Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

Riepilogo

Topi geneticamente modificati sono modelli utili per studiare i meccanismi di carcinoma della prostata. Qui presentiamo un protocollo per identificare e sezionare i lobi della prostata da un sistema urogenitale del mouse, differenziarli basato sull'istologia e isolare e coltura primaria di cellule della prostata in vitro come sferoidi per analisi successive.

Abstract

Modelli murini geneticamente (GEMM) fungono da efficace modelli pre-clinici per indagare la maggior parte dei tipi di cancri umani, compreso il carcinoma della prostata (PCa). Comprendere l'anatomia e istologia della prostata del mouse è importante per l'uso efficiente e corretta caratterizzazione di tali modelli animali. La prostata del topo ha distinto quattro paia di lobi, ciascuno con le proprie caratteristiche. Questo articolo viene illustrato il metodo corretto di dissezione e identificazione dei lobi della prostata del mouse per l'analisi di malattia. Post-dissezione, le cellule della prostata possono essere ulteriormente coltivate in vitro per la comprensione meccanicistica. Dal mouse cellule primarie della prostata tendono a perdere le loro caratteristiche normali quando coltivate in vitro, descriviamo qui un metodo per isolare le cellule e loro coltivazione come culture sferoide 3D, che è efficace per preservare la fisiologica caratteristiche delle cellule. Queste culture 3D possono essere utilizzate per analizzare la morfologia delle cellule e comportamento in condizioni di quasi-fisiologiche, indagando alterato livelli e localizzazioni di proteine chiave e pathways coinvolti nello sviluppo e progressione di una malattia e guardando risposte ai trattamenti farmacologici.

Introduzione

La comunità scientifica ha cercato di chiarire il meccanismo complesso di sviluppo umano del cancro per decenni. Considerando che l'identificazione di potenziali giocatori chiavi e bersagli farmacologici inizia con le cellule pazienti e gli studi del tessuto, l'applicazione traslazionale di tali risultati spesso richiede l'uso di modelli animali preclinici. L'uso di topi geneticamente ingegnerizzati modelli (GEMM) ai cancri umani modello è sempre aumentata dall'istituzione del Mouse modelli di umano cancri Consorzio (NCI-MMHCC), un comitato che ha cercato di descrivere e unificare caratteristiche del cancro del mouse modelli per gli scienziati in tutto il mondo^1,2. Modelli murini di soddisfano l'esigenza degli studi meccanicistici in studi pre-clinici della maggior parte dei tipi di cancro, per comprendere lo sviluppo, la progressione, la risposta ai trattamenti e acquisito resistenza³.

Carcinoma della prostata è il cancro più frequente negli uomini, che interessa oltre 160.000 uomini ogni anno⁴. Forme aggressive della malattia sostengono decine di migliaia di vite ogni anno. Tuttavia, il meccanismo della progressione di malattia è ancora capito male. Ciò provoca una grave mancanza di opzioni di trattamento efficace per carcinoma della prostata avanzato e metastatico, come testimonia l'elevata mortalità in pazienti di carcinoma della prostata avanzato⁴. Quindi, c'è un crescente bisogno di modelli pre-clinici per lo studio del carcinoma della prostata. Tuttavia, a causa delle differenze intrinseche tra il mouse e la prostata umana, modellazione di carcinoma della prostata in GEMM non ha guadagnato popolarità fino a quando il sistema di classificazione di Bar Harbor è stato introdotto nel 2004, che ha descritto i cambiamenti istopatologici nel topo prostata su manipolazioni genetiche, identificazione di alterazioni neoplastiche e la loro relazione alle fasi della progressione del cancro in esseri umani⁵. Una caratteristica importante della prostata del mouse che deve essere preso in considerazione durante lo studio di qualsiasi modello GEMM della prostata è la presenza di quattro coppie distinte di lobi: anteriore, laterale, ventrale e dorsale. I lobi presentano differenze significative in istopatologia e gene expression pattern⁶. Modello di espressione della proteina probasina può variare tra i lobi di giovani post-pubertà topi⁷, che deve essere considerato poiché modelli GEMM Cre-basato per lo più sono progettati utilizzando un promotore probasina-based chiamato Pb-Cre4⁷. Le differenze risultanti spaziale e temporale di Cre espressione spesso portano a differenze nelle cronologie di iniziazione e progressione del tumore come pure le differenze nei cambiamenti neoplastici fra i lobi. Quindi, è importante tenere conto di tali differenze mentre si studia lo sviluppo del tumore nella prostata GEMM, e i lobi individuali possono devono essere valutati separatamente per ottenere risultati riproducibili. La prima parte di questo articolo descrive i metodi adeguati per sezionare una prostata del topo, identificare e separare ogni lobo e riconoscere le differenze istologiche fra i lobi.

Mentre l'analisi della crescita del tumore e l'istopatologia può fornire informazioni preziose nello sviluppo del tumore, non forniscono molte informazioni su meccanismi molecolari. Per studiare il meccanismo di sviluppo del tumore e la progressione, è spesso utile analizzare le cellule del tumore in vitro. Diversi metodi sono stati suggeriti nel corso degli anni che coinvolgono culture di queste cellule, incluse le colture in sospensione, culture 3D⁸ e recentemente, regolari 2D culture⁹. Considerando che la maggior parte di questi metodi si traducono in tassi di sopravvivenza e proliferazione delle cellule buone, le culture 3D forniscono un ambiente che è più vicino a condizioni fisiologiche. In 3D o sferoide colture cresciute in una matrice extracellulare (ECM) di membrana basale, le cellule completamente differenziate luminale hanno solitamente molto basso tasso di sopravvivenza; Tuttavia, le cellule basali e intermedi (principalmente cellule staminali) sono in grado di propagare e produrre aggregati di cellule chiamati sferoidi¹⁰. Questo lo rende adatto per uno studio del cancro poiché i cancri epiteliali sono creduti per provenire dalle cellule staminali (popolarmente note come le cellule staminali tumorali)¹¹. La seconda parte del presente protocollo descrive un metodo per la coltura di cellule della prostata del mouse nelle culture 3D. Le sfere risultante possono essere utilizzate per diversi tipi di analisi a valle, tra cui lo studio della morfologia organoid e comportamento da live cell imaging, immunofluorescenza che macchia per diverse proteine e lo studio delle risposte ai chemioterapici trattamenti.

Nel complesso, l'obiettivo del presente protocollo è quello di delineare i metodi ottimali per l'utilizzo di modelli murini nel carcinoma della prostata descrivendo le tecniche di anatomia e dissezione della prostata del mouse e l'elaborazione del tessuto per analisi in vitro e sferoide culture .

Protocollo

Tutti gli esperimenti del mouse descritti qui sono stati eseguiti secondo le linee guida delineate nei protocolli approvati IACUC istituzionali presso SUNY Upstate Medical University.

1. la dissezione del sistema urogenitale (UGS)

Nota: Lo schema è presentato nella Figura 1.

1. Eutanasia di un 3-mese-vecchio maschio C57BL/6 del mouse utilizzando il metodo di eutanasia da inalazione di CO₂ o un'altra tecnica approvata.
   Nota: I topi di età compresa tra i 3 e 12 mesi possono essere utilizzati con successo per l'esperimento. Più vecchi topi (> 6 mesi) molto probabilmente avrà più grasso intorno UGS, che dovranno essere liquidati. Identificazione e separazione dei lobi è spesso difficile nei topi di età inferiore ai 3 mesi. Altri ceppi possono essere utilizzati per l'esperimento, pure.
2. Posizionare il mouse sulla relativa parte posteriore e fissare le paline con perni in modo che il lato ventrale dell'animale è esposto.
3. Etanolo al 70% a spruzzo sull'addome del mouse e pulirlo.
   Nota: Rasatura dei capelli di addome prima dissezione non è necessaria.
4. Sollevare la pelle dall'addome, insieme con lo strato del muscolo, con un paio di medio forcipe smussato e fare un'incisione a forma di Y invertita sull'addome con le forbici.
   1. In primo luogo, fare un'incisione diritta con un paio di forbici affilate da appena sopra il pene allo sterno (Figura 2a).
   2. Tagliare dalla base dell'incisione verso ogni dito del piede, fino alle cosce (Figura 2b). Piegare indietro la pelle su entrambi i lati e in basso per visualizzare l'intera area addominale (Figura 2C-e).
      Nota: La dimensione del taglio varia dipendono il mouse età e le dimensioni. La dimensione dell'incisione diritta iniziale può variare da 1,5 a 4 cm, a seconda delle dimensioni del mouse.
5. Sposta su altri organi per esporre la UGS. Sollevare e spostare gli intestini di giallo-marrone (Figura 2f). Pick up l'adiposità addominale (il tessuto spugnoso bianco opaco) con il forcipe e spostarli ai lati (Figura 2 g).
   Nota: Il UGS comprende le vescicole seminali, uretra, prostata, deferens di ductus (vas deferens) e vescica urinaria. Esso può essere identificato dalla caratteristica coppia di archi semicircolari bianchi opachi (che sono le vescicole seminali), con il sac di fluido-riempita della vescica attaccato alla base. Il tessuto traslucido situato proprio sotto le vescicole seminali è la prostata.
6. Individuare il UGS, tenere saldamente la vescica urinaria con forcipe smussato e sollevare l'intero UGS verso l'alto dall'addome del mouse.
   Nota: Se la vescica è piena, scolarla prima con una piccola siringa per fornire una migliore presa con le pinze e ridurre il rischio di rottura della vescica.
7. Continuando a tirare verso l'alto la vescica, diapositiva un paio di forbici sotto la vescica e la prostata fino alla spina dorsale e fare un taglio. Tagliare eventuali connessioni rimanenti alla cavità addominale (Figura 2 h e 2i). Fare attenzione a non tagliare troppo vicino a UGS per evitare accidentale taglio attraverso tutto il tessuto della prostata.
   Nota: Mentre si effettua il taglio sotto il UGS, le forbici devono essere inserite tutto il senso alla parte posteriore del mouse, così che il taglio si blocca anche la colonna vertebrale. Questo metodo provoca rottura quasi tutte le connessioni tra il UGS e la cavità addominale in un elemento di cattura, riducendo il tempo necessario per estrarre il tessuto dal mouse.
8. Rimuovere il UGS e metterlo in 2-6 mL (sufficiente a coprire il tessuto) di fosfato tampone salino (PBS) o di Dulbecco modificato medium di Eagle (DMEM, alto glucosio) in un 6cm di Petri (Figura 2j e 2K) e spostarlo in un microscopio di dissezione (10 X ingrandimento).
   Nota: Cambiare il supporto per dissezione come richiesto nei passaggi rimanenti.

2. dissezione della prostata

1. Deselezionare tutto il grasso da entrambi i lati, dorsali e ventrali, con un paio di forbici microdissection (Figura 3a) e una pinzetta. Utilizzare strumenti chirurgici simili per il resto del protocollo dissezione.
   Nota: Il grasso è spesso strettamente intrecciato con il UGS (può essere identificato dal suo aspetto spugnoso bianco); quindi, questo passaggio deve essere eseguita con attenzione per evitare la cattura accidentalmente fuori qualsiasi tessuto della prostata. Può richiedere fino a 10-15 min per cancellare tutto il grasso.
2. Tenere e tirare la vescica con il forcipe e snip esso alla base con le forbici (Figura 3b).
3. Posizionare il lato ventrale del tessuto rimanente fino. Tenere un dotto deferente con il forcipe, rintracciare alla base con le forbici e snip (Figura 3C), quindi ripetere su altro lato. Rimuovere i deferens di ductus, ora lasciando dietro la prostata (traslucido e infestati da insetti parassiti), vescicole seminali (opaco e bianco, semicircolare) e l'uretra (tubo rosa-rosso e opaco) (figura 3d e 3e).
4. Inserire la pinza tra l'arco interno dei lobi anteriore tessuto della prostata e vescicole seminali. Indagare separatamente le vescicole seminali e prostata e tagliare qualsiasi tessuto connettivo come necessari (Figura 3f). Tracciare le vescicole seminali alla loro base all'uretra e rimuoverli (Figura 3 g e h 3). Fare attenzione a non forare loro.
5. Procedere a sezionare i singoli lobi della prostata.

3. anatomia macroscopica del Microdissection del lobo della prostata e individuali (figure 3i-n, figura 4)

1. Capovolgere il tessuto con un paio di pinze smussate, in modo che il lato dorsale rivolto verso l'alto, mostrando i lobi dorsali, che saranno simile ali di una farfalla.
2. Raccogliere i lobi dorsali tenendo il lobo con il forcipe e cattura alla base con le forbici (Figura 3j).
3. Capovolgere il tessuto restante al lato ventrale.
4. Raccogliere i lobi laterali, che sono piccoli e di solito avvolgere l'uretra sul lato, che sono incuneate fra i lobi anteriori, ventrali e dorsali (Figura 3 k).
5. Successivamente, raccogliere i lobi ventrali, che sono più grandi di lobi laterali e mentono sull'uretra ventralmente (Figura 3 l).
6. Ultimo, raccogliere i lobi anteriori, il più grande dei quattro, tagliando e scartando l'uretra (Figura 3 m).
7. Elaborare i pezzi di tessuto in base alle esigenze sperimentali. Procedere alla sezione 4 per istologia, o alla sezione 5 per la cultura di sferoide.

4. lobo identificazione e morfologia da ematossilina ed eosina-macchiate diapositive

1. Difficoltà il tessuto della prostata e incorporarlo in paraffina. Procedere con la colorazione i vetrini con ematossilina ed eosina (H & E) per visualizzare e identificare le differenze nei lobi della prostata basati sull'istologia, sfruttando le caratteristiche delineate da Oliveira et al. ¹² (Figura 5).

5. elaborazione del tessuto per cultura 3D¹⁰

Nota: Questo è descritto nella Figura 6.

1. Procedere con la messa in coltura i lobi interi della prostata o individuali secondo le esigenze sperimentali. Trasferire il tessuto della prostata per un piatto di 10 cm, contenente 2-3 mL di DMEM. Con un bisturi, tritare i tubuli della prostata come finemente e uniforme possibile sotto il microscopio di dissezione.
2. Continuare con i passaggi rimanenti sotto una cappa di coltura del tessuto, in condizioni di sterilità.
3. Trasferire i pezzi di tessuto con il DMEM a un tubo da 15 mL e aumentare il volume fino a 9 mL con DMEM. Aggiungere 1 mL di soluzione di riserva della collagenosi x 10 alla miscela di DMEM-tessuto e vortice a mescolare.
   Nota: Soluzione di riserva della collagenosi è 10 mg/mL nel mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e la concentrazione finale nel tubo da 15 mL è 1 mg/mL.
4. Posizionare il tubo su un agitatore rotatorio o tubo di rotatore per 2 ore a 37 ° C, per la collagenosi a degradare la matrice extracellulare.
5. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
6. Scartare il surnatante e risospendere in 2 mL di caldo 0.05% tripsina-EDTA a fendere le adesioni cellula-cellula e cellula-matrice. Il tubo di trasferimento a 37 ° C per 5 min.
   Nota: Se i pezzi di tessuto sono troppo grandi per mescolare bene, tagliare la punta della pipetta con una lama di rasoio per fare un foro più largo.
7. Spezzare qualsiasi tessuto ciuffi di pipettaggio con una pipetta P1000 8 - 10 volte, quindi ripetere con una pipetta P200.
8. Neutralizzare la tripsina con 3 mL di DMEM completo. Aggiungere 500 U di dnaasi io e mescolare bene.
9. Passare attraverso una siringa da 5 mL a 5 - 10 volte con un ago da 18 G. Poi passano attraverso 5 volte con un ago di 20 G.
10. Ripetere i passaggi 4-8 ancora una volta se la soluzione contiene ancora pezzi di tessuto grande.
11. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro di 40 μm collocato su un tubo da 50 mL. Sciacquare il tubo da 15 mL con 5 mL di DMEM e passare attraverso lo stesso filtro. Ripetere il risciacquo.
12. Gettare il filtro e centrifugare la provetta contenente il flusso continuo a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente.

6. placcatura e coltura delle cellule

1. Risospendere il pellet in 0,5 mL di completo prostata epiteliale delle cellule crescita medio (PrEGM). Contare la densità delle cellule utilizzando un contatore di cellule o emocitometro e diluire le cellule a 5 x 10⁵ cellule/mL in PrEGM completa.
   Nota: La resa da una prostata intera 3-mese-vecchio mouse può variare da 3 x 10⁵-10⁶ cellule. Quindi, è importante inizialmente risospendere il pellet in non più di 0,5 mL di PrEGM (come detto sopra) in modo che la densità di cella desiderata può essere raggiunto, anche con basso rendimento.
2. Mix il volume richiesto di cellule con la membrana basale ECM in un rapporto di volume (membrana dello scantinato 60% ECM e 40% sospensione cellulare) e piastra in un piatto multi-pozzetto o diapositiva camera secondo le esigenze sperimentali a 2:3.
   Nota: Per l'immunocolorazione, piastra sulle piastre di fondo di vetro o diapositive di camera, che copre l'intero bene o centrale del pozzo. La piastra intorno al bordo del pozzo se contiamo il organoids risultante, o piastra come diverse goccioline tutto il pozzo se maggiori volumi di placcatura. Prestare attenzione a non diffonderlo troppo spesse o troppo sottili. Piastra di almeno 100 µ l di miscela di cella di matrice per 1 cm² di placcatura zona; ad esempio, in una diapositiva di camera con una 2 cm²-superficie ben, 200 µ l di miscela di cella di matrice contenente cellule 5 x 10⁴ dovrebbe essere placcato.
3. Trasferire la piastra/diapositiva in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂ per 30 min per la membrana dello scantinato ECM a solidificare. Quindi, aggiungere PrEGM completa pre-riscaldato per coprire il pozzo, facendo attenzione a non per disturbare la spina della membrana dello scantinato ECM.
4. Rimuovere la metà dei media e Aggiungi media freschi ogni 2-3 giorni. Crescono gli sferoidi per 5-10 giorni.
5. Procedere con la raccolta (passaggio 7), immunostaining (passaggio 8), e/o imaging per applicazioni a valle.

7. le sfere di raccolta

1. Per raccogliere le sfere, aspirare con cura il supporto senza disturbare la spina del gel della membrana dello scantinato ECM e aggiungere 1 mL di soluzione di dispase di 1 mg/mL in PrEGM a 100 µ l della membrana dello scantinato ECM.
   Nota: È più facile raccogliere sferoidi se sono placcati in mezzo il pozzo o il cerchio (invece di coprire l'intero pozzo), per garantire che un'adeguata quantità della soluzione dispase possono essere aggiunti al pozzo.
2. Raschiare il fondo del piatto con un raschietto di cella per sollevare e rimuovere il gel della membrana dello scantinato ECM nella soluzione dispase-PrEGM.
3. Pipetta l'intera soluzione su e giù per una volta con un ampio foro puntale 1000 µ l o pipetta 5ml per spezzare la spina di gel in pezzi più piccoli.
   Nota: Tagliare la punta di un puntale di 1000 µ l con una lama di rasoio per rendere un ampio foro punta.
4. Incubare in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂ per 1-2 h fino a sciogliere completamente la membrana dello scantinato ECM.
   Nota: Questo può essere assicurato mediante ispezione visiva del fondo del pozzo mentre inclinando la piastra per confermare che non rimangono ulteriori blocchi di gel.
5. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
6. Centrifugare le sfere a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente e continuare con applicazioni a valle.

8. Immunostaining delle sfere¹³

Nota: Dopo sferoidi sono cresciuti per il periodo di tempo desiderato, la membrana dello scantinato ECM può essere sciolto e sfere possono essere macchiate come descritto in Colicino et al. ¹³.

1. Brevemente, sciacquare le culture con PBS e aggiungere 4% paraformaldeide (PFA) direttamente alla membrana basale ECM gel spina. Incubare per 30-90 min a temperatura ambiente con agitazione lenta, fino a quando la membrana dello scantinato ECM sia completamente dissolto, sostituendo PFA fresco ogni 30 min.
   Nota: Il PFA sarà sciogliere la spina di gel e difficoltà sferoidi durante questo processo.
2. Successivamente, lavare con PBS 3 volte e aggiungere 50 mM cloruro di ammonio per 10 min placare qualsiasi autofluorescence da PFA. Ripetere per 3 lavaggi con PBS.
3. Permeabilize con 0,1% detergente non ionico per 5 min e blocco con PBSAT (PBS, BSA 1%, 0,5% Triton X-100) per 30 min.
4. Incubare con un anticorpo primario in PBSAT durante la notte a 4 ° C, seguita da 3 lavaggi con PBSAT e un anticorpo secondario in PBSAT per 2 h a temperatura ambiente.
5. Ripetere i lavaggi con PBSAT e macchia con DAPI secondo il protocollo del produttore, se lo si desidera. Lavare 3 o più volte con PBS.
6. Aggiungere PBS con reagente antifade di 200 mM 1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano (DABCO) e procedere a imaging.

Risultati

I lobi della prostata del mouse possono essere identificati e sezionato utilizzando le loro posizioni per quanto riguarda le vescicole seminali e l'uretra. La prostata del topo è composto da 4 paia di lobi situati dorsalmente e ventralmente alle vescicole seminali e uretra. Figura 4a e 4b (in alto) mostrano la vista dorsale e ventrale della prostata intatta, insieme con le vescicole seminali e l'uretra. I pannelli di fondo (

Discussione

Questa carta descrive i metodi per la dissezione della prostata del mouse e l'identificazione dei singoli lobi. È anche descritto il protocollo per coltura in una cultura 3D per l'analisi in vitro delle cellule della prostata del mouse.

Un passo fondamentale nel protocollo di dissezione è raccolta l'intera UGS fuori il mouse (1) e separando i singoli organi sotto un microscopio di dissezione. Il tessuto della prostata è molto piccola e circondata dal resto del UGS; così, è pratic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C