식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

요약

유전자 조작된 생쥐 전립선 암 메커니즘을 조사를 위해 유용한 모델이 있습니다. 여기를 식별 하 고 마우스 비뇨 생식 기 시스템에서 전립선 엽 해 부, 조직학에 따라 구분 하 고 분리 다운스트림 분석에 대 한 spheroids로 기본 전립선 세포에는 생체 외에서 문화 프로토콜 선물이.

초록

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 인간의 암, 전립선 암 (PCa) 등의 대부분의 종류를 조사에 대 한 효과적인 전 임상 모델 역할을 합니다. 해부학 및 조직학 마우스 전립선의 이해 하는 것이 효율적인 사용과 같은 동물 모델의 적절 한 특성에 대 한 중요 합니다. 마우스 전립선 엽 각각 그들의 자신의 특성의 4 가지 쌍 있다. 이 문서에서는 적절 한 해 부 방법 및 질병 분석에 대 한 마우스 전립선 엽의 식별 합니다. 후 해 부, 전립선 세포 배양 체 외에 기계적 이해에 대 한 추가 될 수 있습니다. 마우스부터 전립선 1 차 셀 그들의 일반적인 특성을 잃게 하는 경향이 때 교양 생체 외에서우리는 개요 여기 세포를 분리 하 고는 생리 보존에 대 한 효과 3D 회전 타원 체 문화로 그들을 성장 하는 방법 셀의 특성입니다. 이러한 3D 문화 세포 형태학 및 조사 근처 생리 적 조건에서 동작 변경 수준 및 주요 단백질 및 경로 개발에 참여의 지 방화는 질병의 진행을 분석 및 보고에 사용할 수 있습니다. 약물 치료에 응답 합니다.

서문

사회 과학 수십 년 동안 인간의 암 개발의 복잡 한 메커니즘을 명료 하 게 시도 되었습니다. 반면 잠재적인 핵심 선수 및 마약 대상 환자 세포와 조직 연구 시작, 종종 이러한 결과의 변환 응용 프로그램 전 임상 동물 모델의 사용을 해야 합니다. 유전자 조작된 생쥐 모델 (GEMMs) 모델 인간의 암 마우스 모델의 인간 암 컨소시엄 (NCI-MMHCC), 설명 및 마우스 암의 특성을 통합 하는 위원회의 설립 이후 꾸준히 상승 했다의 사용 과학자 들은 전세계^1,2에 대 한 모델. 마우스 모델 개발, 진행, 치료에 응답을 이해 하기 위한 암 대부분의 종류의 전 임상 연구에서 기계 론 적인 연구에 대 한 필요성을 충족 하 고 저항³인수.

전립선 암은 남성, 모든⁴이상 160000 남자에 영향을 미치는 가장 일반적으로 발생 한 암이 이다. 적극적인 형태의 질병 생활 매년 수천 수만의 주장. 그러나, 질병의 진행의 메커니즘은 여전히 가난 하 게 이해 된다. 고급 전립선 암 환자⁴에서 높은 사망 율 알 수 있듯 고급 및 전이성 전립선 암에 대 한 효과적인 치료 옵션의 심각한 부족을 발생합니다. 따라서, 전립선 암 연구를 전 임상 모델에 대 한 필요성이 있다. 그러나, 마우스 및 인간의 전립선 사이의 고유의 차이 때문 GEMMs에 전립선 암의 모델링 얻지 않았다 인기 바 하버 분류 시스템 마우스 histopathological 변화를 설명 하는 2004 년에 도입 되었다 때까지 유전자 조작, 종양 약 변경, 식별 및 인간⁵암 진행의 단계에 그들의 관계의 전립선 어떤 전립선 GEMM 모델을 공부 하는 동안 고려 사항으로 수행 해야 하는 마우스 전립선의 하나의 중요 한 특징은 네 가지 쌍 돌출부의 존재: 전방, 측면, 복 부와 등 쪽. 돌출부는 histopathology 및 유전자 표현 패턴⁶에 큰 차이가 존재. Probasin 단백질 식 패턴 젊은 포스트 사춘기 마우스⁷, 고려 되어야 한다 Cre 기반 GEMM 모델은 주로 설계 되었습니다 이후 Pb-Cre4⁷라고 probasin 기반 promotor를 사용 하 여에 돌출부 사이의 달라질 수 있습니다. 종종 Cre 식에서 결과 공간 및 시간 차이 이어질 종양 약 변화에 차이 뿐 아니라 종양 개시 및 진행 타임 라인에 차이 돌출부 사이. 따라서, GEMMs, 전립선에서 종양 개발을 공부 하는 동안 이러한 차이 담당 하는 것이 중요 하다 고 개별 돌출부 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 평가 될 필요가 있습니다. 이 문서의 첫 번째 부분에는 마우스 전립선의 해 부, 식별 하 고 각 엽, 별도 돌출부 사이 조직학 차이 인식 적절 한 방법을 설명 합니다.

종양의 성장 및 histopathology 분석 종양 개발에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 그들은 분자 메커니즘에 대 한 많은 정보를 제공 하지 않습니다. 공부 하 고 종양의 개발 및 진행의 메커니즘, 그것은 종양 세포 생체 외분석 종종 유용 합니다. 서 스 펜 션 문화, 3D 문화⁸ 을 포함 하 여 이러한 셀의 문화를 포함 하는 수 년에 걸쳐 여러 가지 방법이 제안 되었습니다 그리고 최근에, 일반 2D 문화⁹. 반면 이러한 메서드의 대부분 좋은 세포 생존 및 확산 속도 결과, 3D 문화 생리 적 조건에 가장 가까운 환경을 제공 합니다. 3D 또는 회전 타원 체 문화는 지하실 막 세포 외 기질 (ECM)에서 성장, 완전히 차별화 된 luminal 세포는 일반적으로 매우 낮은 생존 율을; 있다 그러나, 기초 및 중간 세포 (주로 줄기 세포) 라는 spheroids¹⁰셀 클러스터를 생산 하 고 전파 수 있습니다. 이것은 그것 암 연구에 대 한 적합 한 이후 상피 암 줄기 세포 (암 줄기 세포로 널리 알려져 있는)¹¹에서 발생 한 것으로 추정 된다. 이 프로토콜의 두 번째 부분 3D 문화에 마우스 전립선 세포를 배양 하는 방법을 설명 합니다. 결과 분야 organoid 형태학 및 라이브 셀 이미징, 면역 형광 검사 다른 단백질에 대 한 얼룩으로 행동의 연구 및 화학요법에 대 한 응답의 연구를 포함 하 여 다운스트림 분석의 여러 종류에 사용할 수 있습니다. 치료입니다.

전반적으로,이 프로토콜의 목표는 마우스 전립선의 해부학 및 해 부 기술 및 회전 타원 체 문화 및 생체 외에서 분석을 위한 조직 처리를 설명 하 여 전립선 암에서 마우스 모델을 사용 하기 위한 최적의 방법 개요 .

프로토콜

여기에 설명 된 모든 마우스 실험 SUNY Upstate 의학 대학에서 기관 IACUC 승인 프로토콜에 명시 된 지침에 따라 수행 했다.

1. 비뇨 생식 기 시스템 (UGS) 해 부

참고: 회로도 그림 1에 표시 됩니다.

1. CO₂ inhalational 안락사 메서드 또는 다른 승인 된 기술을 사용 하 여 3 개월 남성 C57BL/6 마우스 안락사
   참고: 3과 12 개월의 나가 사이 쥐 실험을 위해 성공적으로 사용할 수 있습니다. 이전 마우스 (> 6 개월) 대부분 맑게 될 필요가 있을 것 이다 UGS 주위에 더 많은 지방을 해야한다. 식별 및 돌출부의 분리는 종종 3 개월 보다 젊은 쥐에서 어려운. 다른 긴장 실험, 또한을 위해 사용할 수 있습니다.
2. 그것의 뒤에 마우스를 놓고 동물의 복 부 측 노출 되도록 핀을 사용 하 여 다리를 확보 합니다.
3. 마우스의 복 부에 70% 에탄올을 스프레이 하 고 그것을 깨끗 하 게 닦아.
   참고: 절 개는 필요 하지 않습니다 하기 전에 복 부 머리를 면도.
4. 중간 무딘 집게의 쌍에서 복 부 근육 층과 함께 피부를 들어올려 고 거꾸로 Y 자 모양의 절 개가 위를 사용 하 여 복 부에.
   1. 첫째, 날카로운가 위에서 음 경 바로 위의 (그림 2a) 흉 골을 절 개를 직선 만들.
   2. 허벅지 (그림 2b)까지 각 발가락 쪽으로 절 개의 기지에서 잘라. 접어 다시 피부 양쪽에 및 전체 복 부 지역 (그림 2 c-e)을 보려면 아래에서.
      참고: 컷된 크기 변화 한다 마우스 나이 및 크기에 따라 달라 집니다. 초기 직선 절 개 크기는 마우스의 크기에 따라 4 cm 1.5에서 범위 수 있습니다.
5. UGS를 노출 하는 다른 장기 위로 이동 합니다. 리프트와 브라운-노란색 창 자 (그림 2f) 이동. 집게와 복 부 지방 패드 (불투명 백색 해 면 조직)을 선택 하 고 (그림 2 g) 양쪽에 이동.
   참고:는 UGS 정액 소포, 요도, 전립선, ductus 정 관 (vas deferens), 및 오 줌 방광의 구성 되어 있습니다. 그것은 기본에 연결 된 액체가 채워진 방광 sac와 불투명 흰색 반원형 아치 (이 정액 vesicles), 특성 쌍에 의해 식별할 수 있습니다. 정액 소포 아래 오른쪽에 있는 반투명 조직 전립선 이다.
6. UGS, 단단히 무뚝뚝한 겸 자, 오 줌 방광 잡고 찾아서 마우스 복 부 위쪽에서 전체 UGS를 들어올립니다.
   참고: 경우 방광이 가득, 드레인 그것 먼저 하는 집게와 함께 더 나은 그립을 제공 하 고 방광 파열의 위험을 줄일 작은 주사기.
7. 계속 방광, 척추를 슬라이드 방광과 전립선 아래가 위에 올려 고 한 컷. 모든 나머지 연결 (그림 2 h 와 2i) 복 부 구멍을 통해 잘라. 수 있는 전립선 조직을 통해 사고 절단을 피하기 위해 UGS에 너무 가까이 잘라 하지 않도록 주의 하십시오.
   참고: 아래는 UGS 컷 하면서,가 위 한다 삽입 마우스의 뒷면에 있는 모든 방법을 컷 스냅 뿐만 아니라 척추 열을. 이 메서드는 UGS와 마우스에서 조직을 추출 하는 데 필요한 시간을 단축 한 캡처에 복 부 구멍 사이 연결의 거의 모든 severing 발생 합니다.
8. UGS를 제거 하 고 2-6 mL (충분히 커버는 조직)에 인산 염 (PBS) 버퍼링 또는 Dulbecco의 6 cm 배양 접시 (2j 그림 및 2 k)에서 독수리 매체 (DMEM, 높은 포도 당)을 수정 하 고 해 부 현미경 (10 X로 이동 확대)입니다.
   참고: 나머지 단계에 필요한 해 미디어 변경 합니다.

2. 해 부 전립선

1. 한 쌍의 미세 집게와가 위 서 (그림 3a)와 등 쪽과 복 부 측면에서 모든 지방 선택을 취소 합니다. 비슷한 수술 도구를 사용 하 여 해 부 프로토콜의 나머지 부분에 대 한.
   참고: 지방 질은 종종 밀접 하 게 함께 짝을 이루고 UGS (흰색 스폰지 모양을 하 여 확인할 수 있습니다); 따라서,이 단계는 실수로 어떤 전립선 조직에서 캡처를 방지 하려면 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 그것은 모든 지방을 10-15 분까지 걸릴 수 있습니다.
2. 개최는 집게와 방광을 당겨 하 고가 위 (그림 3b) 기지에서 싹 둑.
3. 나머지 조직 복 부 측을 놓습니다. 하나의 ductus deferens 집게를 잡고가 위, 기지에 추적 그리고 그것 (그림 3c), 싹 둑 반대편에 반복. 지금 뒤에 남겨두고 전립선 (반투명 그리고 verminous), 정액 소포 ductus deferens 제거 (불투명 하 고 흰색, 반원형), 그리고 요도 (핑크 빨강과 불투명 튜브) (그림 3d 와 3e).
4. 정액 소포, 전립선 조직 앞쪽 돌출부의 내부 아치 사이 집게를 삽입 합니다. 놀 리 려는 떨어져 정액 소포, 전립선 필요한 (그림 3 층)으로 모든 결합 조직 싹 둑 하 고. 요도에 그들의 기지에 정액 소포를 추적 하 고 (그림 3 g 및 3 h) 그들을 제거. 수 그들을 찔린 하지 않도록 주의 하십시오.
5. 개별 전립선 엽 개 해 부를 진행 합니다.

3. 전립선 및 개별 엽 서 (수치 3i-n, 그림 4)의 심한 해부학

1. 그래서 그는 지 면을 위로, 나비의 날개를 닮은 등 돌출부를 보여주는 조직을 무딘 집게의 쌍을 가진 플립.
2. 엽 집게와가 위 (그림 3j) 기지에서 캡처를 하 여 등 돌출부를 수집 합니다.
3. 복 부 측에 나머지 조직에 플립.
4. 작은 측면 돌출부를 수집 하 고 일반적으로 포장 요도, 측면에는 앞쪽, 복 부, 고 등 돌출부 (그림 3 k) 사이 끼여 있다.
5. 다음, 수집 측면 돌출부 보다 큰 고 ventrally 요도에 누워 복 부 엽 (그림 3 l).
6. 마지막으로, 앞쪽 돌출부를 절단 하 고 요도 (그림 3 m)을 삭제 하 여 4의 가장 큰 수확.
7. 실험 요구 사항에 따라 조직 조각을 처리 합니다. 조직학, 대 한 제 4 또는 제 5 회전 타원 체 문화에 대 한 이동 합니다.

4. 엽 신분증과 Hematoxylin와 오신 스테인드 슬라이드 형태

1. 전립선 조직 수정 하 고 파라핀에 포함. 진행 되며와 오신 (H & E) 보고 올리베이라 외에 의해 설명 된 특성을 사용 하 여 조직학에 따라 전립선 돌출부에 차이 식별 하는 슬라이드를 얼룩. ¹² (그림 5).

5. 3D 문화¹⁰ 조직 처리

참고:이 그림 6에 요약.

1. 계속 실험 필요에 의하여 전체 전립선 또는 개별 돌출부를 경작 합니다. 전립선 조직 DMEM의 2-3 mL를 포함 하는 10 cm 접시에 전송. 메스와 함께 가늘게 및 해 부 현미경 아래 최대한 전립선 tubules를 말하다.
2. 무 균 조건 하에서 조직 문화 후드 나머지 단계를 계속 합니다.
3. 15 mL 튜브는 DMEM 함께 조직 조각을 전송 하 고 DMEM과 9 mL를 볼륨을 증가. DMEM 조직 혼합물을 혼합 하는 소용돌이 10 x 콜라 재고 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.
   참고: 콜라 재고 솔루션 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 10 mg/mL 이며 15 mL 튜브에 최종 농도 1 mg/mL 이다.
4. 선회 통에 튜브 또는 튜브는 세포 외 기질을 저하 콜라에 대 한 37 ° C에서 2 시간에 대 한 회전 합니다.
5. 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 튜브 원심
6. 삭제는 상쾌한 고 쪼개-셀 및 셀-매트릭스 유착을 따뜻한 0.05% 트립 신-EDTA의 2 mL에 resuspend. 5 분 동안 37 ° C에 튜브를 전송.
   참고: 조직 덩어리를 잘 섞어 너무 큰 경우에, 더 넓은 구멍을 면도날으로 피 펫 팁을 잘라.
7. 8-10 번, P1000 피 펫과 pipetting 다음 P200 피 펫을 반복 하 여 모든 조직 덩어리를 헤어.
8. 완전 한 DMEM의 3 mL와 트립 신을 무력화. 500 U DNAase의 추가 나 하 고 잘 혼합.
9. 통과 5 mL 주사기 5-10 회 18 G 바늘. 다음 통과 5 회 20 G 바늘으로.
10. 솔루션에는 여전히 큰 조직 덩어리 들어 있으면 4-8 단계를 한 번 더 반복 합니다.
11. 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 40 μ m 필터를 통해 필터링. DMEM의 5 mL와 함께 15 mL 튜브를 헹 구 고 동일한 필터를 통과. 린스를 반복 합니다.
12. 필터를 삭제 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 흐름 통해 포함 된 튜브 원심.

6. 도금 및 세포 배양

1. 완전 한 전립선 상피 세포 성장 매체 (PrEGM)의 0.5 mL에 펠 릿을 resuspend. 셀 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 밀도 계산 하 고 완전 한 PrEGM에⁵ 셀/mL 5 x 10을 셀을 희석.
   참고: 3 개월 마우스 전체 전립선에서 수익률 3 x 10⁵-10⁶ 세포에서 배열할 수 있다. 따라서, (듯이)에 원하는 셀 밀도, 낮은 수익률도 함께 얻을 수 있도록 더 이상 0.5 ml PrEGM의 펠 릿 처음 resuspend에 중요 하다.
2. 2:3 볼륨 비율 (60% 지하실 멤브레인 ECM 및 40% 세포 현 탁 액) 및 멀티 잘 플레이트 또는 실험적인 요구에 의하여 챔버 슬라이드 플레이트에 지하실 막 ECM으로 셀의 필요한 볼륨 믹스.
   참고: immunostaining, 접시 유리 하단 또는 챔버 슬라이드에 대 한 전체 잘 또는 우물의 중간 취재. 우물의 테두리 하십시오 결과 organoids를 계산 하는 경우 또는 더 높은 볼륨을 도금 하는 경우 잘 전면으로 몇 방울을 접시. 그것은 너무 두껍거나 너무 얇게 확산 되지 염두 됩니다. 행렬 셀의 지역; 도금의 1 c m² 당 적어도 100 µ L 플레이트 예를 들어 2cm²챔버 슬라이드에에서-잘 표면적, 5 x 10⁴ 의 세포를 포함 하는 행렬 셀 혼합물의 200 µ L를 도금 한다.
3. 접시/슬라이드 지하실 멤브레인 공고히 ECM에 대 일 분 동안 5% CO₂ 37 ° C 배양 기에 전송. 그런 다음, 지하실 멤브레인 ECM 플러그를 방해 하지 않도록 주의 복용 잘 커버를 미리 데워 진된 완전 한 PrEGM를 추가 합니다.
4. 미디어의 절반을 제거 하 고 2-3 일 마다 신선한 미디어를 추가. 5-10 일 동안 spheroids를 성장.
5. (7 단계), immunostaining (8 단계), 수확 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 이미지와 함께 진행 합니다.

7. 수확 분야

1. 분야를 수확, 지하실 멤브레인 ECM 젤 플러그를 방해 하지 않고 미디어를 신중 하 게 발음 하 고 지하실 멤브레인 ECM의 100 µ L 당 PrEGM에 1 mg/mL dispase 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.
   참고: 그것은 그들이 잘 또는 변죽 (전체 잘 다루는), 대신 중간에 도금 하는 경우 spheroids을 수확 하기가 dispase 솔루션의 적절 한 금액 우물에 추가 될 수 있도록.
2. Dispase PrEGM 솔루션으로 지하실 멤브레인 ECM 젤에서 리프트 셀 스 크레이 퍼와 접시의 바닥을 긁어.
3. 피펫은 넓은 한 번 아래로 전체 솔루션 1000 µ L 피 펫 팁 또는 작은 조각으로 젤 플러그 헤어 5 mL 피 펫을 낳았다.
   참고: 넓은 구멍 팁을 면도날으로 1000 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라.
4. 지하실 막 ECM 완전히 용 해 될 때까지 1-2 h 5% CO₂ 와 37 ° C 배양 기에서 품 어.
   참고:이 젤의 더 없는 덩어리 남아 확인 접시를 기울이기 동안 잘 바닥의 검사에 의해 보장 될 수 있다.
5. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.
6. 실 온에서 5 분 동안 250 x g에서 분야를 원심 고 다운스트림 응용 프로그램 계속 합니다.

8. 분야¹³ Immunostaining

참고: spheroids는 원하는 시간 동안 성장, 지하실 멤브레인 ECM 녹을 수 있다 고 Colicino 외 에 설명 된 대로 분야를 얼룩이 질 수 있다 ¹³.

1. 간단히, PBS와 문화를 씻어 하 고 지하실 멤브레인 ECM 젤 플러그에 직접 4 %paraformaldehyde (PFA)를 추가 합니다. 지하실 막 ECM 완전히 해산 신선한 PFA 마다 30 분 교체 될 때까지 느린 떨고와 실 온에서 30-90 분에 대 한 품 어.
   참고:는 PFA 젤 플러그를 녹이 고이 과정에서 spheroids를 수정 합니다.
2. 다음, PBS 3 번 세척 하 고 50 m m는 PFA에서 어떤 autofluorescence를 끄다 10 분에 대 한 염화 암모늄을 추가. PBS 가진 3 세척에 대 한 반복 합니다.
3. 5 분 및 PBSAT 블록에 대 한 0.1% 비 이온 세제로 permeabilize (PBS, 1 %BSA, 0.5% 트라이 톤 X-100) 30 분.
4. PBSAT와 실 온에서 2 h에 대 한 PBSAT에 이차 항 체 3 세척 다음 4 ° C에서 하룻밤 PBSAT에 1 차 항 체로 품 어.
5. 필요한 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 PBSAT와 세척 및 DAPI와 얼룩을 반복 합니다. PBS 가진 3 개 이상 번 씻는 다.
6. 200 m m 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] 옥 탄 (DABCO) antifade 시 약으로 PBS를 추가 하 고 영상 진행.

결과

마우스 전립선 엽 확인 될 수 있다 고 정액 소포 및 요도 위치를 사용 하 여 해 부. 마우스 전립선 4 쌍 dorsally 있는 돌출부의 ventrally 정액 소포 및 요도 구성 됩니다. 그림 4a 와 4b (맨 위) 그대로 전립선, 정액 소포 및 요도의 등 쪽과 복 부 뷰를 표시합니다. 하단 패널 (그림 4 c 및 4 d) 다른 엽 식별에 대 한...

토론

이 문서는 마우스 전립선의 해 부 및 개별 돌출부의 식별 방법을 설명합니다. 또한 생체 외에서 분석에 대 한 3 차원 문화에 마우스 전립선 세포 배양에 대 한 프로토콜이입니다.

해 부 프로토콜의 중요 한 단계가입니다 (1) 마우스에서 전체 UGS를 수확 하 고 분리 해 부 현미경 아래 개별 기관. 전립선 조직 이며 매우 작은 UGS;의 나머지 부분에 의해 둘러싸인 따라서, 그것?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C