Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Özet

Genetik fareler prostat kanseri mekanizmaları araştıran için yararlı modellerdir. Burada bir fare ürogenital sistemden prostat loblar incelemek, Histoloji üzerinde göre ayırt etmek ve yalıtmak ve pulcuklarının aşağı akım analizleri için olarak birincil Prostat hücreleri vitro kültür için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Genetiği fare modelleri (GEMMs) en tip-in insan kanser, prostat kanseri (PCa) dahil olmak üzere araştırma için etkili önceden klinik modelleri olarak hizmet vermektedir. Anatomi ve histoloji fare prostat anlama, hayvan tür modeller uygun karakterizasyonu ve verimli kullanım için önemlidir. Fare prostat dört ayrı çift lob, her biri kendi özellikleri vardır. Bu makalede, diseksiyon uygun yöntem ve fare prostat lob hastalığı analiz için kimlik gösterilir. Sonrası diseksiyon, prostat hücreler kültürlü vitro mekanik anlamak için daha fazla olabilir. Fare beri prostat primer hücre normal özellikleri kaybolur gideriz ne zaman kültürlü vitro, biz anahat burada hücreleri izole ve onları fizyolojik korumak için etkili olduğu 3D küresel kültürler büyüyen bir yöntem hücre özellikleri. Bu 3D kültürler hücre morfolojisi ve değiştirilmiş davranışı soruşturma fizyolojik koşullarda düzeyleri ve yerelleştirmeler anahtar proteinlerin ve yollarının geliştirilmesinde rol ve hastalığın ilerleme çözümlemek ve bakmak için kullanılabilir ilaç tedavileri için yanıt.

Giriş

Bilimsel topluluk yıllardır insan kanseri gelişiminin karmaşık mekanizma aydınlatmak kurmaya çalışıyor. Oysa potansiyel anahtar oyuncular ve uyuşturucu hedefleri tanımlaması hasta hücre ve doku çalışmaları ile başlar, translasyonel uygulama gibi bulgular genelde önceden klinik hayvan modelleri kullanılmasını gerektirir. Genetik fareler modelleri (GEMMs) modeli insan kanser için fare modelleri, insan kanser Konsorsiyumu (ncı-MMHCC), hangi tarif ve fare kanser özellikleri birleştirmek için aranan bir komite kurulması beri sayısı giderek kullanımı modeller için bilim adamları Dünya çapında^1,2. Fare modelleri mekanik çalışmalar kanser gelişme, ilerleme, yanıt-e doğru tedaviler, anlamak için çoğu türleri önceden klinik çalışmalarda ihtiyacını yerine getirmek ve direnç³satın aldı.

Prostat kanseri erkeklerde her yıl⁴üzerinde 160.000 erkekleri etkileyen en sık meydana gelen kanserdir. Hastalığın agresif formlarını on binlerce her yıl hayatını iddia. Ancak, hastalık progresyon mekanizma hala kötü anlaşılmaktadır. Etkili tedavi seçenekleri Gelişmiş ve metastatik prostat kanseri, yüksek ölüm oranı gelişmiş prostat kanseri hastalar⁴kanıtladığı gibi ciddi bir eksikliği sonuçlanır. Bu nedenle, prostat kanseri eğitim önceden klinik modeller için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Bar Harbor sınıflandırma sistemi fare histopatolojik değişikliklerin anahatları 2004 ' te kullanılmaya başlanan kadar ancak, fare ve insan prostat arasında içsel farklılıklar nedeniyle modelleme GEMMs prostat kanserinin popülerlik elde değil Prostat genetik manipülasyon, neoplastik değişiklikler tanımlaması ve insanlar⁵ilerlemesinde kanseri aşamaları onların ilişkisi üzerine. Bir önemli herhangi bir prostat et modeli eğitim sırasında dikkate alınması gereken fare prostat özelliğidir lob dört ayrı çift varlığı: ön, yan, ventral ve dorsal. Loblar histopatoloji ve gen ifade deseni⁶önemli farklılıklar mevcut. Probasin protein ifade deseninin Cre tabanlı et modelleri çoğunlukla tasarlanmıştır beri hangi probasin tabanlı promotor kullanarak Pb-Cre4⁷adı verilen düşünülmelidir genç sonrası ergenlik fareler⁷, loblar arasında değişebilir. Cre ifade kez ortaya çıkan kayma ve temporal farklılıkları tümör başlama ve ilerleme zaman çizelgeleri farklılıkları yanı sıra neoplastik değişiklikler farklılıkları loblar arasında yol. Bu nedenle, tümör geliştirme prostat GEMMs okurken bu tür farklılıklar için hesap önemlidir ve bireysel loblar tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ayrı ayrı değerlendirilmesi gerekebilir. Bu makalenin ilk bölümünde bir fare prostat incelemek, tanımlamak ve her lob ayırmak ve loblar histolojik farklılıkları tanımak için uygun yöntemleri açıklar.

Tümör büyüme ve histopatoloji Analizi değerli tümör geliştirme kazandırabileceğini iken, onlar moleküler mekanizmaları hakkında çok fazla bilgi vermeyin. Tümör gelişimi ve ilerlemesi mekanizması çalışmaya, genellikle tümör hücreleri içinde vitroanaliz etmek yararlı olduğu. Birkaç yöntem süspansiyon kültürler, 3D kültürler⁸ de dahil olmak üzere bu hücreleri kültürleri içeren yıllar içinde tavsiye ettiler ve son zamanlarda, normal 2D⁹kültürler. Bu yöntemlerin çoğu iyi hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı fiyatlarına neden ise 3D kültürler için fizyolojik şartlarda en yakın olan bir ortam sağlamak. Membran hücre dışı matriks (ECM) içinde yetiştirilen 3D veya küresel kültürlerde tamamen farklı luminal hücreleri genellikle çok düşük sağkalım oranı var; Ancak, Bazal ve orta düzey hücreleri (çoğunlukla kök hücre) yayar ve pulcuklarının¹⁰denilen hücre kümeleri oluşturmak edebiliyoruz. Epitel kanser kök hücreleri (halk kanser kök hücreleri da bilinen)¹¹' den kaynaklanan inanılıyor bu yana bu bir kanser çalışma için uygun yapar. Bu iletişim kuralı ikinci bölümü 3D kültürlerde fare prostat hücre kültürü çalışmalarının bir yöntem açıklanır. Elde edilen küreler aşağı akım analizleri, insan organoid Morfoloji ve canlı hücre, farklı proteinler için boyama ayirt Imaging davranışı ve kemoterapötik yanıtlarını çalışmanın da dahil olmak üzere çeşitli türleri için kullanılabilir tedaviler.

Genel olarak, bu iletişim kuralının amacı fare prostat anatomi ve diseksiyon teknikleri ve küresel kültür ve vitro analiz için doku işleme açıklayarak prostat kanserinde fare modelleri kullanmak için en iyi yöntemleri anahat etmektir .

Protokol

Burada açıklanan tüm fare deneyleri kurumsal IACUC onaylı protokolleri SUNY şehir dışında Tıp Üniversitesi'nde özetlenen yönergelere göre yapıldı.

1. ürogenital sistem (UGS) diseksiyon

Not: Şematik resim 1' de sunulmuştur.

1. CO₂ inhalational ötenazi yöntemi veya başka bir onaylanmış teknik kullanarak 3 aylık erkek C57BL/6 fare ötenazi.
   Not: Fareler 3 ve 12 ay yaşları arasında başarılı bir şekilde deneme için kullanılabilir. Büyük fareler (> 6 ay) en büyük olasılıkla temizlenmesi gerekir UGS etrafında daha fazla yağ olacak. Kimlik ve loblar birbirinden ayrılması zor kez farelerde 3 aydan daha genç. Diğer suşların deneme için de kullanılabilir.
2. Sırtında fareyi getirin ve hayvan ventral tarafında maruz iğne kullanılarak bacaklar güvenli.
3. % 70 etanol fare'nın karnına sprey ve temizle.
   Not: diseksiyon gerekli değildir önce karın saç tıraş.
4. Kas tabakası ile birlikte karın derisini orta künt forseps bir çift ile Asansör ve makas kullanarak karnına bir ters Y şeklinde kesi yapmak.
   1. Önce göğüs kemiği (Şekil 2a) için hemen penis üzerinde keskin makas ile düz bir kesi yapılır.
   2. Belgili tanımlık kesme doğru uyluk (Şekil 2b) kadar her ayak tabanından kesti. Geri cilt her iki tarafta ve tüm karın bölgesi (Şekil 2 c-e) görüntülemek için alt kat.
      Not: Kesim boyutu değişir fare yaş ve boyutu bağlıdır. Belgili tanımlık ilk düz kesme boyutu 1,5 dan fare büyüklüğüne bağlı olarak 4 cm alanı.
5. UGS ortaya çıkarmak için diğer organlar üzerinde hareket. Asansör ve kahverengi-sarı bağırsak (Şekil 2f) taşıyın. Forseps ile karın yağ yastıkları (opak beyaz süngerimsi doku) almak ve iki taraf (Şekil 2 g) taşıyın.
   Not: UGS seminal veziküller, üretra, prostat, duktus deferens (vas deferens) ve idrar kesesi oluşmaktadır. Opak beyaz yuvarlak kemerli, (ki seminal veziküller) karakteristik çifti tarafından tabanına bağlı sıvı dolu mesane sac ile belirlenebilir. Prostat, seminal veziküller hemen altında yer alan yarı saydam dokudur.
6. UGS bulun, sıkıca mesane künt forseps ile tutun ve tüm UGS fare karın üzerinden yukarı doğru kaldırın.
   Not: mesane dolu ise, ilk forseps ile daha iyi bir tutuş sağlar ve mesane parçalanma riskini azaltmak için küçük bir şırınga ile boşaltmak.
7. Mesane, omurga, slayda makas prostat ve mesane altında sonuna kadar yukarı çekin ve bir kesim yapmak devam. Karın boşluğu (Şekil 2 h ve 2i) için kalan herhangi bir bağlantıyı kesti. Çok yakın UGS herhangi bir prostat doku ile yanlışlıkla kesme önlemek için kesmemeye dikkat et.
   Not: böylece kesme vertebral sütunun de enstantane UGS altında kesim yaparken, makas ta fareyi, arkasına doğru takılmalıdır. Bu yöntem neredeyse tüm UGS ve bir parça fare dokuya ayıklamak için gereken süreyi azaltarak, karın boşluğunda arasında bağlantı kesilmesinin sonuçlanır.
8. UGS çıkarın ve 2-6 mL (yeterli doku kapsayacak şekilde) yerleştirin fosfat tuz (PBS) arabelleğe alınmış veya Dulbecco'nın kartal Orta (DMEM, yüksek glikoz) 6 cm Petri kabına (2j anlamaya ve 2 k) değiştiren ve diseksiyon mikroskop (10 X için hareket büyütme).
   Not: diseksiyon medya kalan adımları gerektiği gibi değiştirin.

2. prostat anatomi

1. Her iki taraftan dorsal ve ventral iyi forseps ve mikrodiseksiyon makas (Şekil 3a) bir çift ile tüm yağ temizleyin. Benzer cerrahi aletler diseksiyon protokolü için kullanabilir.
   Not: Yağ kez yakından (beyaz süngerimsi görünümünü tarafından tanımlanabilir) UGS ile dolaşık; Bu nedenle, bu adımı yanlışlıkla herhangi bir prostat doku kırpma önlemek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. O kadar tüm yağ temizlemek için 10-15 dk sürebilir.
2. Tutun ve mesane forseps ile çekin ve makasla (Şekil 3b) vasıl belgili tanımlık temel kesik.
3. Kalan doku ventral yan yerleştirin. Bir duktus deferens forseps ile tutun, makasla, üsse izini ve makasla kesme bu (Şekil 3 c), sonra diğer tarafta tekrarlayın. Şimdi prostat (yarı saydam ve solucan), seminal veziküller bırakarak duktus deferens kaldırmak (opak ve beyaz, doğusu) ve üretra (pembe-kırmızı ve opak tüp) (şekil 3d ve 3e).
4. Forseps seminal veziküller ve prostat doku ön lob iç kemer arasında yerleştirin. Ayrı seminal veziküller Gözetlemek ve prostat ve gerekli (Şekil 3f) olarak herhangi bir bağ dokusu makasla kesme. Kendi tabanına üretra, seminal veziküller izlemek ve bunları (Şekil 3 g ve 3 h) kaldırın. Onları delmek değil dikkatli olun.
5. Bireysel prostat loblar incelemek için devam edin.

3. (rakamlar 3i-e-n, Şekil 4) prostat ve bireysel lob mikrodiseksiyon Gross anatomi

1. Böylece bir kelebeğin kanatları benzer dorsal loblar gösterilen, dorsal yüzü dönük doku künt forseps bir çift ile fiske vurmak.
2. LOB forseps ile tutarak ve makas ile (Şekil 3j) vasıl belgili tanımlık temel kırpma dorsal loblar toplamak.
3. Ventral tarafında kalan doku üzerinde ters çevirin.
4. Küçük yan loblar toplamak ve genellikle üretra tarafında, hangi ön, ventral ve dorsal loblar (Şekil 3 k) arasında sıkışmış sarın.
5. Ardından, hangi yan loblar büyüktür ve üretra üzerinde ventrally yalan ventral loblar toplamak (Şekil 3 l).
6. Son, anterior loblar, en büyük kesme ve üretra (Şekil 3 m) atarak tarafından dört, hasat.
7. Doku parçaları deneysel ihtiyaçlarına göre işlem. Bölüm 4 Histoloji için veya bölüm 5 küresel kültür için devam edin.

4. lob kimlik ve morfoloji Hematoksilen ve eozin lekeli slaytlar

1. Prostat doku tamir ve parafin içinde embed. Hematoksilen eozin (H & E) görüntülemek ve prostat loblar histoloji, Oliveira ve arktarafından özetlenen özellikleri kullanılarak temel farklılıkları belirlemek için ile slaytlar boyama ile devam edin. ¹² (Şekil 5).

5. doku 3D kültür¹⁰ işleniyor

Not: Bu Şekil 6' da gösterilmiştir.

1. Deneysel ihtiyaçlarına göre bütün prostat veya bireysel loblar kültürü ile devam edin. Prostat doku DMEM 2-3 mL içeren bir 10 cm çanak aktarın. Bir neşter ile ince ve diseksiyon mikroskop altında mümkün olduğunca eşit olarak prostat tübüllerin kıyma.
2. Steril koşullarda bir doku kültürü başlık altında kalan adımlarla devam edin.
3. Doku parçaları ile birlikte DMEM 15 mL tüp aktarmak ve ses DMEM ile 9 ml arttırmak. 1 mL 10 x collagenase stok çözeltisi DMEM-doku karışımı ve girdap karışımı ekleyin.
   Not: Collagenase hisse senedi çözüm 10 mg/mL Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta ise 15 mL tüp son konsantrasyonu 1 mg/mL.
4. Tüp üzerinde gyratory bir shaker yerleştirin veya rotator hücre dışı matriks düşer collagenase için 37 ° C'de 2 h için tüp.
5. 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi.
6. Süpernatant atın ve 2 mL sıcak % 0.05 tripsin EDTA hücre-hücre ve hücre-matris yapışıklıklar ayırmak için resuspend. Tüp 37 ° C 5 min için transfer.
   Not: doku parçaları karıştırın kadar büyük iseniz, pipet ucu daha geniş bir delik yapmak için bir tıraş bıçağı ile kesti.
7. P1000 pipet ile 8 - 10 kez pipetting, o zaman P200 pipet ile yinelenen tarafından herhangi bir doku kümeleri kadar break.
8. Tripsin tam DMEM 3 mL ile etkisiz hale getirin. 500 DNAase U eklemek ben ve iyi karıştırın.
9. 5 mL şırınga ile 5 - 10 kat 18 G iğne ile geçmek. Sonra 5 kez bir 20 G iğne ile geçer.
10. Çözüm hala büyük doku parçaları içerir 4-8 bir kez daha yineleyin.
11. Filtre bir 40 mikron filtre aracılığıyla hücre süspansiyon bir 50 mL tüp yerleştirilir. 15 mL tüp DMEM 5 mL ile durulayın ve aynı filtreden geçmek. Durulama yineleyin.
12. Filtre atın ve akışı ile 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de içeren tüp santrifüj kapasitesi.

6. kaplama ve hücre kültürü çalışmalarının

1. Pelet 0.5 mL tam prostat epitel hücre büyüme orta (PrEGM) resuspend. Bir hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücre yoğunluğu saymak ve 5 x 10⁵ hücre/mL tam PrEGM hücrelere oranında seyreltin.
   Not: Bir 3-ay-yaşlı fare tüm prostat dan verim 3 x 10⁵-10⁶ hücrelerden arasında olabilir. Bu nedenle, başlangıçta istenen hücre yoğunluğu, hatta düşük verim ile elde edilebilir (yukarıda belirtildiği gibi) en fazla 0.5 ml PrEGM Pelet resuspend önemlidir.
2. Mix gerekli birim hücre membran ECM 2:3 hacim oranı (% 60'ı membran ECM ve % 40 hücre süspansiyon) ve çok iyi plaka veya odası slayt deneysel ihtiyaçlarına göre plaka ile.
   Not: İmmunostaining, cam-alt plakalar veya odası slaytlar, plaka için tüm iyi veya iyi orta kapsayan. Kuyunun ağız ortaya çıkan organoids sayma Eğer plaka veya daha yüksek birimleri kaplama Eğer her yerinde iyi birkaç damlacıkları plaka. Çok kalın veya çok ince değil yaymaya daha dikkatli ol. En az 100 µL alan kaplama, 1 cm² başına matris hücresine karışımı plaka; Örneğin, bir 2 cm²odası slaytta yer-de yüzey alanı, 5 x 10⁴ hücreleri içeren matris hücresine karışımı 200 µL kaplama.
3. Plaka/slayt membran ECM kuvvetlendirmek için 30 dk için bir 37 ° C kuluçka makinesi-%5 CO₂ ile aktarın. Sonra önceden ısıtılmış tam PrEGM membran ECM tak bozmamaya dikkat çekici şey, kapsayacak şekilde ekleyin.
4. Medya yarısı kaldırın ve 2-3 günde taze medya ekleyin. Pulcuklarının 5-10 gün boyunca büyümeye.
5. (7. adım), immunostaining (adım 8) hasat ve/veya görüntüleme için downstream uygulamalarında ile devam edin.

7. hasat küreler

1. Küreler hasat için medya dikkatle membran ECM jel tak bozmadan Aspire edin ve 1 mL 1 mg/mL dispase çözeltisi içinde PrEGM membran ECM 100 µL ekleyin.
   Not: Eğer onlar iyi veya RIM (yerine kapsayan tüm iyi) ortasında kaplama pulcuklarının hasat kolaydır dispase çözüm yeterli miktarda kuyuya eklenebilir emin olmak için.
2. Alt plaka membran ECM jel dispase-PrEGM çözüm içine kapalı kaldırmak için hücre sıyırıcı ile kazı.
3. 1000 µL pipet ucu veya jel tak daha küçük parçalara bölmek için 5 mL pipet pipet bir kez geniş bir ile yukarı ve aşağı tüm çözüm taşıyordu.
   Not: geniş geçişli bahşiş yapmak bir tıraş bıçağı ile 1000 µL pipet ucu ucu kesilmiş.
4. Membran ECM tamamen çözülmüş kadar 1-2 h için % 5 CO₂ bir 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
   Not: Bu jel yok daha fazla boyutta kalmasını onaylamak için plaka eğerek süre görsel denetim iyi alt tarafından sağlanmış olur.
5. 15 mL konik tüp hücre süspansiyon toplamak.
6. Küreler 250 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve aşağı akım uygulamalar ile devam eder.

8. Immunostaining küre¹³

Not: pulcuklarının istediğiniz süreyi için büyüdü sonra membran ECM çözünmüş ve küreler Colicino vd içinde açıklandığı gibi boyanabilen ¹³.

1. Kısaca, PBS kültürlerle durulayın ve doğrudan membran ECM jel fiş %4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Membran ECM tamamen taze PFA her 30 dk yerine eriyene kadar yavaş sallayarak ile Oda sıcaklığında 30-90 dk için kuluçkaya.
   Not: PFA jel tak dağıtılması ve bu işlem sırasında pulcuklarının düzeltmek.
2. Ardından, PBS 3 kez ile yıkayın ve 50 mM amonyum klorür PFA üzerinden herhangi bir autofluorescence gidermek için 10 dakika için ekleyin. PBS ile 3 yıkama için yineleyin.
3. 5 dk ve PBSAT ile blok için %0,1 non-iyonik deterjan ile permeabilize (PBS, % 1 BSA, % 0.5 Triton X-100) 30 dk için.
4. Gecede 4 ° C'de PBSAT ve oda sıcaklığında 2 h için ikincil bir antikor PBSAT içinde 3 yıkar ardından, PBSAT içinde birincil bir antikor ile kuluçkaya.
5. PBSAT ile yıkama ve leke DAPI ile üreticinin protokole göre istenirse yineleyin. 3 veya daha fazla kez PBS ile yıkayın.
6. PBS ile 200 mM 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) antifade reaktif ekleyin ve görüntüleme için devam edin.

Sonuçlar

Fare prostat loblar belirlenebilir ve seminal veziküller ve üretra ile ilgili konumlarını kullanarak disseke. Fare prostat 4 çift seminal veziküller ve üretra lob dorsally yer alan ve ventrally oluşur. Şekil 4a ve 4b (ilk) olduğu gibi prostat, seminal veziküller ve üretra ile birlikte dorsal ve ventral görünümlerini göstermek. (Şekil 4 c ve 4 d) alt paneller için kimlik özetlen...

Tartışmalar

Bu kağıt fare prostat diseksiyon ve bireysel loblar tanımlaması için yöntemleri özetlenmektedir. Ayrıca fare Prostat hücreleri vitro analiz için 3D bir kültür kültür protokolüdür.

Bir kritik diseksiyon Protokolü (1) fare dışında tüm UGS hasat ve diseksiyon mikroskop altında bireysel organları ayıran adımdır. Prostat doku çok küçük ve UGS geri kalanı ile çevrili; Böylece, tüm dört çift lob sağlam tedarik ederken doğrudan doğruya--dan vücut boşlu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C