo. Añadir 500 U de ADNasa I y mezcla bien.
9. Pasar a través de una jeringa de 5 mL 5 - 10 veces con una aguja de 18 G. Luego pasar 5 veces con una aguja de 20 G.
10. Repita los pasos 4-8 una vez más si la solución contiene trozos grandes de tejido.
11. Filtrar la suspensión de células a través de un filtro de 40 micras colocado sobre un tubo de 50 mL. Enjuague el tubo de 15 mL con 5 mL de DMEM y pasar a través del mismo filtro. Repita el enjuague.
12. Deseche el filtro y centrifugue el tubo que contiene el paso a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.

6. planchas y cultivo de las células

1. Resuspender el precipitado en 0,5 mL de la próstata epitelial célula crecimiento medio completo (PrEGM). Contar la densidad de células usando un contador de células o hemocitómetro y diluir las células 5 x 10⁵ células/mL en PrEGM completa.
   Nota: El rendimiento de una ratón 3 meses toda la próstata puede variar de 3 x 10⁵-10⁶ células. Por lo tanto, es importante inicialmente Resuspender el precipitado en no más de 0,5 mL de PrEGM (como se mencionó anteriormente) por lo que se logra la densidad celular deseada, incluso con bajo rendimiento.
2. Mezcla la cantidad necesaria de células con la membrana del sótano ECM en un cociente del volumen (60% membrana del sótano ECM y un 40% la suspensión de la célula) y la placa en varios pocillos placa o portaobjetos de la cámara según las necesidades experimentales de 2:3.
   Nota: Para la inmunotinción, placa en la parte inferior de cristal placas o portaobjetos de la cámara, cubriendo todo el bien o medio bien. Alrededor del borde del pozo de la placa si contando las organitas resultante, o varias gotitas en todo el pozo de la placa si mayores volúmenes de la galjanoplastia. Se debe tener cuidado para no extenderlo demasiado gruesas o demasiado delgadas. Al menos 100 μl de mezcla de la matriz celular por 1 cm² de área; de la galjanoplastia de la placa por ejemplo, en un portaobjetos de la cámara con una de 2 cm²-bien la superficie, debe ser bañado en 200 μL de la mezcla de células de la matriz que contiene las células 5 x 10⁴ .
3. Transferencia de la placa o diapositiva a una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂ por 30 min para el ECM para solidificar la membrana del sótano. Luego, añadir precalentado PrEGM completa para cubrir el pozo, teniendo cuidado de no para disturbar el tapón de la membrana del sótano ECM.
4. Retire la mitad de los medios de comunicación y añadir medio fresco cada 2-3 días. Aumentan los esferoides de 5-10 días.
5. Continuar con la cosecha (paso 7), inmunotinción (paso 8), o la proyección de imagen para aplicaciones posteriores.

7. recolección de las esferas

1. Para cosechar las esferas, aspirar cuidadosamente los medios de comunicación sin alterar el membrana del sótano ECM gel tapón y agregue 1 mL de solución de 1 mg/mL dispase PrEGM por 100 μl de la membrana del sótano ECM.
   Nota: Es más fácil cosechar esferoides si son plateados en el borde (en lugar de cubrir bien todo), o bien para asegurar que se puede añadir una cantidad adecuada de la solución del dispase al pozo.
2. Raspe la parte inferior de la placa con un raspador celular para quitar el gel de la membrana del sótano ECM en la solución de PrEGM dispase.
3. Pipeta de la solución completa arriba y abajo de una vez con una amplia perforación punta de pipeta de 1000 μl o pipeta de 5 mL para romper el tapón de gel en trozos más pequeños.
   Nota: Cortar la punta de una pipeta de 1000 μl con una cuchilla de afeitar para hacer una punta de calibre ancho.
4. Incubar en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂ para 1-2 h hasta que la membrana del sótano ECM ha disuelto totalmente.
   Nota: Esto puede ser asegurado por la inspección visual de la parte inferior bien mientras se inclina la placa para confirmar que siguen siendo no más trozos de gel.
5. Recoger la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL.
6. Centrifugue las esferas a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente y continuar con aplicaciones posteriores.

8. el Immunostaining del esferas¹³

Nota: Después de esferoides han crecido por la cantidad de tiempo deseada, la membrana del sótano ECM puede ser disuelto y esferas pueden ser teñidas como se describe en Colicino et al. ¹³.

1. Brevemente, enjuagar las culturas con PBS y añadir 4% paraformaldehido (PFA) directamente al membrana del sótano ECM gel tapón. Incubar durante 30-90 min a temperatura ambiente con agitación lenta, hasta que la membrana del sótano ECM se haya disuelto completamente, reemplazo PDA fresco cada 30 minutos.
   Nota: El PFA disolver el tapón del gel y fijar los esferoides durante este proceso.
2. A continuación, lavar con PBS 3 veces y añadir cloruro de amonio 50 mM por 10 min calmar cualquier autofluorescence de la PFA. Repita 3 lavados con PBS.
3. Permeabilizar con 0,1% detergente no iónico por 5 min y bloque con PBSAT (PBS-BSA 1%, 0.5% Tritón X-100) durante 30 minutos.
4. Incuban con un anticuerpo primario en PBSAT durante la noche a 4 ° C, seguido de 3 lavados con PBSAT y un anticuerpo secundario en PBSAT por 2 h a temperatura ambiente.
5. Repetir los lavados con PBSAT y tinción con DAPI según protocolo del fabricante, si lo desea. Lavar 3 o más veces con PBS.
6. Añadir PBS con reactivo antifade de 200 mM 1, 4-Diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) y proceder a la proyección de imagen.

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Resultados

Los lóbulos de próstata del ratón pueden ser identificados y disecaron usando sus ubicaciones con respecto a las vesículas seminales y la uretra. La próstata del ratón está compuesto por 4 pares de lóbulos situados dorsalmente y ventralmente a las vesículas seminales y la uretra. Figura 4a y 4b (arriba) muestran las vistas dorsales y ventrales de la próstata intacta, junto con las vesículas seminales y uretra. Los paneles de la par...

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Discusión

Este documento describe los métodos de disección de la próstata del ratón e identificación de los lóbulos individuales. También se describe, es el protocolo para el cultivo de células de próstata de ratón en una cultura 3D para análisis en vitro .

Un paso crítico en el protocolo de disección es cosechar el UGS todo fuera del ratón (1) y separar los órganos individuales bajo un microscopio de disección. El tejido de la próstata es muy pequeño y rodeado por el resto de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C